Structural studies into ketosteroid dehydrogenases and S-selective -transaminases van Oosterwijk, Cornelis

Transcriptie

1 University of Groningen Structural studies into ketosteroid dehydrogenases and S-selective -transaminases van Oosterwijk, Cornelis IMPORTANT NOTE: You are advised to consult the publisher's version (publisher's PDF) if you wish to cite from it. Please check the document version below. Document Version Publisher's PDF, also known as Version of record Publication date: 2016 Link to publication in University of Groningen/UMCG research database Citation for published version (APA): van Oosterwijk, C. C. (2016). Structural studies into ketosteroid dehydrogenases and S-selective - transaminases [Groningen]: Rijksuniversiteit Groningen Copyright Other than for strictly personal use, it is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of the author(s) and/or copyright holder(s), unless the work is under an open content license (like Creative Commons). Take-down policy If you believe that this document breaches copyright please contact us providing details, and we will remove access to the work immediately and investigate your claim. Downloaded from the University of Groningen/UMCG research database (Pure): For technical reasons the number of authors shown on this cover page is limited to 10 maximum. Download date:

2 Nederlandse Samenvatting In dit proefschrift zijn de driedimensionale structuren van drie verschillende eiwitten onderzocht met behulp van röntgenkristallografie. Kennis van de eiwitstructuren wordt gecombineerd met biochemisch onderzoek om de details van het functioneren van de eiwitten te achterhalen. Zulke informatie kan gebruikt worden om de eiwitten te verbeteren of geschikt te maken voor geheel nieuwe toepassingen. Hierbij kan bijvoorbeeld gedacht worden aan de productie van zuivere chemicaliën of medicijnen. Voor een structuurbepaling van een eiwit met röntgenkristallografie moeten kristallen van het eiwit worden gemaakt en hiervoor zijn grote hoeveelheden gezuiverd eiwit nodig. Voor de eiwitproductie wordt meestal eerst het gen dat kodeert voor het eiwit geïsoleerd uit bijvoorbeeld een bacterie. Ook kan het gen zoals dat bijvoorbeeld aanwezig is in een digitale genoom sequentie gesynthetiseerd worden. Dit gen wordt dan ingebracht in een gastorganisme, vaak een bacterie zoals Escherichia coli, voor eiwitproductie. Zeer zuiver eiwit is nodig voor het maken van de kristallen, aangezien elke onzuiverheid in het eiwitmonster de kristallisatie kan verstoren. Daarom wordt het eiwit in meerdere stappen gezuiverd met behulp van verschillende scheidingsmethodes. Veel gebruikte methodes zijn ionenwisseling, gelfiltratie en His-tag chromatografie. Deze zuiveringen berusten op verschillende principes. Bij ionenwisseling binden de eiwitten aan de kolom op basis van hun verschillende lading en kunnen zo gescheiden worden. Gelfiltratie is een zuiveringsmethode die berust op de grootte van de eiwitten. Kleinere eiwitten blijven langer in de kolom en worden zo gescheiden van de grotere. Voor His-tag zuivering wordt er een speciaal label (zes extra histidine aminozuren) toegevoegd aan het eiwit. Dit label bindt aan het kolommateriaal, en hierdoor kan het eiwit gescheiden worden van de andere, niet gelabelde eiwitten in het monster. Het gezuiverde eiwit kan dan worden gebruikt voor kristallisatie experimenten. Hiervoor wordt er eerst een screening van veel verschillende condities opgezet met behulp van een kristallisatierobot. Hierbij wordt gezocht naar de juiste condities (buffer, ph, precipitant, additieven) om het eiwit te kristalliseren. Nadat geschikte kristallisatie condities zijn gevonden kunnen de kristallen worden gebruikt om er röntgenverstrooiingspatronen van te verzamelen. Voor zo n verstrooiingsexperiment wordt het eiwitkristal geïnstalleerd op een diffractometer en rondgedraaid in de röntgenstraal. Het verstrooiingspatroon 113

3 van het kristal (zie Figuur 5 - Hoofdstuk 2 voor een voorbeeld) wordt opgenomen in stapjes van, bijvoorbeeld, één graad van 0 tot 90. Uit de opgenomen verstrooiingspatronen kan met behulp van een computer de eiwitstructuur worden berekend. In een eiwitstructuur van goede kwaliteit zijn de meeste atomen van het eiwit zichtbaar en dit geeft een duidelijk beeld van het binnenste van het eiwit. Hoofdstuk 2 en 3 gaan over ketosteroïde dehydrogenases (KstDs). Dit zijn eiwitten die een dubbele binding introduceren in A ring van ketosteroïden (zie Figuur 3 - Hoofdstuk 1). Er zijn twee varianten van deze eiwitten. De Δ1-KstDs maken een dubbele binding tussen de C1 en C2 atomen van de A ring, en de Δ4-KstDs maken er één tussen de C4 en C5 atomen. Samen genereren ze ketosteroïden met twee dubbele bindingen die een belangrijke grondstof vormen voor de productie van steroïden met een biologische functie. Men kan hierbij bijvoorbeeld denken aan de vele steroïde gebaseerde medicijnen gebruikt in de behandeling van kanker, reuma, ontstekingen, astma en vele andere ziektes. Daarnaast zijn er ketosteroïde dehydrogenases betrokken bij de afbraak van sterolen, zoals cholesterol en galzuren, door bacteriën. Een goed gedocumenteerd voorbeeld hiervan is de afbraak van cholesterol door Mycobacterium tuberculosis. Deze bacterie kan, gedurende de latente fase, overleven in de witte bloedcellen van het afweersysteem van de mens en maakt hierbij waarschijnlijk gebruik van cholesterol uit de celmembranen van de witte bloedcel. In de afbraakroute die hiervoor verantwoordelijk is bevindt zich een Δ1-KstD. Hierdoor is nieuwe informatie over deze groep van enzymen en hun functie ook interessant voor het onderzoek naar tuberculose. Wij hebben de structuur opgehelderd van de Δ4-(5α)-KstD van Rhodococcus jostii RHA1 zowel met een leeg actief centrum als met het gebonden product van de reactie (4-androstene-3,17-dione). Deze structuren lieten zien welke de belangrijkste aminozuren zijn voor substraatbinding en voor het uitvoeren van de dehydrogeneringsreactie. Een serine aminozuur is cruciaal voor de reactie omdat het een proton kan opnemen van het steroïde en dus als base fungeert. Bovendien werden er ook twee belangrijke tyrosine residuen gevonden. Eén fungeert als zuur en de andere is belangrijk voor het overdragen van een proton dat vrij komt bij de reactie. De functies van deze aminozuren konden worden bevestigd via mutatie studies en activiteitsmetingen. 114

4 In hoofdstuk 4 presenteren we de driedimensionale structuren van twee verwante S-selectieve ω-transaminases. Transaminases zijn een groep eiwitten die in staat zijn om een keto groep (dubbel gebonden zuurstof) van een substraat te vervangen door een amino groep (stikstof), zie figuur 1 van hoofdstuk 4. Deze eiwitten zijn stereoselectief en ze kunnen de stikstofgroep op twee manieren aan het substraat bevestigen. Dit resulteert in producten die elkaars spiegelbeeld zijn. Twee soorten transaminases komen in de natuur voor, elk met zijn eigen enantioselectiviteit en vouwing, de (R)- en de (S)-selectieve transaminases. Deze eiwitten zijn interessant voor de industrie omdat ze een aminogroep kunnen introduceren in verbindingen die gebruikt worden in de productie van chemicaliën en medicijnen. Een aantal voorbeelden hiervan zijn bijvoorbeeld de productie van sitagliptin, een medicijn voor de behandeling van diabetes, en de productie van aromatische gehalogeneerde chirale amines die grondstoffen zijn voor medicatie tegen b.v. hyperparathyreoïdie. De ω-transaminases zijn een speciale klasse van de transaminases die reactief is op verbindingen met een hydrofobe zijgroep. Dit is in tegenstelling tot de veel voorkomende α-transaminases die hun reactie meestal uitvoeren op substraten met een carboxylaat groep zoals aminozuren. De kristalstructuren, gecombineerd met activiteitsmetingen aan veel verschillende substraten, laten zien hoe de eiwitten hun reactie uit kunnen voeren op zowel hydrofobe als geladen substraten, met behulp van een arginine schakelaar. De beide ω-transaminases vertonen verscheidene verschillen in hun activiteitsprofiel. Met behulp van de product gebonden structuur van één van de eiwitten kon hiervoor een verklaring voorgesteld worden. 115

5