Cover Page. The handle holds various files of this Leiden University dissertation.

Transcriptie

1 Cover Page The handle holds various files of this Leiden University dissertation. Author: Houben, Mathias Bernard (Thijs) Title: Regulation of behavioral activity by the suprachiasmatic nuclei Issue Date:

2 Samenvatting Dit proefschrift bestaat uit twee experimentele delen. In het eerste deel, bestaande uit hoofdstukken twee tot en met vijf, hebben we meerdaagse opnames gemaakt van de elektrische activiteit in de suprachiasmatische nuclei (SCN) van vrijbewegende muizen. Het doel van deze studies was om de mechanismen te onderzoeken waarmee de SCN de timing van gedragsactiviteit reguleren. In het tweede deel van dit proefschrift, bestaande uit hoofdstukken zes tot en met acht, hebben we onderzocht hoe verstoringen van circadiane ritmen samenhangen met ziekteontwikkeling in de context van psychiatrische aandoeningen, metabole stoornissen en chronisch nierfalen. In het eerste hoofdstuk van dit proefschrift wordt een korte introductie gegeven in het vakgebied van de chronobiologie en zijn ontwikkeling. Het fenomeen van endogene circadiane ritmen wordt geïntroduceerd, gevolgd door een beschrijving van de essentiële kenmerken van circadiane ritmen, waaronder de entrainment door licht en de gevoeligheid voor daglengte. Het basale mechanisme dat verantwoordelijk is voor genereren van circadiane ritmen is een moleculair feedback systeem dat zich in cellen bevindt en afhankelijk is van het accuraat functioneren van enkele essentiële klokgenen en de eiwitten waarvoor deze genen coderen. Zoogdieren bezitten twee gespecialiseerde hersenkernen in de hypothalamus, de suprachiasmatische nuclei (SCN) genaamd. In de neuronen van deze hersenkernen beïnvloedt de intracellulaire moleculaire klok de neuronale membraan, leidend tot circadiane ritmen in de elektrofysiologische eigenschappen van SCN neuronen met als gevolg dat de SCN cellen volgens een circadiaan ritme spontaan actiepotentialen genereren. Het circadiane patroon in elektrische activiteit en neurotransmitter-afgifte dat zodoende door de SCN wordt gegenereerd dient als klok-signaal voor de rest van het brein. Door deze klok-signalen af te stemmen op de input uit een directe verbinding met het oog kunnen de SCN ervoor zorgen dat een brede reeks fysiologische systemen steeds optimaal aangepast blijven aan de continue veranderingen in de omgeving die veroorzaakt worden door de 24-uurs cyclus van licht en donker. De neuronen in de SCN zijn met elkaar verbonden in een netwerk dat hen in staat stelt om hun individuele ritmen te coördineren en met elkaar te synchroniseren en zodoende de rest van het brein van een robuust tijd-signaal te voorzien. Via diverse verbindingen met andere hersenkernen en perifere organen coördineren de SCN circadiane ritmen in vele fysiologische, gedragsmatige en metabole parameters, hetgeen aannemelijk maakt dat verstoring van dit centrale klok-signaal tot ziekte kan leiden. In hoofdstuk twee hebben we onderzocht hoe dieren de timing en duur van hun gedragsactiviteit aanpassen aan de seizoenen door ze bloot te stellen aan kunstmatige zomerdagen (16 uur licht, afgewisseld met 8 uur duisternis) en aan kunstmatige 201

3 winterdagen (8 uur licht en 16 uur duisternis). Door het neuronale activiteitspatroon in de SCN in vivo en in vitro te meten konden we aantonen dat de duur van de dagelijkse piek in populatie-activiteit breed wordt in zomerdagen en smal wordt in winterdagen, terwijl de piekduur van individuele neuronen niet verandert. Een analyse van de verdeling van de activiteitspieken van kleine subpopulaties en individuele neuronen over de dag toonde aan dat de verbreding van de populatie piek veroorzaakt wordt door veranderingen in de tijdstippen waarop individuele neuronen actief zijn. In korte winterdagen zijn de activiteitspieken van individuele SCN neuronen sterk gesynchroniseerd binnen de korte licht periode en is de resulterende populatiepiek dus smal. In lange zomerdagen zijn de activiteitspieken van individuele neuronen meer verspreid over de licht periode, met een bredere populatiepiek als resultaat. We concluderen uit deze resultaten dat het coderen van daglengte-informatie in de SCN een emergente eigenschap van het neuronale netwerk is die niet kan worden uitgevoerd door individuele neuronen. In hoofdstuk drie onderzochten we met behulp van langdurige simultane metingen van gedragsactiviteit en neuronale activiteit in de SCN hoe het neuronale activiteits niveau in de SCN zich verhoudt tot de timing van de overgangen tussen de dagelijkse slaap- en waak fases. Het niveau van neuronale activiteit in de SCN fluctueert met een 24 uurs ritme en is hoog gedurende de dag. Tegen het einde van dag begint de neuronale activiteit af te nemen totdat een laag dal-niveau wordt bereikt aan het begin van de nacht, vanwaar het weer zal gaan stijgen gedurende het eind van de nacht en de vroege ochtend. Dit circadiane ritme in elektrische activiteit wordt doorgegeven aan andere hersenkernen en veroorzaakt een tweedeling van gedragsactiviteit in een actieve (waak-) en een inactieve (slaap-) fase. De opnames van neuronale activiteit werden gemaakt in vrij bewegende muizen met behulp van geïmplanteerde micro-elektroden. Op de resulterende dataset is een gedetailleerde analyse uitgevoerd van het neuronale activiteitsniveau in de SCN op het tijdstip dat dieren in slaap vielen en op het tijdstip dat dieren ontwaakten. Het resultaat was dat zowel de start van de actieve fase als de start van de rustfase plaatsvinden op het moment dat het neuronale activiteitsniveau in de SCN vlakbij het half-maximum is, oftewel halverwege het piek-niveau tijdens de dag en het dal-niveau tijdens de nacht. De relatie tussen de wisselingen in gedrags-fase en het neuronale activiteits niveau in de SCN kon worden beschreven door een waarschijnlijkheids-functie. We hebben ook bestudeerd of het neuronale activiteits niveau tijdens ontwaken of in slaap vallen verandert als dieren worden blootgesteld aan korte winterdagen of lange zomerdagen maar vonden dat de dieren in beide daglengtes ontwaakten en in slaap vielen op het moment dat de elektrische activiteit in de SCN het half-maximum bereikt. Verder vonden we ook dat de golfvorm van SCN activiteit in de muis niet symmetrisch is: in alle daglengtes verloopt de daling van neuronale activiteit in de avond beduidend sneller dan de stijging van neuronale 202

4 activiteit in de ochtend. We concluderen dat de relatie tussen neuronale activiteit in de SCN en de tijdstippen waarop dieren hun waak- en slaapfases starten en beëindigen opmerkelijk ongevoelig is voor omgevingsveranderingen en dat drempelveranderingen niet bijdragen aan het coderen voor daglengte. In hoofdstuk vier hebben we de modulerende effecten van gedragsactiviteit op de neuronale activiteitspatronen in de SCN onderzocht. Het was bekend dat de elektrische activiteit in de SCN beïnvloed kan worden door licht, slaap en door gedragsactiviteit. Terwijl de effecten van licht en slaap op SCN activiteit systematisch zijn onderzocht is niet bekend in welke mate gedrag de neuronale activiteit in de SCN kan veranderen en wat de functie is van het effect van gedrag op de SCN. Om dit te onderzoeken hebben we met behulp van geïmplanteerde micro-elektroden simultane opnames gemaakt van elektrische activiteit in de SCN en algemene bewegingsactiviteit. Ook hebben we video-opnames van de dieren gemaakt om de effecten van specifieke gedragstypes op SCN activiteit te kunnen bepalen. De resultaten lieten zien dat neuronale activiteit in de SCN onderdrukt wordt door spontane gedragsactiviteit. De mate van onderdrukking hing af van de intensiteit, de duur en het type van gedrag. De onderdrukking was matig (ongeveer 30% van de circadiane amplitude) voor laagintensief gedrag en sterk (ongeveer 60% van de circadiane amplitude) voor loopgedrag. Wanneer gedragsactiviteit werd geïnduceerd door milde verstoring van het dier terwijl het inactief was werd de neuronale activiteit in de SCN juist versterkt in plaats van onderdrukt. Deze observatie vormt een aanwijzing dat verschillende mechanismen zijn betrokken bij de modulerende effecten van spontaan versus geïnduceerd gedrag op SCN neuronale activiteit. Aangezien de meeste spontane gedragsactiviteit tijdens de nacht plaatsvindt vormen de resultaten een aanwijzing dat lichamelijke activiteit op het juiste tijdstip de amplitude van het neuronale activiteitsritme van de SCN kan versterken. In hoofdstuk vijf onderzoeken we of het neuronale activiteitsniveau in de SCN ook betrokken is bij het reguleren van het niveau van gedragsactiviteit tijdens de waakfase. We hebben deze hypothese getest door dieren bloot te stellen aan licht-donker cycli met een verkorte duur (22 uren), met een normale duur (24 uren) of met een verlengde duur (26 uren). We vonden dat aanpassing aan verkorte licht-donker cycli een late timing van gedragsactiviteit tot gevolg had, waarbij dieren hun actieve periode pas enkele uren na het begin van de nacht startten en de hoogst activiteitsniveaus in de tweede helft van de nacht lieten zien. In de verlengde lichtdonker cycli hadden de dieren juist een vroege timing van hun gedragsactiviteit met de start van de actieve periode aan het begin van (of vlak voor) de nacht en de hoogste activiteitsniveaus tijdens de eerste uren van de nacht. Hoewel de golfvorm van het SCN neuronale activiteitspatroon net als het tijdspatroon van gedragsactiviteit heel verschillend was tussen de verkorte licht-donker cycli en de verlengde licht-donker 203

5 cycli was de relatie tussen het elektrische activiteitsniveau in de SCN en de intensiteit van het gedrag identiek in alle geteste licht-donker cycli. Deze data laten zien dan het neuronale activiteitsniveau in de SCN rechtstreeks het niveau van gedragsactiviteit reflecteert, hetgeen suggereert dat de SCN een actieve rol speelt in het reguleren van het niveau van gedragsactiviteit gedurende de actieve fase. Een belangrijke implicatie van deze resultaten is dat het circadiane ritme dat door de SCN wordt geproduceerd niet alleen een rol speelt bij de timing van gedragsritmes maar ook bij het reguleren van de amplitude van deze ritmes. In hoofdstuk 6 onderzochten we de relatie tussen het circadiane systeem en het mesolimbische belonings-systeem. Bij dit mesolimbische beloningssysteem zijn verschillende subcorticale hersenregios betrokken die onderling verbonden zijn via dopaminerge verbindingen die geactiveerd worden door belonende stimuli zoals voedsel, sex en verslavende middelen. Verstoringen van circadiane ritmen zijn zijn waargenomen bij verschillende vormen van depressie waarbij het dopamine metabolisme in het mesolimbische systeem ook is veranderd. Deze associatie tussen circadiane ritmes en de mentale gemoedstoestand doet vermoeden dat het circadiane en het belonings-systeem in de hersenen elkaars functioneren kunnen beïnvloeden. Belonende prikkels zoals voedsel, sex en verslavende substanties beïnvloeden de afgifte van dopamine in de hersenkeren van het mesolimbische systeem waaronder het ventrale tegmentum (VTA) en de Nucleus Accumbens (NAc). Om een moleculaire verbinding tussen de mechanismen van de circadiane klok en het dopamine metabolisme vast te stellen hebben we de promotor regio s van genen onderzocht die een belangrijke rol spelen bij het reguleren van dopamine niveaus. We vonden dat de transcriptie van het monoamine oxidase A (Maoa) gen gereguleerd wordt door de klok componenten BMAL1, NPAS2, en PER2. Vervolgens lieten we zien dat een mutatie in het klokgen Per2 in muizen leidt tot afname in expressie en activiteit van MAOA in het mesolimbische systeem, met verhoogde dopamine-niveaus tot gevolg. Met behulp van elektrofysiologische metingen in de nucleus accumbens van vrijbewegende Per2 mutante en wildtype muizen konden we laten zien dat de neuronale responsen op dopaminerge anti-depressiva verandert zijn in Per2 mutante muizen, wat de gedragsveranderingen verklaart die we hadden waargenomen in gedragstesten gericht op het beloningssysteem. We konden concluderen dat componenten van de biologische klok op moleculair niveau interacteren met de dopamine-huishouding in het mesolimbische systeem. Deze bevindingen maken het aannemelijk dat verstoringen van circadiane ritmen een rol spelen bij de pathofysiologische mechanismen die ten grondslag liggen aan dopamine-gerelateerde psychiatrische aandoeningen waaronder depressie, bipolaire stoornissen en de aandachtsstoornis ADHD. 204

6 Zowel epidemiologische onderzoeken in ploegendienstarbeiders als functionele studies in muismodellen met klokgen-defecten laten zien dat verstoringen van het circadiane systeem mogelijk kunnen bijdragen aan het ontstaan van overgewicht en metabole stoornissen zoals type 2 diabetes mellitus. In hoofdstuk zeven hebben we het belang getest van de amplitude van SCN output voor de metabolisme-regulatie door muizen gedurende 5 weken bloot te stellen aan een normale licht-donker cyclus of gedurende 5 weken aan een continue verlichtte omgeving. Een deel van de muizen werd bovendien metabool belast door ze een hoog-vet dieet te geven. Met behulp van elektrofysiologische opnames van elektrische activiteit in de SCN konden we laten zien dat blootstelling aan continue licht leidt tot een amplitude reductie van het neuronale activiteitsritme van 55% in vergelijking met dieren op een normale lichtdonker cyclus. Met behulp van metabole kooien hebben we het metabolisme vergeleken tussen muizen in continue licht en muizen in de normale licht-donker cyclus waarbij we waar hebben genomen dat de voedsel-inname was toegenomen (+26%) in continue licht terwijl het energieverbruik was afgenomen (-13%). Verder zagen we ook dat continue licht een onmiddellijke toename van lichaamsgewicht tot gevolg had (+ 2.4% op dag 4, +5.0% op dag 14). Een mixed model analyse liet zien gewichtstoename sneller optrad in respons op continue licht dan in respons op het hoog-vet dieet. Na 4 weken in continue licht was de gewichtstoename gestabiliseerd en waren de circadiane patronen in voedselinname en energieverbruik compleet verdwenen hoewel er nog steeds ritmes met een lage amplitude in de SCN en in het gedrag waren. Een hyperinsulinemische-euglycemische clamp analyse liet zien dat de normale circadiane variatie in insuline-gevoeligheid volledig was verdwenen in continue licht. Uit deze resultaten hebben we kunnen concluderen dat een amplitudereductie van het SCN ritme, tot waarden die eerder alleen waargenomen waren in verouderde muizen, afdoende is om de circadiane ritmes in energie metabolisme en insuline-gevoeligheid volledig te doen verdwijnen. Terwijl hoofdstukken zes en zeven de nadelige gezondsheidseffecten van verstoringen van de circadiane klok onderzoeken, wordt dit vraagstuk in hoofdstuk acht omgekeerd in een studie naar de vraag of een verstoorde nierfunctie nadelige effecten heeft op de werking van het circadiane systeem. We hebben deze vraag onderzocht door in continue donker het circadiane gedragsritme te meten in een muismodel voor chronisch nierfalen (CNF). In deze muizen werden de nieren permanent beschadigd met een chirurgische ingreep die significant verhoogde ureum-waardes in het serum en bloedarmoede ten gevolg had in de CNF-muizen ten opzichte van shamgeopereerde muizen. De gedragsactiviteit van de CNF-muizen en de shamgeopereerde muizen werd continue geregistreerd gedurende een periode van 12 weken na de operatie. Ondanks de ernstig verstoorde nierfunctie bleef het circadiane patroon van gedragsactiviteit in de CNF-muizen sterk ritmisch. Zowel de sterkte als de periode 205

7 van het ritme was niet significant veranderd in de CNF-muizen ten opzichte van de sham-geopereerde muizen. We concluderen uit deze resultaten dat uremische toxines het circadiane systeem niet verstoren. In hoofdstuk negen worden de resultaten van hoofdstukken twee tot en met acht bediscussieerd in de context van de huidige kennis over circadiane ritmes en hun rol in gezondheid en ziekte. Ik bespreek hoe de resultaten van hoofdstukken twee tot en met vijf een nieuw licht werpen op de rol van de SCN in het reguleren van 24-uurs ritmes in gedrag en hoe ze een voorheen onbekende wederzijdse interactie laten zien tussen de SCN en hersengebieden die gedrag reguleren. Ook worden, aan de hand van een vergelijking met een potentieel alternatief mechanisme, de mogelijke voordelen voor het registreren van de voortgang van de tijd besproken van de waargenomen mechanismen voor het coderen van daglengte. In een volgende paragraaf wordt de toepasbaarheid van de resultaten die gevonden zijn in nacht-actieve muizen voor dagactieve zoogdieren besproken, leidend tot enkele voorspellingen voor de relatie tussen het niveau van gedragsactiviteit en de neuronale activiteit in de SCN van dag-actieve zoogdieren. Aangezien veroudering een vergelijkbaar effect heeft op de duur van de slaap- en waak periode als blootstelling aan lange daglengtes, maar een verschillend effect op de amplitude en precisie van gedragsritmes, bespreken we de overeenkomsten en verschillen in het licht van de onderliggende effecten van veroudering en lange daglengte op het functioneren van de SCN. Voor zowel het dopaminerge beloningssysteem als voor de mechanismen die het metabolisme reguleren zijn er diverse wederkerige verbindingen gevonden, zowel tussen deze systemen en de SCN als tussen deze systemen onderling. De aanwezigheid van deze sterke en wederkerige verbindingen ligt waarschijnlijk ten grondslag aan de duidelijke verbanden tussen circadiane ritme verstoring en de ontwikkeling van ziekte. Het laatste deel van hoofdstuk negen bespreekt de concepten en resultaten van dit proefschrift in de context van de opkomende stromingen in de wetenschappelijke gemeenschap om nieuwe conceptuele structuren en aanpakken te ontwikkelen om de emergente eigenschappen van complexe biologische systemen en netwerken te onderzoeken die niet afdoende onderzocht en begrepen kunnen worden binnen de conceptuele structuur en aanpak van het bestaande reductionistische paradigma. 206