Bachelorproef:Opsporen van Clostridium difficile. 3 e jaar Bachelor Biomedische Laboratoriumtechnologie. Marieke Verbelen.

Transcriptie

1 Bachelorproef:Opsporen van Clostridium difficile 3 e jaar Bachelor Biomedische Laboratoriumtechnologie Marieke Verbelen Semester 2 Departement GEZ-LA

2

3 VOORWOORD Via deze weg wil ik in het bijzonder Apr. Biol. J. Beckers bedanken voor de goede begeleiding gedurende mijn eindwerk. Dankzij zijn suggesties en aanwijzingen was het mogelijk om dit eindwerk te maken. Ook Rita De Proft wil ik bedanken voor de kans om veel bij te leren in haar team van laboranten. Ten tweede wil ik graag al de laboranten bedanken voor hun goede begeleiding en uitleg gedurende de stage. Zonder hen zou ik niet de nodige ervaring hebben gehad om dit eindwerk te maken. Ten slotte bedank ik mijn ouders voor de financiële en mentale steun gedurende mijn studie. I

4 ORGANIGRAM Algemene vergadering Raad van bestuur Algemene directie Directeur verpleging Hoofdgeneesheer Laboratoriumdirecteur Medewerker veiligheid en hygiëne Kwaliteitsveranwoordelijke Kwaliteitsmedewerker Klinisch Bioloog Laboratoriumkwaliteitscoördinator Kwaliteitsmedewerker MLT Specialisten klinische biologie Specialist Nucleaire geneesk. Hoofdlaborant Medewerker Hoofdlaborant MLT Administratie Secretariaat Logistiek II

5 INHOUD VOORWOORD... I ORGANIGRAM... II 1 Lijst van afkortingen Samenvatting Abstract Inleiding Literatuurstudie Symptomen & klinisch beeld Risicofactoren Behandeling Preventie en controle Materiaal en methoden Stalen Het VIDAS toestel voor de immunoassays Opsporen van Clostridium difficile Toxines Glutamaatdehydrogenase Polymerase ketting reactie Kweek Resultaten Clostridium difficile GDH als vervanging voor Clostridium difficile toxine A en B Clostridium diffile GDH als vervanging voor Clostridium difficile kweek Vereenvoudigen van de procedure Werkwijze protocol 1 (extra 1) Werkwijze protocol 2 (extra 2) Werkwijze protocol 3 (origineel) Resultaten Kwaliteitscontrole Level Level Discussie Besluit Referenties Bijlagen III

6 1 Lijst van afkortingen 1. CDAB: Clostridium difficile toxine A en B 2. CDAC: Clostridium difficile-associated colitis 3. CDAD: Clostridium difficile-associated diarrhea 4. C. difficile : Clostridium difficile 5. ELISA: enzyme-linked immunosorbent assay 6. GDH: glutamaatdehydrogenase 7. IBD: inflammatory bowel disease 8. VIDAS: Vitek Immuno Diagnostic Assay System 1

7 2 Samenvatting Sinds de jaren zijn er vele uitbraken geweest van Clostridium difficile infecties. Deze vonden voornamelijk plaats in ziekenhuizen. Clostridium difficile is een anaërobe sporevormende bacterie. De sporen kunnen echter ook overleven in aëroob milieu. Oppervlakken kunnen besmet raken met sporen, deze zijn niet te verwijderen met de gewone kuisproducten. Indien een verzwakt persoon in contact komt met het besmette oppervlak, kan hij/zij geïnfecteerd raken. Clostridium difficile zorgt pas voor problemen wanneer de normale darmflora verstoord wordt. De aanwezigheid van Clostridium difficile in faeces duidt niet meteen op een infectie. Er is pas sprake van een infectie wanneer de bacterie toxines produceert. Deze toxines zijn toxine A en/of B. In het AZ Sint-Blasius wordt voor het opsporen van de aanwezigheid van Clostridium difficile in faeces gebruik gemaakt van een kweek in combinatie met een immunoassay. Wanneer na 48 uur verdachte kolonies waar te nemen zijn op de kweek, moet een sneltest gedaan worden met de Clostridium difficile Quik Chek Complete. Deze sneltest zal aantonen of er toxines aanwezig zijn. Toxine A en B kunnen ook op een andere manier opgespoord worden, namelijk rechtstreeks op faeces met de Clostridium difficile toxine A en B kit, een enzym gebonden immunoassay (sandwich ELISA). Om de tijd tot het uiteindelijke resultaat te reduceren en een grotere sensitiviteit te bereiken werd in deze bachelorproef nagegaan of een andere enzym gebonden immunoassay, de Clostridium difficile GDH kit, als vervanging kan dienen van de kweek of van de Clostridium difficile toxine A en B test. Met deze immunoassay wordt nagegaan of glutamaatdehydrogenase aanwezig is, een enzym dat door elke Clostridium difficile bacterie geproduceerd wordt. Positieve stalen voor Clostridium difficile werden door verschillende microbiologische labo s ingevroren en opgestuurd voor het uitvoeren van de evaluatie. Van elk staal werd niet enkel een kweek ingezet, maar het werd ook onderworpen aan een Clostridium difficile GDH en toxine A en B test. Omdat er naar een zo efficiënt mogelijke manier van werken wordt gezocht, werden 3 verschillende werkwijzen getest. Uit de resultaten van de analyses is gebleken dat de Clostridium difficile GDH test niet als vervanging van de Clostridium difficile toxine A en B test kan gebruikt worden, maar eventueel wel van de kweek mits bijkomend onderzoek. Dit omdat een negatief resultaat voor de GDH test ook steeds negatief is voor de kweek, terwijl de Clostridium difficile toxine A en B test bij een positief resultaat voor GDH nog steeds moet gebruikt worden om eventuele toxines op te sporen. De meest correcte werkwijze blijft het originele protocol dat door BioMérieux opgesteld werd, maar door de beperkte beschikbaarheid van het VIDAS toestel kan voor het AZ Sint-Blasius nog niet overgegaan worden naar een nieuwe werkwijze voor het opsporen van Clostridium difficile. 2

8 3 Abstract From 1980 onwards, there have been multiple outbreaks of Clostridium difficile infections. These were mainly encountered in hospitals. Clostridium difficile is an anaerobic spore forming bacteria. The spores can, however, also survive in aerobic conditions. Surfaces can be contaminated with spores, which cannot be removed by making use of traditional cleaning products. In case an impaired person gets into contact with a contaminated surface, he or she can easily be infected. It should be added that Clostridium difficile only causes problems when the normal intestinal flora are disturbed. The presence of the bacteria in feces is not a direct indication of the infection, as therefore the bacteria needs to produce its toxins. The AZ Sint-Blasius makes use of a bacterial culture combined with an immuno-assay to detect the presence of Clostridium difficile in feces. In case suspect colonies are observed in the cultures, an accelerated assay is performed by making use of the Clostridium difficile Quik Chek Complete. This assay will indicate whether toxins are present. Toxin A and B can also be determined by directly examining the feces with the Clostridium difficile toxin A en B kit. The latter is an enzyme-linked immunoassay (sandwich ELISA). With the aim of reducing the time span to obtain the final result and to increase the sensitivity of the detection, it was investigated whether another enzyme-linked immuno-assay, the Clostridium difficile GDH kit, could be used as replacement of the culture or the Clostridium difficile toxin A en B kit. This second immune-assay is based on the detection of glutamate dehydrogenase, an enzyme that is commonly produced by every Clostridium difficile bacteria. Clostridium difficile positive samples were frozen by different microbiological laboratories and sent to the AZ St.-Blasius for evaluation. Each of the samples was brought into culture and subjected to a Clostridium difficile GDH and toxin A en B assay. The results of our study revealed that the Clostridium difficile GDH could not be readily used as a replacement of the toxin A en B assay, but potentially as a replacement for the culture, provided that some additional research is performed. Indeed, samples that tested negative for the GDH assay systematically tested negative in culture, but in case a sample showed to be positive in the GDH assay, further toxin A en B Clostridium difficile testing was still required to confirm this result. It can be concluded that the most adequate method remained the original protocol developed by BioMérieux. Because of the restricted availability of the VIDAS apparatus, the AZ St.-Blasius currently cannot perform the transition to any new procedure for the detection of Clostridium difficile. 3

9 5 Inleiding Sinds de jaren zijn er uitbraken geweest van Clostridium difficile. Aangezien dit voornamelijk in ziekenhuizen voorkwam, werd er gevreesd voor een nieuwe ziekenhuisbacterie. Clostridium difficile is makkelijk overdraagbaar en dient dus snel opgespoord te worden zodanig dat maatregelen kunnen getroffen worden om verspreiding tegen te gaan. De bacterie kan op verschillende manieren opgespoord worden, onder andere door specifieke immunoassays, PCR-analyse en bacteriële kweken. Elk ziekenhuis hanteert zijn eigen combinatie van technieken. Zo maakt het AZ Sint-Blasius momenteel gebruik van de kweek en de zogenaamde Clostridium Toxine A and B (CDAB) immunoassay. Het doel van het eindwerk is om te onderzoeken of de Clostridium difficile glutamaatdehydrogenase (GDH) test zou kunnen gebruikt worden ter vervanging van de cultuur en/of de CDAB test. Deze nieuwe test spoort, zoals de naam het zegt, GDH op, een enzyme dat door elke Clostridium difficile bacterie geproduceerd wordt. De aanwezigheid van GDH duidt echter enkel op de aanwezigheid van Clostridium difficile in de faeces. Een positief resultaat met deze test wil bijgevolg niet zeggen dat de patiënt lijdt aan een Clostridium difficile infectie. Er kan pas gesproken worden van een infectie wanneer de bacterie zijn toxines produceert. Voor het opsporen van de toxines wordt de Clostridium difficile toxine A en B test gebruikt. Indien deze test positief is, kan wel van een Clostridium difficile infectie gesproken worden. 4

10 6 Literatuurstudie Het aantal infecties met Clostridium difficile is sterk toegenomen sinds het jaar 2000 omdat meer en meer resistente stammen ontstaan zijn. Clostridium difficile is één van de hoofdoorzaken van sterfte bij patiënten die lijden aan IBD (inflammatory bowel disease) (LaMont 2013a). Clostridium difficile is een gram-positieve, anaërobe en sporevormende bacil. Ze is aan te tonen in de stoelgang van 9% van de volwassenen en bij vele pasgeborenen (AZ Sint-Lucas 2014). Clostridium difficile kan toxisch of nontoxisch zijn. Toxigene stammen produceren een enterotoxine (toxine A) en een cytotoxine (toxine B). De toxines kunnen vrijgelaten worden omdat de bacterie onder stress komt te staan door het gebruik van antibiotica (LaMont, 2013a). Intracellulair zorgen toxines A en B voor een inactivatie van verschillende pathways, wat leidt tot celretractie en apoptose. Ze verstoren beide ook intercellulaire tight juncties (Riegler et al, 1995). Toxine A zorgt voor de infectie die leidt tot de afscheiding van intestinaal vocht, mucosale wonden en mucosale neveninfecties. De aanwezigheid van toxine A activeert de neutrofielen (Riegler et al, 1995). Toxine B is essentieel voor de virulentie van Clostridium difficile en is 10 maal meer potent dan toxine A. Een stam die enkel toxine B heeft is dus even virulent als een stam met beide toxines aanwezig. De kolonisatie van nontoxigene stammen zorgt voor bescherming tegen kolonisatie van een toxigene stam. De stam zorgt immers voor de bezetting van de microbiële niche waardoor dit zorgt voor bescherming tegen infectie met een nieuwe Clostridium difficile stam (Riegler et al, 1995). In normale omstandigheden voorkomt de normale darmflora kolonisatie van pathogene organismen. Wanneer deze darmflora echter verstoord wordt door bijvoorbeeld antibiotica kan Clostridium difficile overmatig groeien. Hierdoor is de bacterie vaak de oorzaak van antibiotica geassocieerde pseudomembraneuze colitis (LaMont, 2013b). Patiënten die geïnfecteerd zijn met Clostridium difficile zijn besmettelijk. Omdat de bacterie aanwezig is in faeces is de kans op besmetting via oppervlakken en voorwerpen groot. De sporen die gevormd worden kunnen tot maanden overleven, indien niet met aangepaste kuisproducten wordt gewerkt. Wanneer een persoon met een verzwakt immuunsysteem in aanraking komt met het besmette oppervlak, kan deze persoon snel geïnfecteerd raken. Handschoenen, kledij en stethoscopen van ziekenhuispersoneel zijn enkele voorbeelden van typische besmettingshaarden (LaMont, 2013a). Er wordt gesproken van twee vormen van de infectie. De eerste is de zogenaamde Healthcareassociated Clostridium difficile ; deze komt veel voor omdat de verspreiding in een ziekenhuis makkelijk gebeurt. De patiënt kan contact hebben met personeel dat gecontamineerde handen heeft door het verzorgen van een met Clostridium difficile besmette patiënt. Ook de omgeving kan gecontamineerd zijn door de recente aanwezigheid van een besmette patiënt in de ruimte. Direct contact met een besmette patiënt kan ook leiden tot infectie (LaMont, 2013a). 5

11 Er bestaat ook community-associated Clostridium difficile. Zoals de naam reeds vermeldt, gaat het hier om infecties waarbij de oorzaak geassocieerd wordt met de gemeenschap, dus via persoonlijk contact buiten het ziekenhuis. Hierbij is het opvallend dat de patiënten jonger zijn en vaak geen antibiotica nemen (Kim et al., 1981) 6.1 Symptomen & klinisch beeld Tijdens het onderzoek bij de dokter wordt gevoeligheid in de onderbuik ondervonden. De patiënt heeft doorgaans volgende klachten: Diarree (minimum 6 ongevormde faeces/dag) Buikkrampen Koorts (>38,5 C bij CDAD) Leukocytose Wanneer een dokter een endoscopisch onderzoek uitvoert, kunnen een ulcus en plaquesvorming in de colon ontdekt worden tengevolge van een infectie met Clostridium difficile. Diarree en inflammatie worden veroorzaakt door de productie van exotoxines die binden aan receptoren op intestinale epitheelcellen (LaMont 2013a). Clostridium difficile infectie kan onder verschillende vormen voorkomen, telkens gepaard gaande met een verschillende klinisch beeld (LaMont 2013a): CDAD of C. difficile- associated diarrhea komt voornamelijk voor in ziekenhuizen. Diarree komt meestal na 48 tot 72h na infectie voor. Dit gaat gepaard met hevige buikpijn en krampen. Er kunnen zeker 10 tot 15 stoelgangen gevormd worden per dag. Door dit hoge aantal kan dit leiden tot verandering in de elektrolyten en waterbalans, waardoor kans op sterfte groter is. CDAC of C. difficile-associated colitis kent gelijkaardige symptomen als CDAD, maar hierbij is er ook sprake van leukocytose. Dehydratatie wordt regelmatig waargenomen, alsook bloed in de faeces. Met behulp van een colonoscopie kunnen in een vroeg stadium reeds veranderingen in de darmwand gedecteerd worden, zoals bijvoorbeeld een bloeding bij het raken van de darmwand. Pseudomembraneuze colitis is de meest bekende C. difficile infectie. Tijdens endoscopie zijn hier de karakteristieke plaque vormingen waar te nemen. De plaques stimuleren de vrijlating van serum proteïnen, mucus en inflammatoire cellen. Wanneer er in een biopsie lymfocyten worden teruggevonden kan de patiënt onderverdeeld worden in een klasse die de ernst aantoont. 10 tot 25% van de patiënten die genezen zijn van de infectie, hervallen. Een andere mogelijkheid is dat de patiënt helemaal geen symptomen heeft, maar wel drager is. Deze patiënten ondervinden zelf geen last, maar kunnen andere patiënten besmetten (LaMont, 2013b). 6

12 Volgende percentages geven weer dat hospitalisatie een belangrijke risicofactor is voor infectie; (Miller, 2013) 20 tot 50% van de volwassenen die voor langere tijd in het ziekenhuis verblijven, zijn drager van Clostridium difficile 20% van de mensen die geen Clostridium difficile in hun faeces hadden, worden geïnfecteerd tijdens hun hospitalisatie 6.2 Risicofactoren Het risico op besmetting met Clostridium difficile en het verkrijgen van de Clostridium difficile infectie is afhankelijk van enkele factoren, zoals (Loo et al, 2011): Antibiotica: verstoren de normale darmflora. De meest voorkomende zijn: fluoroquinolones, clindamycine en breed spectrum penicillines en cephalosporines. Het gebruik van clindamycine veroorzaakte in de jaren 90 grote uitbraken. Hospitalisatie: In het ziekenhuis is de kans op besmetting met Clostridium difficile veel groter. De kamers dienen grondig gekuist te worden. Leeftijd: oudere leeftijd blijkt een risicofactor te zijn; waarom is echter niet zeker. Het zijn waarschijnlijk meerdere factoren samen die zorgen voor het risico. Oudere mensen hebben meer kans op hospitalisatie en antibiotica gebruik. Deze personen zijn +65 jaar. Mensen die ziek zijn, hebben een zwakker immuunsysteem. Ze hebben ook meer kans om antibiotica te nemen. Kankerpatiënten onder chemotherapie: deze mensen hebben een zwakker immuunsysteem door de chemotherapie. Patiënten met verminderde productie van maagzuur. Patiënten met een gastro-intestinale operatie achter de rug: hun normale darmflora kan hierdoor verstoord zijn (Loo et al, 2011) 6.3 Behandeling Clostridium difficile infections of CDI s kunnen in drie categorieën opgedeeld worden. Er kan sprake zijn van een milde CDI, een ernstige CDI en een acute CDI; bij deze laatste is een operatie vereist. Indien er sprake is van milde CDI (Clostridium difficile infection), waarbij duidelijk is dat die ontstaan is door het gebruik van antibiotica, wordt er gestopt met de desbetreffende antibiotica. Metronidazole is vervolgens het eerste specifieke antibioticum dat toegediend wordt voor niet ernstige CDI. Wanneer er sprake is van een ernstigere en meer gecompliceerde CDI, wordt doorgaans vancomycine toegediend. Ook enterol kan toegediend worden om de normale darmflora te herstellen. Het toedienen van medicatie intraveneus heeft geen effect omdat deze een slechte penetratie van het gastro intestinale stelsel hebben. 7

13 Indien de patiënt er heel erg aan toe is kan overgegaan worden naar een operatie. Er zijn verschillende manieren waarop de behandeling operationeel kan plaatsvinden (Miller, 2013). Subtotale colectomie: hierbij wordt een deel van de dikke darm verwijderd. Het aantal uitgevoerde operaties loopt op door de opkomst van hypervirulente stammen van C. difficile. Een vroege operationele behandeling heeft een beter resultaat dan dat men wacht tot het een nood colectomie wordt. Deze laatste heeft een hoog sterfte percentage. Faeces transplantatie kan worden gebruikt om zo de normale intestinale flora van de patiënt te herstellen. Dit gebeurt met faeces van een gezonde donor. Deze methode kent een redelijk goed succes. 6.4 Preventie en controle In een ziekenhuis kan het sterftecijfer van patiënten hoog zijn en de Clostridium difficile infectie is één van de oorzaken die tot dit hoge cijfer bijdragen. De bacterie is aanwezig in ongeveer 2% van de gezonde volwassenen en wordt verspreid in de omgeving door mensen die geïnfecteerd of drager zijn. De preventie gebeurt in eerste instantie door het voorkomen van nieuwe kolonisatie. Bij personen die reeds gekoloniseerd zijn met Clostridium difficile, wordt getracht de uitbraak van de infectie (CDI) te voorkomen. Patiënten die verdacht zijn voor Clostridium difficile infectie of waar het reeds is aangetoond, dienen met de nodige voorzorgen behandeld te worden zoals het dragen van handschoenen en quarantaine zolang de patiënt diarree heeft. Het is verstandig om in elk geval enige voorzorg te behouden tot de patiënt ontslagen wordt uit het ziekenhuis. Contaminatie van de huid met Clostridium difficile kan immers aanhouden tot na de periode van diarree. Voorzorgen kunnen zijn dat de persoon geïsoleerd moet worden van andere patiënten. Dit gebeurt in privé kamers waar volledige voorzorgen zijn genomen. Dit wil zeggen dat maximale hygiëne nagestreefd wordt (McDonald, 2013). Omdat de sporen voor enkele maanden kunnen overleven op droge oppervlakken, is het heel belangrijk de kamer van de patiënt grondig te kuisen. De meest effectieve oplossingen om mee te kuisen zijn hypochlore oplossingen, ze moeten minimum 5000 ppm natriumhypochloriet bevatten. Het desinfecteren dient minstens 2 keer per dag te gebeuren; dit houdt ook in de bedranden, kasten, toilet, Het ziekenhuis heeft best ook een systeem waarin infecties worden ingebracht zodanig dat een uitbraak van de infectie direct gedetecteerd wordt. De patiënten dienen ook maximale hygiëne te hanteren; vaak grondig de handen wassen, het toilet doorspoelen met het deksel naar beneden om zo aerosol vrijlating te voorkomen. Gebruik maken van wegwerpthermometers heeft ook al een goed effect op het voorkomen van verspreiding. De belangrijkste preventiemaatregel is dat men moet streven naar minimaal antibiotica gebruik (McDonald, 2013). 8

14 Om verspreiding van bacteriën tegen te gaan is het belangrijk dat er maatregelen genomen worden om de infecties onder controle te houden. Dit houdt wederom in om de preventiemaatregelen goed te volgen. Indien een patiënt wordt overgeplaatst naar een ander ziekenhuis dient dat ziekenhuis zeker geïnformeerd te worden. Een routine screening van de omgeving is niet aangewezen, maar zou kunnen handig zijn bij een grote Clostridium difficile uitbraak (McDonald, 2013). 7 Materiaal en methoden 7.1 Stalen Faeces stalen werden bekomen van verschillende ziekenhuizen. Ze werden, afhankelijk van hun herkomst, bewaard op verschillende wijzen: AZ Sint-Blasius: hiervan werden zowel verse stalen als stalen bewaard bij -25 C gebruikt. AZ Sint-Lucas Gent: deze stalen werden bewaard bij -80 C. UZ Gent: deze stalen werden bewaard bij -80 C. ASZ Aalst: deze stalen werden bewaard bij -25 C. In de meerderheid van de gevallen betrof het stalen van patiënten die positief bevonden werden op Clostridium difficile. Van de 68 ontvangen stalen werden er, wegens tijdsgebrek of onvoldoende staalvolume, slechts 60 getest. 7.2 Het VIDAS toestel voor de immunoassays Met het toestel genaamd VIDAS wordt zowel de toxine A en B test gemeten als de GDH test. VIDAS is een afkorting van Vitek Immuno Diagnostic Assay System. Figuur 1: VIDAS (BioMérieux, 2013) 9

15 De VIDAS verzorgt zowel het pipetteren, het incuberen, het wassen en het aflezen van het resultaat. Indien het lichtje bovenaan brandt, wil dit zeggen dat er een test bezig is in die sectie. Brandt het lichtje niet dan is de sectie klaar voor gebruik. Indien het knippert, wil dit zeggen dat voorgaande test afgelopen is en de Solid Phase Receptacles (SPR) en strips kunnen verwijderd worden. De werking van het toestel wordt verder beschreven bij het principe van de testen. Het toestel gaat de SPR gebruiken als tip, maar ook als vaste fase. Figuur 2: Overzicht werking test (BioMérieux, 2012a) Figuur 2 toont dat het staal opgezogen wordt in de Solid Phase Receptacle (de vaste fase). Op het einde van de strip is er een fluorescentie meetbaar. Figuur 3: Fluorescentie meting (BioMérieux, 2012a) Door middel van de lichtstraal worden atomen naar een hoger energieniveau gebracht, dit heet excitatie. Wanneer de atomen terugvallen naar hun normale toestand, wordt energie vrijgegeven, dit heet emissie. Deze energie wordt waargenomen door een photodiode afgesteld op de aangepaste golflengte. Dit is de gemeenschappelijke factor voor de beschreven methoden. 10

16 Het principe achter de stappen tussen het opzuigen van het staal en de meting, verschilt naargelang er een CDAB of een Clostridium difficile GDH bepaling uitgevoerd wordt. Dit wordt in het volgende hoofdstuk uitgelegd onder en Opsporen van Clostridium difficile Toxines De immunoassays sporen toxine B en toxine A op. Er dient echter rekening mee gehouden te worden dat sommige stammen enkel toxine B en geen toxine A produceren. De detectie kan hierdoor vals negatief zijn, wanneer enkel toxine A zou opgespoord worden. Er moet pg toxine aanwezig zijn, wil de test positief zijn. Deze vals negatieve resultaten werden bekomen bij het gebruiken van vorige versies van de kit. Het principe van deze test houdt een 2-staps enzym immunoassay sandwich methode in. De detectie gebeurt door middel van fluorescentie. Materiaal in de kit: Solid phase receptacle Reagensstrips Controle 1 : positieve controle Toxine A Controle 2 : negatieve controle Controle 3 : positieve controle Toxine B Standaard R1: TRIS buffer saline 0,05mol/l (ph 7,2) + serum van een kalf foetus 50% + detergent + bewaarmiddelen De solid phase receptacle of de vaste fase is in de kit aanwezig onder de vorm van een pipetteertip. De reagensstrip bevat 10 wells die afgesloten zijn van de lucht, de reagentia aanwezig in deze wells zijn klaar voor gebruik. Enkel de eerste well is niet afgesloten, zo dat het mogelijk is om het staal in te brengen in de strip. De laatste well is een cuvette waarin de fluorescentie gemeten zal worden. De tussenliggende wells bevatten verschillende reagentia. Toxine A bindt met anti-toxine A antilichaam (konijn polyklonaal) en toxine B bindt met anti-toxine B antilichaam (muis monoklonaal) (Pituch et al, 2001). 11

17 Figuur 4: principe sandwich ELISA (NeoloMed Laboratories) De binding wordt geconjugeerd met biotine en de aanwezigheid van biotine wordt gedetecteerd door incubatie met streptavidine. De streptavidine is geconjugeerd met alkaline phosphatase, dat zorgt voor het katalyseren van de hydrolyse waarbij van het substraat naar een fluorescent product gegaan wordt. Dit fluorescent product wordt bij 450 nm gemeten. De intensiteit van de fluorescentie vergroot met de hoeveelheid van toxines A en B in het staal. De vier reacties worden automatisch uitgevoerd. Na elke stap gebeurt een wasstap om ongebonden componenten te verwijderen. Volgens de richtlijnen van de fabrikant kunnen de faeces tot 3 dagen op 2-8 C bewaard worden; na 3 dagen vinden er grote verliezen aan toxines plaats. Indien een langere bewaring nodig zou zijn, mogen de faeces voor 1 maand ingevroren worden bij -25 C. Indien er nog een extra maand bewaring nodig is, dienen ze ingevroren te worden bij -70 C. De stalen meerdere keren laten ontdooien en weer invriezen wordt sterk afgeraden. Vóór gebruik dienen de faeces steeds goed gemengd te worden, te kleine homogeniteit kan leiden tot incorrecte resultaten (Pituch et al, 2001) Glutamaatdehydrogenase Omdat glutamaatdehydrogenase geproduceerd wordt door alle Clostridium difficile isolaten, kan met deze detectie geen onderscheid gemaakt worden tussen toxigene en nontoxigene stammen. De GDH vormt daarom een initiële screening (Eastwood, 2009). Wanneer de test GDH positief is, wil dit zeggen dat Clostridium difficile aanwezig in het staal, maar wil zeker niet zeggen dat er automatisch sprake is van CDI (Clostridium difficile infection). De test kent een grote gevoeligheid en duurt ongeveer 1uur. 12

18 Stalen voor Glutamaatdehydrogenase detectie kunnen voor 3 dagen bij 2-8 C bewaard worden. Voor langere bewaring dienen ze bij -70 C bewaard te worden. Er wordt gebruik gemaakt van een enzym gebonden fluorescentie assay. Dit is een sandwich ELISA. De solid phase bevat een antilichaam om het enzyme te vangen, dit is hier een muis monoclonaal anti-gdh antilichaam. De binding wordt geconjugeerd met alkaline phosphatase. Dit katalyseert de hydrolyse van het substraat in een fluorescent product, gemeten wordt. Figuur 5: Inhoud strip van de kit (BioMérieux, 2012b) Figuur 5 toont de samenstelling van de strip. In de eerste well zit het staal en in de laatste wordt de fluorescentie gemeten. De 8 tussenliggende wells bevatten diluent, wasbuffer en conjugaat. Figuur 6: Sandwich principe (BioMérieux, 2014) 13

19 Figuur 7: Werking strip (BioMérieux, 2012b) Figuren 6 en 7 geven de werking weer van de test. De strip en de SPR worden ingebracht in de VIDAS. De SPR neemt eerst het staal op, waardoor volgens de sandwich methode de te bepalen antigenen zullen binden aan de antilichamen aanwezig op de SPR. Via een wasstap worden de ongebonden antigenen verwijderd. Vervolgens wordt het conjugaat opgezogen in de SPR. Het antilichaam gebonden aan alkalische fosfatase bindt op de antigenen. Hierop volgt een wasstap om ongebonden antilichamen te verwijderen. Vervolgens wordt het substraat opgezogen in de SPR en deze zorgt voor het ontstaan van de fluorescentie. In de laatste cuvette wordt de fluorescentie gemeten bij 450nm. In onderstaande figuur 8 is waar te nemen wat er in de SPR gebeurt. Figuur 8: Principe Solid Phase Receptacle (BioMérieux, 2014) 14

20 7.3.3 Polymerase ketting reactie Polymerase ketting reactie of PCR kan gebruikt worden om Clostridium difficile op te sporen. De test kent een grotere gevoeligheid dan de enzyme immunoassay. De tijdsduur komt ongeveer overeen (1 uur). Door de hoge gevoeligheid en de kans op vals positieven wordt PCR vaak samen gebruikt met een andere test. PCR wordt niet veel gebruikt voor screening op Clostridium difficile, omdat de kostprijs van deze test hoog is (LaMont, 2013b) Kweek Van de faeces wordt ook altijd een kweek ingezet. Dit houdt in dat er een suspensie wordt gemaakt van de faeces in fysiologisch water en deze wordt uitgeplaat op Clostridium difficile agar. Clostridium difficile agar of afgekort CLO bevat schapenbloed om de groei van Clostridium difficile te bevorderen. De antifungale en antimicrobiële agentia dienen om groei van de meeste bacteriële en fungale contaminatie te belemmeren. Tabel 1: Samenstelling Clostridium difficile agar, verkregen uit bijsluiter Casein peptone 13g Meat peptone 5g Heart peptone 3g Corn starch 1g Natrium chloride 5g Agar 13.5g Schapenbloed 50ml Cycloserine 0.100g Cefoxitine 0.008g Amphotericin B 0.002g Gedemineraliseerd water 1l ph 7.3 Deze plaat wordt gedurende 48 uur in anaëroob milieu op 37 C geïncubeerd. Na 2 dagen kan de plaat bekeken worden, de typische beige-gele kolonies met eerdere wazige rand dienen waargenomen te worden. Figuur 9: Clostridium difficile kolonies 15

21 Indien er verdachte kolonies aanwezig zijn op de plaat dient een Clostridium difficile Quik Chek Complete te gebeuren. Dit dient om op te sporen of er een toxine aanwezig is Protocol Clostridium difficile Quik Chek Complete Figuur 10: protocol Clostridium difficile Quik Chek Complete (Techlab, 2012) - Breng 750 µl Diluent in een proefbuisje - Voeg 1 druppel conjugaat toe - Voeg 25 µl staal toe - Meng - Breng hiervan 500 µl in het kleinste venstertje, ook sample well genoemd - Laat 15 minuten op kamertemperatuur staan - Voeg 300 µl was buffer toe in het reactie venster - Breng ook 2 druppels substraat aan in het reactie venster - Laat 10 minuten staan op kamertemperatuur - Het resultaat is nu zichtbaar (TECHLAB, 2012) 16

22 Mogelijke resultaten Clostridium difficile Quik Chek Complete Negatief: enkel verticale punten-lijn te bemerken Figuur 11: Resultaat Clostridium difficile Quik Chek Complete negatief (Techlab, 2012) Positief voor antigen: Links van de punten-lijn is een verticale lijn waar te nemen. Figuur 12: Resultaat Clostridium difficile Quik Chek Complete positief voor antigen en negatief voor toxine (Techlab, 2012) Positief voor antigen en toxine: Aan beide zijden van de punten-lijn is een lijn waar te nemen. Figuur 13: Resultaat Clostridium difficile Quik Chek Complete positief voor antigen en toxine (Techlab,2012). 17

23 Enkele resultaten van kweek Figuren 14 tot en met 19 geven enkele resultaten weer. Negatieve kweek: kleine, duidelijk afgelijnde ronde kolonies. Figuur 14: Resultaat kweek voor staal 2747 is negatief, na 48 uur incubatie in anaëroob milieu bij 37 C Negatieve kweek: kleine, duidelijke afgelijnde ronde kolonies. Figuur 15: Resultaat kweek voor staal is negatief, na 48 uur incubatie in anaëroob milieu bij 37 C 18

24 Figuur 16: Resultaat kweek voor staal is negatief, na 48 uur incubatie in anaëroob milieu bij 37 C Figuur 17: Resultaat Clostridium difficile Quik Chek Complete van staal is positief voor Antigen en negatief voor Toxine Positieve kweek: grotere, beige kolonies met wazige aflijning. Figuur 18: Resultaat kweek van staalnummer is positief, na 48 uur incubatie in anaëroob milieu bij 37 C 19

25 Figuur 19: Resultaat voor staalnummer bekomen met de Clostridium difficile Quik Chek Complete is positief voor Antigen en Toxine 20

26 8 Resultaten 8.1 Clostridium difficile GDH als vervanging voor Clostridium difficile toxine A en B Zoals reeds vermeld in de inleiding is het doel van dit eindwerk om te achterhalen of de Clostridium difficile toxine A en B test kan vervangen worden door de kit voor Clostridium difficile GDH. In eerste instantie was het de bedoeling de stalen bekomen van de verschillende ziekenhuizen systematisch in drievoud te onderwerpen aan een toxine A en B en een GDH assay. Voor de GDH test worden de resultaten positief beschouwd wanneer de waarde hoger of gelijk is aan een fluorescentie van 0,10. Ze worden negatief beschouwd wanneer een fluorescentie lager dan 0,10 wordt gemeten. Voor de CDAB test worden resultaten als positief beschouwd wanneer de fluorescentie hoger of gelijk is aan 0,37. Het resultaat is negatief bij een fluorescentie lagen dan 0,13. Alle resultaten die een waarde hebben tussen 0,13 en 0,37 worden dubieus of intermediair genoemd. Tabel 2: Resultaten Toxine A en B in vergelijking met de resultaten van de GDH test (het totaal aantal stalen is 60) VIDAS toxine A en B Positief Dubieus Negatief VIDAS GDH Positief Negatief In tabel 2 is waar te nemen dat stalen die negatief zijn voor Clostridium difficile GDH, nooit positief zijn voor Clostridium difficile toxine A en B. Dit betekent dat de Clostridium difficile GDH test gebruikt kan worden als screening: een staal met negatief resultaat voor de Clostridium difficile GDH test, dient niet verder onderzocht te worden met de toxine A en B test. De Clostridium difficile toxine A en B test kan echter niet vervangen worden door de GDH test; dit is te zien in de positieve resultaten. Een positieve GDH test, wil niet zeggen dat toxines aanwezig zijn. Dit is af te leiden aan de resultaten van de toxine A en B test; deze zijn niet altijd positief wanneer de GDH test dit wel is. 8.2 Clostridium diffile GDH als vervanging voor Clostridium difficile kweek Als tweede werd gekeken of de Clostridium difficile GDH test als vervanging kan dienen voor de kweek, hiervan werd wederom een overzicht gemaakt. Tabel 3: Resultaten van de kweek in vergelijking met de resultaten bekomen met de test GDH, het totaal aantal stalen is 60 Clostridium difficile kweek Positief Negatief VIDAS GDH Positief Negatief

27 Tabel 3 toont dat een negatieve Clostridium difficile GDH test, ook negatief is voor kweek. Wegens problemen met het in kweek brengen van diepgevroren stalen, werd een afzonderlijk overzicht gemaakt met resultaten van de beschikbare verse stalen. Resultaten bekomen bij stalen die niet werden ingevroren: Tabel 4: Resultaten van de kweek in vergelijking met de resultaten bekomen met de test GDH, enkel verse stalen, totaal aantal stalen is 8 Clostridium difficile kweek Positief Negatief VIDAS GDH Positief 0 0 Negatief 0 8 Positieve stalen voor Clostridium difficile komen niet veel voor. Het was dan ook te verwachten dat de verse stalen die geanalyseerd werden allemaal negatief waren. Hierdoor kan uit tabel 4 enkel afgeleid worden dat wanneer een Clostridium difficile GDH test negatief is, de kweek dit ook blijkt te zijn. Belangrijk te vermelden is dat bij het uitvoeren van de GDH test, gebaseerd op het principe beschreven in 7.3.3, waarvan de resultaten hierboven met de kweek vergeleken werden, het volgend protocol werd gevolgd: Voeg 200 µl faeces toe aan 1000 µl R1 reagens Vortex grondig Centrifugeer 10 minuten op 3000 g Gebruik 300 µl supernatans voor de GDH test Centrifugeer de rest 5 minuten op g Gebruik 300 µl supernatans voor de CDAB test Dit protocol is een nieuwe combinatie van de officiële werkwijzen van de GDH en de CDAB kit en werd opgesteld door de firma BioMérieux om reeds tijd te winnen. De individuele resultaten van de vergelijking tussen de Clostridium difficile GDH en de kweek zijn af te lezen in Tabel 5. Tabel 5: Vergelijking van de test Clostridium difficile GDH uitgevoerd volgens protocol 3 met de cultuur Nr Ref Protocol 3 Cultuur overeenkomst Pos pos OK Pos pos OK Pos neg niet OK Pos pos OK Neg neg OK Neg neg OK Neg neg OK Neg neg OK Pos neg niet OK 22

28 Nr Ref Protocol 3 Cultuur overeenkomst Pos neg niet OK Pos pos OK Pos pos OK Pos neg niet OK Pos neg niet OK Pos pos OK Pos pos OK Neg neg OK Neg neg OK Neg neg OK Neg neg OK Pos neg niet OK Neg neg OK Neg neg OK Pos pos OK Pos neg niet OK Pos neg niet OK Pos pos OK Pos pos OK Pos pos OK Pos pos OK Pos neg niet OK Neg neg OK Pos neg niet OK 34 7 Pos pos OK Neg neg OK Neg neg OK 37 6 Pos pos OK Pos pos OK Pos pos OK 40 9 Pos pos OK Neg neg OK Neg neg OK 43 5 Pos pos OK Neg neg OK Neg neg OK Neg neg OK 47 4 Pos pos OK Pos neg Niet OK Pos pos OK Pos neg niet OK 51 G4338 Pos neg niet OK 52 G3804 Pos neg niet OK Pos pos OK Pos pos OK Pos neg niet OK Pos pos OK 57 1 Pos neg niet OK 23

29 Nr Ref Protocol 3 Cultuur overeenkomst Pos neg niet OK Pos neg niet OK 60 3 Pos neg niet OK Uit tabel 5 lezen we af dat 19 van de 60 of 32% van de resultaten niet overeenstemmen. Dit kan te wijten zijn aan het feit dat de faeces door het invriezen niet goed meer in kweek te brengen waren. Het resultaat van de cultuur kan dus vals negatief zijn door het invriezen van de faeces. 41 van de 60 of 68% van de resultaten komen wel met elkaar overeen. Dit is reeds een aanzienlijk percentage, maar toch werd een grotere overeenstemming verwacht. De Clostridium difficile GDH test is heel gevoelig: wanneer de GDH test negatief is zou de kweek dat ook moeten zijn en dit klopt volgens bovenstaande tabel. Met deze resultaten kan niet besloten worden of de GDH test als vervanging kan dienen voor de kweek, omdat problemen werden ondervonden bij het terug in kweek brengen van de diepgevroren stalen. De meerderheid van de stalen had een positief resultaat voor de kweek in het microbiologisch labo waar ze vandaan komen; ze werden vervolgens meteen diepgevroren. Voor de testen werden de stalen terug ontdooid, er werd Clostridium difficile GDH en toxine A en B op uitgevoerd alsook een kweek van ingezet. Bijkomend onderzoek naar het gevolg van invriezen van faeces of het resultaat van gebruik maken van enkel verse stalen zou interessant zijn. 8.3 Vereenvoudigen van de procedure Uit de bekomen resultaten is gebleken dat de nieuw voorgestelde GDH test voor de bepaling van de negatieve stalen van nut kan zijn. De sequentiële centrifugatiestappen zorgden er echter nog steeds voor dat één bepaling een aanzienlijk deel van de tijd zou innemen waarbinnen de VIDAS machine beschikbaar is voor Clostridium difficile bepalingen. Daarvoor werkte BioMérieux twee extra protocols uit, waarbij de centrifugatiestappen gecombineerd worden en de tijdsduur van de bepaling significant ingekort wordt. Deze protocols werden eveneens op de stalen toegepast Werkwijze protocol 1 (extra 1) Indien het staal vloeibaar is dient 200 µl faeces genomen te worden, indien er sprake is van vaste of halfvaste faeces dient 200 mg genomen te worden. Om de juiste hoeveelheid faeces te nemen kan een blanco van 200 µl water naast het eppendorf cupje met faeces worden gezet, met het oog kan dan gekeken worden of het voldoende faeces is. Aan de correcte hoeveelheid faeces wordt 1000 µl R1 reagens toegevoegd. Vortex grondig Centrifugeer 10 minuten op 3000 g Gebruik 300 µl supernatans voor de GDH test (glutamaat dehydrogenase) Gebruik 300 µl supernatans voor de CDAB test (Clostridium difficile toxin A en B) 24

30 8.3.2 Werkwijze protocol 2 (extra 2) Voeg aan de correcte hoeveelheid faeces 1000 µl R1 reagens toe Vortex grondig Centrifugeer 5 minuten op g Gebruik 300 µl supernatans voor de GDH test Gebruik 300 µl supernatans voor de CDAB test Werkwijze protocol 3 (origineel) Voeg aan de correcte hoeveelheid faeces 1000 µl R1 reagens toe Vortex grondig Centrifugeer 10 minuten op 3000 g Gebruik 300 µl supernatans voor de GDH test Centrifugeer de rest 5 minuten op g Gebruik 300 µl supernatans voor de CDAB test Zoals eerder vermeld, was dit reeds een combinatie van de officiële werkwijzen van twee kits, opgesteld door de firma BioMérieux Resultaten Om na te gaan of een efficiënter protocol kan gebruikt worden dat hetzelfde resultaat geeft als het opgegeven protocol, werden de resultaten van protocol 1 naast het protocol 3 gelegd. In onderstaande tabel is de overeenkomst tussen beide waar te nemen. Resultaten kleiner dan 0,10 zijn negatief, resultaten groter dan of gelijk aan 0,10 zijn positief. Tabel 6: Vergelijking tussen de resultaten bekomen met protocol 1 en protocol 3 voor Clostridium difficile GDH Nr Ref Protocol 1 Protocol 2 resultaat Interpretatie* resultaat Interpretatie* Overeenkomst ,99 pos 2,43 pos OK neg 0 neg OK neg 0,01 neg OK ,4 pos 3,1 pos OK ,76 pos 1,92 pos OK ,25 pos 0,26 pos OK ,71 pos 1,94 pos OK ,09 pos 6,88 pos OK ,38 pos 5,56 pos OK ,42 pos 7,35 pos OK ,78 pos 3,07 pos OK neg 0 neg OK ,18 pos 1,14 pos OK pos 7,25 pos OK ,01 neg 0,01 neg OK neg 0 neg OK ,67 pos 6,91 pos OK ,92 pos 7,01 pos OK ,13 pos 7,07 pos OK ,79 pos 6,99 pos OK 25

31 Nr Ref Protocol 1 Protocol 2 resultaat Interpretatie* resultaat Interpretatie* Overeenkomst neg 0 neg OK neg 0 neg OK ,99 pos 6,77 pos OK neg 0 neg OK ,02 neg 0,02 neg OK neg 0 neg OK ,29 pos 7,04 pos OK ,98 pos 2,57 pos OK ,52 pos 5,97 pos OK ,87 pos 6,13 pos OK 31 G4338 6,68 pos 7,09 pos OK 32 G3804 0,67 pos 0,95 pos OK ,32 pos 1,44 pos OK ,04 pos 2,96 pos OK ,87 pos 2,51 pos OK ,3 pos 7,11 pos OK ,91 pos 7,13 pos OK ,73 pos 6,53 pos OK ,15 pos 6,77 pos OK ,14 pos 6,97 pos OK Tabel 6 toont dat de overeenkomst tussen protocol 1 en protocol 3 100% is. Dit was te verwachten omdat voor het uitvoeren van de Clostridium difficile GDH test in beide protocols test gedurende 10 minuten gecentrifugeerd wordt bij 3000 g. Hetzelfde werd gedaan voor protocol 2 en 3. De overeenkomst tussen beide wordt door onderstaande tabel weergegeven. Tabel 7: Vergelijking tussen resultaten bekomen met protocol 2 en protocol 3 voor de Clostridium difficile GDH test Nr Ref Protocol 2 Protocol 3 resultaat Interpretatie* Resultaat Interpretatie* Overeenkomst ,67 pos 2,43 pos OK neg 0 neg OK ,01 neg 0,01 neg OK ,12 pos 3,1 pos OK ,32 pos 1,92 pos OK ,27 pos 0,26 pos OK ,13 pos 1,94 pos OK ,01 pos 6,88 pos OK ,99 pos 5,56 pos OK ,05 pos 7,35 pos OK ,94 pos 3,07 pos OK neg 0 neg OK ,04 pos 1,14 pos OK ,1 pos 7,25 pos OK ,01 neg 0,01 neg OK 26

32 Nr Ref Protocol 2 Protocol 3 resultaat Interpretatie* Resultaat Interpretatie* Overeenkomst neg 0 neg OK ,8 pos 6,91 pos OK ,78 pos 7,01 pos OK ,97 pos 7,07 pos OK ,01 pos 6,99 pos OK neg 0 neg OK neg 0 neg OK ,8 pos 6,77 pos OK neg 0 neg OK ,01 neg 0,02 neg OK neg 0 neg OK ,33 pos 7,04 pos OK ,7 pos 2,57 pos OK ,58 pos 5,97 pos OK ,26 pos 6,13 pos OK 31 G4338 7,14 pos 7,09 pos OK 32 G3804 1,07 pos 0,95 pos OK ,51 pos 1,44 pos OK ,7 pos 2,96 pos OK ,3 pos 2,51 pos OK ,93 pos 7,11 pos OK ,6 pos 7,13 pos OK ,32 pos 6,53 pos OK ,9 pos 6,77 pos OK ,99 pos 6,97 pos OK In tabel 7 is waar te nemen dat de overeenkomst tussen de resultaten bekomen met protocol 2 en protocol 3 100% is. Voor de Clostridium difficile GDH test is er dus geen verschil waar te nemen tussen de drie verschillende protocols. Dit is mogelijk door de goede stabiliteit van glutamaatdehydrogenase: er gaat heel weinig glutamaatdehydrogenase verloren bij bewaring. De toxines die met behulp van de Clostridium difficile toxine A en B test gedetecteerd worden, zijn minder stabiel en gaan snel verloren bij niet optimale bewaring. Door de instabiliteit van de toxines is het dus belangrijk een optimaal protocol te hanteren. Eerst worden de resultaten bekomen met protocol 1 naast de resultaten bekomen met protocol 3 gelegd. De overeenkomst wordt door onderstaande tabel weergegeven. 27

33 Tabel 8: Vergelijking tussen resultaten bekomen met protocol 1 en protocol 3 voor Clostridium difficile Toxine A en B test Nr Ref Protocol 1 Protocol 3 resultaat Interpretatie* Resultaat Interpretatie* Overeenkomst ,03 Neg 0,02 Neg OK ,02 Neg 0,02 Neg OK ,25 Int 0,15 Int OK ,26 Int 0,23 Int OK ,09 Neg 0,1 Neg OK ,07 Neg 0,07 Neg OK ,26 Int 0,41 Pos niet OK ,19 Int 0,18 Int OK ,04 Neg 0,03 Neg OK ,02 Neg 0,01 Neg OK ,16 Int 0,13 Int OK ,08 Neg 0,1 Neg OK ,13 Int 0,12 Neg niet OK ,71 Pos 4,03 Pos OK ,2 Int 0,17 Int OK ,17 Int 0,14 Int OK ,78 Pos 4,67 Pos OK ,82 Pos 4,49 Pos OK ,95 Pos 1,9 Pos OK ,79 Pos 3,95 Pos OK ,01 Neg 0,02 Neg OK ,02 Neg 0,02 Neg OK ,37 Pos 3,88 Pos OK ,27 Int 0,23 Int OK ,24 Int 0,21 Int OK ,03 Neg 0,03 Neg OK ,28 Pos 1,63 Pos OK ,15 Int 0,22 Int OK ,06 Neg 0,14 Int niet OK ,2 Int 0,31 Int OK 31 G4338 0,13 Int 0,17 Int OK 32 G3804 0,06 Neg 0,05 Neg OK ,21 Int 0,23 Int OK ,27 Pos 1,28 Pos OK ,02 Neg 0,01 Neg OK ,18 Int 0,14 Int OK ,09 Neg 0,09 Neg OK ,95 Pos 5,57 Pos OK ,04 Neg 0,04 Neg OK ,09 Pos 1,31 Pos OK In tabel 8 is waar te nemen dat 3 van de 40 of 7,5% niet overeenstemt en 37 van de 40 of 92,5% dat wel doet. Ondanks het redelijk hoge percentage worden met protocol 1 niet steeds dezelfde resultaten bekomen dan met protocol 3. 28

34 Vervolgens wordt een vergelijking gemaakt tussen de resultaten voor Clostridium difficile toxine A en B bekomen met protocol 2 en met protocol 3. Onderstaande tabel toont deze vergelijking. Tabel 9: Vergelijking tussen de resultaten bekomen met protocol 2 en protocol 3 voor Clostridium difficile Toxine A en B test Nr Ref Protocol 2 Protocol 3 resultaat Interpretatie* resultaat Interpretatie* Overeenkomst ,05 Neg 0,02 Neg OK ,02 Neg 0,02 Neg OK ,12 Neg 0,15 Int niet OK ,35 Int 0,23 Int OK ,08 Neg 0,1 Neg OK ,06 Neg 0,07 Neg OK ,42 Pos 0,41 Pos OK ,27 Int 0,18 Int OK ,03 Neg 0,03 Neg OK ,01 Neg 0,01 Neg OK ,18 Int 0,13 Int OK ,12 Neg 0,1 Neg OK ,1 Neg 0,12 Neg OK ,91 Pos 4,03 Pos OK ,18 Int 0,17 Int OK ,16 Int 0,14 Int OK ,68 Pos 4,67 Pos OK Pos 4,49 Pos OK ,96 Pos 1,9 Pos OK ,46 Pos 3,95 Pos OK ,02 Neg 0,02 Neg OK ,02 Neg 0,02 Neg OK ,36 Pos 3,88 Pos OK ,24 Int 0,23 Int OK ,24 Int 0,21 Int OK ,03 Neg 0,03 Neg OK ,48 Pos 1,63 Pos OK ,11 Neg 0,22 Int niet OK ,07 Neg 0,14 Int niet OK ,24 Int 0,31 Int OK 31 G4338 0,17 Int 0,17 Int OK 32 G3804 0,06 Neg 0,05 Neg OK ,21 Int 0,23 Int OK ,19 Pos 1,28 Pos OK ,01 Neg 0,01 Neg OK ,11 Neg 0,14 Int niet OK ,12 Neg 0,09 Neg OK ,99 Pos 5,57 Pos OK ,05 Neg 0,04 Neg OK ,17 Pos 1,31 Pos OK 29

35 Tabel 9 toont dat 4 van de 40 of 10% van de resultaten bekomen met protocol 2 en protocol 3 niet overeenstemmen. Echter 36 van de 40 of 90% stemmen wel overeen. Ook met protocol 2 worden niet dezelfde resultaten bekomen als met protocol Kwaliteitscontrole Voor Clostridium difficile GDH werden twee controle levels gebruikt; level 1 als positieve controle en level 2 als negatieve controle Level 1 Tabel 10: Resultaten controles level 1 Datum: 19/02/ /02/2014 5/03/ /03/ /03/ /03/ /03/2014 Waarde: 0,23 0,24 0,24 0,24 0,44 0,36 0,41 De resultaten van level 1 dienen tussen 0,16 en 0,32 te liggen. Vanaf 17/03/2014 is dit niet meer het geval. Door het verhoogde resultaat voor de controle werd op 21/03/2014 een calibratie uitgevoerd. Wederom lagen de waarden te hoog. Omdat werd gedacht aan een menselijke fout, werd de controle nog eens uitgevoerd op 22/05/2014, ditmaal door een ervaren laborant, maar zoals tabel 10 aangeeft verbeterde het resultaat niet. De firma BioMérieux werd gecontacteerd en zij kunnen deze plotselinge verschuiving ook niet plaatsen. Er werd ondertussen een nieuwe kit opgestuurd, omdat ze de houdbaarheid van de controles in twijfel trokken. Tabel 11: Statistische verwerking level 1 Opgegeven waarde: 0,24 Gemiddelde: 0,31 Mediaan: 0,24 Standaarddeviatie: 0,08 CV 27,52% Het gemiddelde van de resultaten bekomen voor level 1 ligt tussen de opgegeven grenswaarden. De nieuwe kit werd wederom gecalibreerd. Resultaten bekomen voor level 1 zijn in onderstaande tabel waar te nemen: Tabel 12: Resultaten controles na hercalibratie met nieuwe kit Datum: 13/05/ /05/ /05/2014 Waarde: 0,20 0,22 0,19 De controles uitgevoerd met de nieuwe kit liggen binnen de grenzen opgesteld door de firma. Door deze resultaten weten we dat de houdbaarheid van de controles in twijfel kan getrokken worden. 30