Milieurisicoanalyse behorend bij de aanvraag IM Datum: 29 mei 2012

Transcriptie

1 Milieurisicoanalyse behorend bij de aanvraag IM Datum: 29 mei 2012 De milieurisicoanalyse is onder verantwoordelijkheid van het Ministerie van Infrastructuur en Milieu uitgevoerd overeenkomstig bijlage II van de Richtlijn 2001/18/EG inzake de doelbewuste introductie van genetisch gemodificeerde organismen in het milieu en het richtsnoer 2002/623/EG ter aanvulling van deze bijlage II. Daarbij is rekening gehouden met de uitwerking op het milieu van de geïntroduceerde organismen en het milieu waarin wordt geïntroduceerd. De milieurisicobeoordeling neemt zowel directe als indirecte, de onmiddellijk en de vertraagd optredende risico s voor de menselijke gezondheid en het milieu in beschouwing, die de doelbewuste introductie met zich mee kan brengen. Bij de milieurisicobeoordeling moeten de potentiële schadelijke effecten van geïdentificeerde kenmerken van het ggo worden vergeleken met die van het ongemodificeerde organisme waaruit het ggo is afgeleid. Daarbij worden de omstandigheden van het voorgenomen gebruik in aanmerking genomen. De beoordeling moet per geval worden uitgevoerd, wat betekent dat de vereiste informatie kan verschillen afhankelijk van het betrokken ggo en het voorgenomen gebruik daarvan. Opgemerkt moet worden dat voor studies met mensen niet primair het risico voor de patiënt wordt getoetst. Deze toets wordt sinds het in werking treden van de Wet medisch wetenschappelijk onderzoek met mensen beoordeeld door de Centrale Commissie Mensgebonden Onderzoek (CCMO). Voor studies met dieren geldt dat het welzijn van de dieren en de hiermee verband houdende ethische overwegingen getoetst wordt door de Commissie Biotechnologie bij Dieren (CBD). De milieurisicoanalyse van de aangevraagde werkzaamheden bestaat uit de volgende delen. Deel 1 bevat een samenvatting van de gegevens zoals die zijn aangeleverd door de aanvrager. Deze gegevens dienen als basis van de milieurisicoanalyse van het dossier zoals deze volgt uit de kenmerken van de ggo s en de voorgestelde wijze van introductie. Deel 2 geeft de milieurisicoanalyse voor de introductie in het milieu van het ggo. Hierbij wordt per sequentie bepaald hoe de nieuwe kenmerken van het ggo eventueel schadelijke effecten kunnen hebben voor het milieu. De milieurisicobeoordeling wordt uitgevoerd conform de Europese Richtlijn 2001/18/EG, volgens de methodologie beschreven in bijlage II van deze Richtlijn. De Richtlijn geeft een overzicht van de kenmerken die beoordeeld moeten worden om de schadelijke gevolgen voor het milieu in kaart te brengen. De Richtlijn is algemeen gericht op de introductie in het milieu, en niet specifiek bedoeld voor klinisch onderzoek met ggo s bij mens of dier. De Richtlijn bevat daardoor beoordelingskenmerken die voor een ggo voor klinische toepassing niet of minder relevant zijn. Voordat invulling wordt gegeven aan de milieurisicobeoordeling van een ggo dat toegepast wordt in een klinische studie bij mens of dier wordt een overzicht gegeven van kenmerken uit bijlage II van de Richtlijn die hiervoor relevant worden geacht. In onderdeel C2 van bijlage II van de Richtlijn wordt een aantal mogelijke schadelijke effecten opgesomd. Hieronder wordt een kort overzicht gegeven van de in de Richtlijn genoemde aspecten. Hierbij wordt in algemene bewoordingen beschreven of het genoemde kenmerk al dan niet van belang is bij de beoordeling van de werkzaamheden. Ministerie van IenM IM /00 Pagina 1 / 34

2 In dit document volgt een nadere toelichting op de beoordelingsaspecten waarbij de Richtlijn en de bijbehorende toelichting fungeren als startpunt. I. Ziekten bij de mens, met inbegrip van allergische en toxische effecten. Het is van belang na te gaan in hoeverre de toepassing van het ggo kan leiden tot het ontstaan van ziekten. Hierbij moeten de ziekteverwekkende eigenschappen van het ggo worden vergeleken met die van het uitgangsorganisme. Van de meeste ziekteverwekkende organismen is de pathogeniteit bekend. De pathogeniteit van het uitgangsorganisme is een belangrijk uitgangspunt. Omdat de ziekteverwekkende eigenschappen van een ggo niet enkel worden bepaald door de pathogeniteit van het uitgangsorganisme worden ook de genetische modificatie en de toepassing in beschouwing genomen. In de Richtlijn worden diverse beoordelingsaspecten genoemd welke de ziekteverwekkende eigenschappen van een ggo kunnen beïnvloeden. Deze beoordelingsaspecten worden later in deze notitie nader toegelicht. II. Ziekten bij dieren en planten, met inbegrip van allergische en toxische effecten. Omdat in klinische studies toegepaste ggo s veelal zijn afgeleid van uitgangsorganismen die niet in staat zijn een plantaardige gastheer te infecteren wordt verondersteld dat deze ggo s bij planten geen ziekten kunnen veroorzaken. Mochten er in een voorkomend geval toch overwegingen zijn bij de combinatie gastheer/gekloneerde genen die betrekking hebben op de plantpathogeniteit, dan worden deze alsnog in beschouwing genomen. Voor ziekten bij dieren geldt een overeenkomstige argumentatie als verwoord onder het kopje ziekten bij de mens. In de notitie worden ziekten bij de mens en ziekten bij dieren gezamenlijk behandeld. III. Effecten op de populatiedynamiek van soorten binnen het milieu en effecten op de genetische diversiteit van elk van die populaties. Effecten op patiënten of proefdieren welke optreden ten gevolge van de toediening van een ggo behoren niet tot het wettelijke kader waarbinnen de milieurisicobeoordeling wordt uitgevoerd. Effecten op patiënten of proefdieren vallen onder de medische verantwoordelijkheid van de behandelend (dieren)arts en worden in het geval van klinische studies bij mensen beoordeeld door de CCMO. Echter, effecten op mens en dier in de omgeving van patiënt of proefdier (niet-doelpopulaties) kunnen afgeleid worden uit de effecten die mogelijk kunnen optreden bij de patiënt / proefdier. Daarom worden effecten op de doelpopulatie in de overwegingen betrokken waarbij in vervolgens nagegaan moet worden in hoeverre derden met het ggo in contact komen en als dit het geval is wat de kans is dat effecten optreden. IV. Gewijzigde gevoeligheid voor ziekteverwekkers, waardoor de verspreiding van besmettelijke ziekten wordt vergemakkelijkt en/of nieuwe reservoirs of vectoren worden gecreëerd. Gevoeligheid voor ziekteverwekkers is van groot belang bij de beoordeling van genetisch gemodificeerde planten en andere hogere organismen. De gevoeligheid voor ziekteverwekkers van micro-organismen is niet van toepassing bij de beoordeling van genetisch gemodificeerde virussen, virale vectoren en bacteriën. V. Het in gevaar brengen van preventieve of therapeutische medische en veterinaire behandelingen. Als voorbeeld noemt de Richtlijn hierbij het in gevaar brengen van preventieve of therapeutische medische, veterinaire of plantenbeschermingsbehandelingen, door het ontstaan van antibioticumresistentie door genoverdracht. Ten aanzien van de genoemde plantbeschermingsbehandelingen gelden dezelfde overwegingen als die werden genoemd in het kader van ziekten bij planten, in paragraaf II. Om deze reden worden effecten op plantenbeschermingsbehandelingen niet in de milieurisicobeoordeling opgenomen. Het in gevaar brengen van medische en veterinaire behandelingen wordt later uitgewerkt voor specifieke aspecten behorend bij de betreffende studie. VI. Effecten op biogeochemische cycli. Met betrekking tot de effecten op biogeochemische cycli moet met name ingegaan worden op recycling van koolstof en stikstof uit organisch materiaal in de bodem. Van een ggo dat in een klinische studie bij mens of dier wordt toegepast kan over het algemeen uitgesloten worden dat zij gedurende langere tijd buiten een gastheer overleven in het milieu. Alleen indien overleving gedurende langere tijd mogelijk is en er een interactie kan plaatsvinden met organismen in de bodem die een rol spelen in deze processen zou dit aspect in de beoordeling van belang moeten zijn. Organismen die toegepast worden in klinische studies die langere tijd overleven buiten een gastheer en een interactie hebben met organismen in de bodem zijn niet eerder toegepast in klinische studies. Bij de beoordeling van de risico s voor mens en milieu van ggo s zal dit beoordelingsaspect over het algemeen niet uitgewerkt worden. Ministerie van IenM IM /00 Pagina 2 / 34

3 In de bovenstaande onderdelen I tot en met VI wordt een overzicht gegeven van de beoordelingsaspecten zoals deze uit Richtlijn 2001/18/EG zijn afgeleid. Niet alle beschreven onderdelen zijn van belang bij de beoordeling van klinische studies met mensen of dieren. De relevante onderdelen worden hieronder nader uitgewerkt en vertaald naar de beoordelingspraktijk van klinisch onderzoek. Hiertoe zijn sommige onderdelen samengevoegd en wordt toegelicht welke nadere invulling bij de beoordeling aan deze onderdelen gegeven wordt. Ziekten bij mens en dier (toelichting op onderdeel I, II en IV) De onderstaande uitwerking gaat in op de aspecten die van belang zijn voor de beoordeling van de mogelijke schadelijke effecten van een ggo op mens en milieu, waarbij de nadruk ligt op ziekten bij mens en dier. Uitgangspunt is dat ziekten bij patiënt of proefdier die ten gevolge van toepassing van het ggo kunnen ontstaan in beginsel geen deel uit maken van de beoordeling. Bij de beoordeling wordt wel ingegaan op schadelijke effecten die op kunnen treden bij de patiënt of het proefdier (de doelpopulatie ), maar dan alleen omdat de effecten die in de doelpopulatie worden waargenomen indicatief zijn voor effecten die buiten de doelpopulatie kunnen optreden als verspreiding van het ggo in het milieu plaatsvindt. Het is niet vanzelfsprekend dat effecten op de doelpopulatie ook in het milieu kunnen optreden. In dit kader zijn verspreiding in het milieu en blootstelling van derden van belang. Als verspreiding in het milieu en dus blootstelling niet kan plaatsvinden is het zeer onwaarschijnlijk dat de toepassing een gezondheidsrisico vormt voor mens en milieu. In zo n situatie worden de ziekteverwekkende eigenschappen die eventueel waargenomen worden in de studiepopulatie minder zwaarwegend. Als verspreiding in het milieu en blootstelling kan plaatsvinden dan moet beoordeeld worden welke effecten ten gevolge hiervan kunnen optreden. In zo n situatie is een effect op de studiepopulatie indicatief. In het geval dat verspreiding in het milieu en blootstelling niet uitgesloten kan worden, worden verschillende aan de levenscyclus van het ggo verbonden kenmerken in beschouwing genomen. Het betreft de volgende kenmerken: pathogeniteit en virulentie, infectiviteit, gastheerbereik en tropisme, replicatie en transmissie en toxigeniteit en allergeniteit. Pathogeniteit en virulentie (onderdeel A in Tabel 2) Pathogeniteit van de uitgangsorganismen vormt een uitgangspunt voor de beoordeling van het pathogene potentieel van een ggo. Pathogenese omvat de mechanismen waarmee organismen zoals bijvoorbeeld virussen of bacteriën bepaalde celpopulaties in een specifieke gastheer en een bepaald weefsel kunnen beschadigen waardoor ziekteverschijnselen in deze gastheer kunnen ontstaan. Het vermogen van een pathogeen organisme om een ziekte te veroorzaken in een gastheer noemt men virulentie. Pathogenese en virulentie zijn twee nauw samenhangende begrippen die bij een beoordeling uitgesplitst worden in verschillende factoren die pathogeniteit en virulentie beïnvloeden. In principe kan alle nieuwe genetische informatie een effect hebben op de pathogeniteit en de virulentie. Om deze reden wordt van een ggo elke toegevoegde dan wel gedeleteerde sequentie bij de beoordeling betrokken. Infectiviteit (onderdeel A in Tabel 2) Infectiviteit neemt in de milieurisicobeoordeling van een ggo een belangrijke plaats in. Bij de beoordeling van de mogelijke schadelijke effecten die op kunnen treden in het milieu wordt eerst beoordeeld in hoeverre het ggo eigenschappen bezit die mogelijk een effect hebben in een geïnfecteerde gastheer. Als deze effecten niet geïdentificeerd kunnen worden is de beoordeling van de infectiviteit minder van belang. Als schadelijke effecten op kunnen treden in de patiënt of het proefdier en verspreiding van het ggo in het milieu kan niet uitgesloten worden, dan is beoordeling van de infectiviteit van belang. Gastheerbereik en tropisme (onderdeel A in Tabel 2) Wanneer een donorsequentie wordt ingebracht, kan een eiwit tot expressie komen dat een effect heeft op het tropisme en het gastheerbereik van het ggo in vergelijking met gastheerbereik en tropisme van het uitgangsorganisme. Dit kan tot gevolg hebben dat het tropisme en het gastheerbereik van het uitgangsorganisme veranderen. In gevallen dat een dergelijk scenario niet uitgesloten kan worden, dan moet in de risicobeoordeling rekening gehouden worden met een additioneel risico. Vervolgens moet nagegaan worden of een eiwit dat tot expressie komt ook daadwerkelijk functioneel is in de (virale) vector. Indien niet uitgesloten kan worden dat er een verandering optreedt in het gastheerbereik en tropisme van de vector, zal dit niet automatisch betekenen dat er ook sprake is van een gewijzigde pathogeniteit. Wel moet het risico in beschouwing genomen worden dat mogelijk andere cellen, weefsels, organen of zelfs gastheren geïnfecteerd kunnen worden en hierdoor schadelijke effecten ondervinden die normaal gesproken niet mogelijk zou zijn geweest zonder de toepassing van genetische modificatie. Replicatie en transmissie (onderdeel A in Tabel 2) Onder replicatie en transmissie verstaat men respectievelijk vermeerdering en verspreiding. Bij de beoordeling van de risico s voor mens en milieu moet nagegaan worden of het ggo dat Ministerie van IenM IM /00 Pagina 3 / 34

4 aan patiënt of proefdier wordt toegediend kan repliceren. In eerste instantie moet beoordeeld worden of de vector autonoom kan repliceren. De meeste vectoren die worden toegepast in klinische studies zijn replicatiedeficiënt. Replicatiedeficiëntie berust veelal op de afwezigheid van een essentieel genproduct waarvan de sequentie in de vector ontbreekt of niet (functioneel) tot expressie komt. Nagegaan moet worden of de replicatiedeficiëntie kan worden hersteld bijvoorbeeld door homologe recombinatie met in de patiënt aanwezige organismen. Als replicatie kan optreden moet nagegaan worden of de vector zich kan verspreiden. In dit kader zijn gegevens over biodistributie van belang. Tot slot moet beoordeeld worden via welke transmissieroutes verspreiding in het milieu kan plaatsvinden en in welke mate dit kan plaatsvinden. Verspreiding in het milieu is een noodzakelijke stap op weg naar blootstelling van derden en het milieu. Als schadelijke effecten op kunnen treden in de patiënt of het proefdier en verspreiding van het ggo in het milieu kan niet uitgesloten worden, dan is beoordeling van de replicatie en transmissie van belang. Toxigeniteit en allergeniteit (onderdeel D in Tabel 2) Indien verspreiding van het ggo in het milieu kan optreden is het van belang te evalueren welke schadelijke effecten kunnen optreden. Hierbij moet nagegaan worden in hoeverre het ggo schadelijke sequenties bezit en tot expressie kan brengen. Belangrijke ijkpunten hierbij zijn toxiciteit en allergeniteit van het genproduct. Genoverdracht naar andere organismen (onderdeel C in Tabel 2) Erfelijke informatie van een ggo kan overgedragen worden op andere in het milieu aanwezige organismen die direct of indirect in contact komen met het ggo. Bij de beoordeling wordt nagegaan in hoeverre erfelijke informatie van het ggo overgedragen kan worden op andere micro-organismen (bijvoorbeeld een aan de vector verwant organisme). Zo n proces kan plaatsvinden middels homologe recombinatie. Daarnaast moet beoordeeld worden in hoeverre erfelijke informatie van het ggo via de kiembaan overgedragen kan worden op het nageslacht. Overdracht van erfelijke informatie op zichzelf hoeft niet altijd te leiden tot een gevaar voor mens en milieu. Als overdracht kan optreden maar er geen negatieve effecten geïdentificeerd kunnen worden is er geen sprake van een milieurisico. De overheid heeft besloten dat overdracht via de kiembaan op het nageslacht in alle gevallen voorkomen moet worden, onafhankelijk van de vraag of er daarbij schadelijke effecten kunnen optreden. Veranderingen van populatiedynamiek in natuurlijke milieu s (toelichting op onderdeel III) Genetisch gemodificeerde organismen die in klinische studies toegepast worden kunnen ook een effect hebben op het voorkomen van andere (hogere) organismen en zodoende een effect hebben op de populatiedynamiek. Een illustratief voorbeeld betreft een doelbewuste introductie in het milieu van een virulent myxomavirus in de gevoelige populatie van Europese konijnen in Australië. Aanvankelijk waren de gevolgen desastreus voor de konijnenpopulatie. Maar uiteindelijk ontstonden er virusvarianten met een verminderde virulentie maar ook konijnen met een verhoogde resistentie tegen het virus. Dit voorbeeld illustreert dat een verandering van in de natuur aanwezige micro-organismen ook een effect kan hebben op de gastheer (konijn). Ook een veranderde eigenschap van het gastheerorganisme ten gevolge van genetische modificatie zou een dergelijk effect kunnen veroorzaken. Op deze aspecten wordt, indien het voor de specifieke beoordeling relevant is, ingegaan in onderdeel G van Tabel 2. Het in gevaar brengen van preventieve of therapeutische behandelmethoden (toelichting op onderdeel V) Veranderde eigenschappen van een organisme ten gevolge van genetische modificatie kan mogelijk tot gevolg hebben dat dit organisme ziekte kan veroorzaken. Als hierdoor de op dat moment geldende medische praktijk direct of indirect niet meer toegepast kan worden voor behandeling van deze ziekten, of wanneer preventieve behandeling niet meer werkt is er sprake van een negatief effect voor het milieu. Daarom moet, als vastgesteld wordt dat een ggo mogelijk ziekteverwekkende eigenschappen bezit, in beschouwing genomen worden welke therapeutische behandelmethoden beschikbaar zijn om de ziekte te bestrijden of te voorkomen. Indien de genetische modificatie de therapeutische behandeling van de ziekte bemoeilijkt of zelfs in gevaar brengt, moet dit in de risicobeoordeling meegewogen worden. Er kan tijdens de beoordeling ook vastgesteld worden dat het ontstaan van ziekte onwaarschijnlijk is, in dat geval kan mogelijk afgezien worden van een beoordeling van de mogelijke effecten op preventieve en therapeutische behandelmethoden. Op deze aspecten wordt ingegaan in onderdeel H van Tabel 2. In de Richtlijn 2001/18/EG wordt, na de vaststelling van de beoordelingsaspecten, een methodologie voor de risicoanalyse ontwikkeld. Deze methodologie wordt gevolgd in de tabellen in deel 2. De mogelijk schadelijke effecten die samen kunnen hangen met de nieuw ingebrachte sequenties worden Ministerie van IenM IM /00 Pagina 4 / 34

5 toegelicht. Daarbij worden de verschillende stappen in de oorzaak-gevolg relaties tussen de genetische modificatie en het eventuele schadelijke effect verduidelijkt. Zo wordt bepaald welke effecten eventueel toe te schrijven zijn aan de genetische modificatie. Vervolgens volgt de evaluatie van de eventuele omvang en de waarschijnlijkheid van de schadelijke gevolgen. Redenen voor het niet verder in de milieurisicoanalyse beschouwen van mogelijke schadelijke effecten worden verduidelijkt. In Deel 3 vindt tenslotte de bepaling van het algehele risico van het ggo plaats. Deze bepaling wordt gedaan op basis van de risico s die in Deel 2 zijn geïdentificeerd, waarbij rekening wordt gehouden met de mogelijkheid dat er stapeling van risico s plaatsvindt, in het bijzonder als de risico s niet onafhankelijk van elkaar zijn. Ministerie van IenM IM /00 Pagina 5 / 34

6 Milieurisicoanalyse behorend bij aanvraag IM Titel aanvraag: Oncolytic adenovirus therapy using a prostate-specific conditionally replication-competent adenovirus as an adjuvant treatment for localised prostate cancer. DEEL 1. KENMERKEN VAN DE IN DEZE AANVRAAG GEBRUIKTE GGO S EN HUN INTRODUCTIE Samenvatting van de gegevens zoals die zijn aangeleverd door de aanvrager. Deze gegevens dienen als basis voor de milieurisicoanalyse van de aangevraagde werkzaamheden en bestaan uit de relevante technische en wetenschappelijke details van de GGO s en de voorgestelde wijze van introductie. Hierbij wordt rekening gehouden de informatievereisten zoals genoemd in bijlage III en in het bijzonder bijlage IIIA van Richtlijn 2001/18/EC. De vindplaats van de informatie in het dossier is tussen haakjes aangegeven. Informatie van bureau GGO is met een asterisk (*) aangegeven. A. Het ouderorganisme, i.c. de gebruikte virale vector 1. Als uitgangsvector voor het GGO is gebruik gemaakt van het humaan adenovirus subgenus C, serotype 5 (Ad5). Dit virus behoort tot de genus Mastadenovirus van de familie Adenoviridae (A2.1). 2. Adenovirussen hebben een dubbelstrengs DNA genoom van totaal 36 kilobasen (kb)*. 3. De mens is de natuurlijke gastheer voor Ad5 (A2.2). 4. Dieren worden niet gemakkelijk geïnfecteerd met Ad5. Onder laboratorium omstandigheden kan weliswaar infectie en replicatie van Ad5 worden bewerkstelligd in diersoorten, zoals het varken, maar dit wordt als niet relevant voor de natuurlijke transmissie beschouwd (A2.2)*. 5. Ad5 is een humaan adenovirus van pathogeniteitsklasse 2 hetgeen inhoudt dat het virus een milde ziekte in de mens induceert. Ad5 komt in alle delen van de wereld voor (A2.3, A2.4). 6. Adenovirussen zijn niet geassocieerd met de ontwikkeling van kanker in de mens (A2.4). 7. Infecties met Ad5 zijn in immuuncompetente personen zelflimiterend (A2.3, A2.4, A2.13). 8. Ad5 kan verkoudheid veroorzaken door infectie van de slijmvliezen en lymfeklieren van de luchtwegen. Symptomen die daarbij kunnen optreden zijn koorts, hoesten, verstopping van de neus en een zere keel. Luchtweginfecties komen met name voor in kinderen. Hierdoor hebben de meeste volwassenen al meerdere Ad5 infecties doorgemaakt. In de meeste gevallen verloopt een infectie zonder of met milde symptomen en is geen verdere behandeling nodig (A2.4). 9. Het merendeel van de humane populatie is al eens met Ad5 geïnfecteerd en is daardoor seropositief voor het virus (A2.2). 10. In ernstig immuungecompromitteerde patiënten zoals HIV patiënten, beenmergtransplantatie patiënten en orgaantransplantatie patiënten kan systemische infectie met Ad5 ernstige en fatale consequenties hebben (A2.4). 11. Ad5 infecteert en repliceert in humane epitheliale cellen, met name in de luchtwegen. Binding aan de coxsackie-adenovirus receptor (CAR) is de belangrijkste infectie route voor Ad5 in de mens. Infectie treedt op door binding van het fiber eiwit van Ad5 aan CAR die op epitheliale cellen tot expressie komt. De rol van een andere route van infectie, via binding van Ad5 aan heparaan sulphaat proteoglycanen in de lever wordt in de mens als beperkt beschouwd door snelle inactivatie van Ad5 in de circulatie via binding aan rode bloedcellen (erythrocyten). Tijdens infectie internaliseert de gastheercel het adenovirale deeltje via receptor-gemedieerde endocytose. Dit proces wordt bewerkstelligd door binding van Ad5 aan cellulaire integrine eiwitten (A2.2, aanvullende informatie ). 12. Adenovirus repliceert door gebruik te maken van de DNA transcriptie machinerie van de gastheercel. Als gevolg hiervan treedt lysis (openbreken van de cel) van de geïnfecteerde gastheercel op en komen virusdeeltjes vrij die weer andere cellen kunnen infecteren (A2.2). Ministerie van IenM IM /00 Pagina 6 / 34

7 13. Bij toediening in de circulatie in de mens wordt Ad5 snel geïnactiveerd door erythrocyten door binding aan CAR en de complement receptor 1 die op deze cellen tot expressie komt (A2.2, A4.1, aanvullende informatie ). 14. In Ad5 wordt expressie van het E1A gen gereguleerd door een adenovirale promoter. Dit leidt tot een non-selectieve replicatie, wat inhoudt dat replicatie en cytotoxiciteit in elke geïnfecteerde humane epitheliale cel kan plaatsvinden (A2.8, A2.12, A2.13). 15. Ad5 kan als een latente infectie voor jaren persisteren in lymfeknopen en de amandelen en kan tot maanden na de initiële infectie vrijkomen via de ontlasting (A2.5). 16. Er zijn geen aanwijzingen dat verticale transmissie van Ad5 kan optreden. Ad5 kan in het genoom integreren en in studies in muizen werd weliswaar expressie van CAR op gonade cellen gedetecteerd en werd infectie van gonade cellen waargenomen, maar dit heeft niet geresulteerd in kiembaantransmissie (A2.5, A4.2, aanvullende informatie ). 17. Luchtweginfecties van Ad5 worden gewoonlijk naar derden overgedragen door aërosolen die vrijkomen tijdens hoesten en niezen van geïnfecteerde personen. Ad5 kan zich ook verspreiden door direct contact, via de oro-fecale route en soms via water (A2.5). 18. Studies hebben aangetoond dat door casueel contact geen horizontale overdracht van Ad5 optreedt van gezonde geïnfecteerde vrijwilligers naar derden (A2.5) 19. Ad5 is buiten de gastheer vrij stabiel (dagen tot weken) en is resistent tegen verschillende chemische en fysische agentia (A2.6)*. 20. Adenovirale infecties kunnen effectief worden behandeld met het aspecifieke antivirale middel cidofivir (A2.4). B. De genetische modificatie: 21. Het GGO Ad[I/PPT-E1A] is een conditioneel replicatie-competent virus gebaseerd op een adenoviraal genoom waarin de E1A, E1B en E3 genen (inclusief regulatoire sequenties) zijn verwijderd en waaraan het E1A gen van adenovirus serotype 2 (Ad2) is toegevoegd (A2.7, A2.9). 22. Het GGO is vervaardigd met behulp van het AdEAsy systeem. Door homologe recombinatie in bacteriën is de I/PPT-E1A sequentie van de pshuttle vector naar de padeasy-1 vector (deze vector bevat een Ad5 genoom waarin de E1 en E3 genen zijn gedeleteerd) overgedragen. Vervolgens zijn de in de padeasy-1 vector aanwezige bacteriële ori en antibioticum resistentie genen verwijderd door middel van restrictie enzym digestie. Virus productie vindt plaats door transfectie van het gelinearizeerde plasmide in de adenovirus packaging cellijn HEK293 (A2.7, A2.10, A2.11, aanvullende informatie ). 23. Expressie van E1A (van Ad2) in het GGO staat onder controle van een prostaat-specifieke regulatoire sequentie genaamd I/PPT. Hierdoor kan het GGO uitsluitend in prostaatcellen repliceren (A1.2, A2.7, A2.8). 24. De prostaat-specifieke regulatoire sequentie (I/PPT) bestaat uit de muis H19 insulator (I) en drie humane prostaat-specifieke elementen: de prostaat specifieke antigen (PSA) enhancer, de prostaat specifieke membraan antigen (PSMA) enhancer en de T-cell receptor gamma-chain alternate reading frame protein (TARP) promoter (tezamen PPT) (A2.7, A2.9, aanvullende informatie ). 25. Een insulator is een DNA element dat het vermogen heeft om een transgene cassette te beschermen tegen interfererende signalen uit de omgeving, door het blokkeren van de actie van een distale enhancer op een promoter of door op te treden als een barrière die voorkomt dat silencing effecten optreden veroorzaakt door aanwezigheid van gecondenseerd chromatine. De muis H19 insulator (I) in het GGO dient als een schild die de regulatoire PPT sequentie beschermt tegen de invloed van interfererende adenovirale sequenties. De aanwezigheid van de H1 insulator sequentie is essentieel bevonden voor volledige activiteit en specificiteit van het GGO. De geinserteerde insulator sequentie in Ad[I/PPT-E1A] resulteert niet in een eiwit (A2.7, A2.9). 26. Expressie van het E1A gen is essentieel voor replicatie van adenovirus. E1A gaat een interactie aan met verschillende eiwitten in de gastheercel zoals regulatoire eiwitten, eiwitten betrokken bij chromatine remodellering en transcriptiefactoren. Op deze manier stimuleert het E1A gen transcriptie van Ministerie van IenM IM /00 Pagina 7 / 34

8 adenovirale genen en replicatie van het virus. Het E1A gen van Ad2 is functioneel vergelijkbaar met het E1A gen van Ad5. Er zijn geen functionele verschillen bekend tussen de E1A transcripten van verschillende adenovirus serotypen (A2.7, A2.8, A2.9). 27. Eén van de belangrijkste functies van het adenovirale E1B gen is de stimulering van virale replicatie door het voorkomen van apoptose (celdood) door inactivatie van de cellulaire p53 signaalroute. Deletie van het E1B gen kan leiden tot een verminderde pathogeniteit van het virus doordat in afwezigheid van het E1B gen premature geprogrammeerde celdood niet kan worden voorkomen (A2.8, A2.10, A2.14). 28. E3 genen zijn betrokken bij de controle van de immuunrespons van de gastheer en bij de inductie van celdood en het vrijkomen van het virus. Door deletie van de E3 genen is het GGO verminderd pathogeen ten opzichte van het oudervirus aangezien het virus gemakkelijker door het immuunsysteem herkend kan worden. Hierdoor verloopt de inductie van celdood van geïnfecteerde cellen, gevolgd door het vrijkomen van virale partikels en infectie van aangrenzende cellen, minder efficiënt (A2.8, aanvullende informatie ). 29. De genoomgrootte van het GGO is 99.2% ten opzichte van het wildtype Ad5. Het adenovirus is stabiel voor zover de genoomgrootte niet meer dan 105% van het wildtype genoom bedraagt (aanvullende informatie )*. Tabel 1. Vaststelling van de bij de genetische modificatie ingebrachte of verwijderde sequenties Coderende sequenties gebruikt voor Herkomst Plaats in de vector Effect in de patiënt genetische modificatie Deletie E1A gen Ad5 n.v.t Het GGO is als gevolg hiervan replicatiedeficiënt m.u.v. prostaatcellen waarin restoratie van E1A expressie plaatsvindt Deletie E1B gen Ad5 n.v.t Het GGO is als gevolg van de deletie verminderd pathogeen Deletie E3 genen Ad5 n.v.t Het GGO is als gevolg van de deletie verminderd pathogeen H19 insulator muis tussen adenovirale encapsidatie signaal en PSMA enhancer Beschermt PPT sequentie tegen de invloed van interfererende adenovirale sequenties PSMA enhancer mens tussen H1 insulator en PSA enhancer Prostaat specifieke regulatie E1A expressie PSA enhancer mens tussen PSMA enhancer en TARP promoter Prostaat specifieke regulatie E1A expressie TARP promoter mens Tussen PSA enhancer en E1A Prostaat specifieke regulatie E1A gen E1A gen Ad2 Tussen TARP promoter en adenovirale E2 gen Ministerie van IenM IM /00 Pagina 8 / 34 expressie Restoratie E1A expressie en adenovirale replicatie in prostaat cellen

9 C. Het GGO: 30. Het GGO is geattenueerd ten opzichte van wildtype Ad5 door de gecontroleerde expressie van E1A en de deletie van de E3 en E1B genen (A2.8). 31. Replicatie van Ad[I/PPT-E1A] en het resulterende cytotoxische effect is (in tegenstelling tot wildtype Ad5 dat in alle geïnfecteerde humane epitheliale cellen kan repliceren) beperkt tot prostaat cellen, omdat expressie van het voor replicatie essentiële E1A eiwit gecontroleerd wordt door het prostaatspecifiek regulatoir element. Hierdoor kan het GGO uitsluitend prostaatcellen doden (A1.2, A2.7, A2.8, A2.12, A2.13, A4.2). 32. Gebaseerd op preklinische resultaten met betrekking tot de specificiteit van Ad[I/PPT-E1A], is het zeer onwaarschijnlijk dat infectie van niet-prostaat cellen met Ad[I/PPT-E1A] zal resulteren in cytotoxiciteit door geen of geringe replicatie. In het worst-case scenario dat de mate van replicatie voldoende zou zijn voor het induceren van een bepaalde mate van cytotoxiciteit, zullen de pathogene effecten vergelijkbaar zijn met die van het oudervirus Ad5 (A2.13). 33. Verspreiding van het GGO naar medisch personeel kan optreden door morsen van het GGO gedurende de preparatie of toediening, of door blootstelling aan weefsels die het GGO kunnen bevatten (A4.1). 34. Het GGO zal geïnjecteerd worden op 4 plaatsen in de prostaat. In theorie kan het virus vanuit de prostaat naar de circulatie of naar andere delen van het urogenitale systeem lekken. Hierdoor kan het virus in bloed en/of urine terechtkomen. Verder kan het virus zich naar het sperma verspreiden aangezien gedurende de ejaculatie prostaatvloeistof aan het sperma wordt toegevoegd. Er is een risico dat shedding via de urine of het sperma kan optreden en dit risico kan dosis-afhankelijk zijn (A2.14, A4.1). 35. Het GGO wordt transrectaal in de prostaat geïnjecteerd. Er is een gering risico dat lekkage in het rectum zal optreden, resulterend in uitscheiding van het GGO via de ontlasting. Dit risico is dosis-onafhankelijk en hangt met name af van lekkage vanuit de naald gedurende injectie. Uitscheiding via deze route zal uitsluitend gedurende de eerste ontlasting na toediening optreden (A4.1). 36. Biodistributie van het GGO naar andere excreterende organen die geen onderdeel zijn van het urogenitaal systeem, zoals de speekselklieren en het colon, kan uitsluitend via de circulatie plaatsvinden. Hiervoor is lekkage van het virus vanuit de prostaat in het bloed gevolgd door penetratie van het virus van het bloed naar de excreterende delen van deze organen noodzakelijk. Verspreiding van het GGO via de circulatie zal beperkt zijn vanwege de lokale toediening in de prostaat. Indien virus in de circulatie lekt zal het snel worden geneutraliseerd door het immuunsysteem en door binding aan erythrocyten. Het is daarom zeer onwaarschijnlijk dat het virus zich zal verspreiden via het bloed naar speeksel, faeces of andere excreta (A2.14, A4.1, aanvullende informatie ). 37. Door recombinatie in de productiecellijn kunnen de volgende recombinanten ontstaan: - een recombinant waarin het Ad2 E1A insert is vervangen door het Ad5 E1A insert uit het genoom van de packaging cellijn HEK293. Deze recombinatie heeft geen invloed op de functionaliteit of pathogeniteit van Ad[I/PPT-E1A], aangezien er geen functionele verschillen zijn tussen het E1A transcript van Ad2 en Ad5. - introductie van het E1B gen uit het genoom van de packaging cellijn HEK293 in Ad[I/PPT-E1A]. Deze variant kan efficiënter repliceren in de prostaat dan Ad[I/PPT-E1A] in cellen met een intacte p53 signaalroute. In de vectorbatch wordt 1 E1B bevattend virusdeeltje per miljoen deeltjes Ad[I/PPT- E1A]) gedetecteerd. - een recombinant waarin de I/PPT regulatoire regio is vervangen door de E1A promoter uit het genoom van de packaging cellijn HEK293, resulterend in een variant gelijkend op E1B gedeleteerde vectoren, zoals Onyx-015, waarvan de veiligheid reeds eerder in klinische studies is aangetoond. Deze variant kan non-selectief repliceren hetgeen mogelijk leidt tot efficiëntere generatie van Ad[I/PPT-E1A] gerelateerde partikels in de prostaat. - een recombinant waarin naast introductie van het E1B gen, de I/PPT regulatoire regio is vervangen door de wildtype E1A promoter uit het genoom van de packaging cellijn HEK293, overeenkomend met een wildtype-achtig Ad5 met deletie van het E3 gen. Deze variant is pathogener ten opzichte van Ad[I/PPT-E1A] aangezien deze non-selectief en efficiënter kan repliceren, maar is minder pathogeen dan wildtype Ad5 (A2.10, A2.14). Ministerie van IenM IM /00 Pagina 9 / 34

10 38. Door recombinatie van Ad[I/PPT-E1A] met wildtype Ad5 in de patiënt kunnen de volgende recombinanten ontstaan: - een recombinant waarin het Ad2 E1A insert is vervangen door het Ad5 E1A insert. Deze recombinatie heeft geen invloed op de functionaliteit of pathogeniteit van Ad[I/PPT-E1A], aangezien er geen functionele verschillen zijn tussen het E1A transcript van Ad2 en Ad5 (A2.10, A2.14). - introductie van het E1B gen van Ad5 in Ad[I/PPT-E1A]. Deze variant kan efficiënter repliceren in de prostaat dan Ad[I/PPT-E1A] in cellen met een intacte p53 signaalroute. In de vectorbatch wordt 1 E1B bevattend virusdeeltje per miljoen deeltjes Ad[I/PPT-E1A]) gedetecteerd. - introductie van het E3 gen in Ad[I/PPT-E1A], dit zal resulteren in een recombinant die resistenter is voor het immuunsysteem van de patiënt en daardoor mogelijk langer kan persisteren. - een recombinant waarin de I/PPT regulatoire regio is vervangen door de wildtype E1A promoter van het Ad5 genoom, resulterend in een variant gelijkend op E1B gedeleteerde vectoren, zoals Onyx-015, waarvan de veiligheid reeds eerder in klinische studies is aangetoond. Deze variant kan non-selectief repliceren hetgeen mogelijk leidt tot efficiëntere generatie van Ad[I/PPT-E1A] gerelateerde partikels in de prostaat. - een combinatie van de bovenstaande recombinaties, leidend tot de introductie van het E1B gen en/of de introductie van het E3 gen en/of de vervanging van de I/PPT regulatoire regio door de wildtype E1A promoter. Dit zal resulteren in non-selectieve en efficiëntere replicatie, leidend tot vorming van meer Ad[I/PPT-E1A]) gerelateerde partikels in de prostaat (A2.14). 39. De bovenstaande recombinatie gebeurtenissen kunnen de selectiviteit van replicatie, efficiëntie van replicatie en persistentie beïnvloeden maar zijn niet van invloed op de verspreidingsroute van het virus (A2.14). 40. Het is zeer onwaarschijnlijk dat de recombinatie van Ad[I/PPT-E1A] met wildtype Ad5 in de patiënt zal optreden. De prostaat is geen preferentieel orgaan voor wildtype Ad5 waardoor de hoeveelheden Ad5 in de prostaat in geval van een luchtweginfectie met wildtype Ad5 in de patiënt zeer laag zullen zijn. Bovendien worden Ad[I/PPT-E1A] en wildtype Ad5 in de circulatie snel geneutraliseerd door het immuunsysteem van de patiënt en door binding aan erythrocyten, hetgeen de kans op recombinatie verlaagd. Hierdoor is ook de kans dat Ad[I/PPT-E1A] in de luchtwegen terechtkomt zeer klein (A2.14, A4.3). 41. Indien recombinatie met wildtype Ad5 zou optreden dan worden recombinanten gegenereerd die pathogener kunnen zijn dan Ad[I/PPT-E1A], maar die in het ergste geval karakteristieken zullen hebben die gelijk zijn aan die van wildtype Ad5. Deze varianten kunnen in geval van transmissie naar derden verkoudheid veroorzaken. Aangezien de patiënt in dit geval al een wildtype Ad5 infectie heeft en grote hoeveelheden wildtype Ad5 in het milieu zal uitscheiden, zal de bijdrage aan schadelijke effecten in het milieu door blootstelling aan Ad[I/PPT-E1A] recombinanten verwaarloosbaar klein zijn (A2.14, A4.2). 42. De aanwezigheid van wildtype Ad5 in door Ad[I/PPT-E1A] geïnfecteerde cellen kan de replicatie van Ad[I/PPT-E1A] faciliteren en de persistentie verlengen, doordat de ontbrekende genen in het GGO worden gecomplementeerd door de transcripten van het wildtype genoom. Het E1A gen van wildtype Ad5 wordt in dit geval gebruikt voor de replicatie van Ad[I/PPT-E1A] en Ad[I/PPT-E1A] zal zich hierdoor als wildtype Ad5 gedragen. Een dergelijk effect is echter tijdelijk en zelflimiterend en heeft een verwaarloosbaar effect op de verspreiding van het GGO. Gezien de plaats van toediening en de weefselpreferentie van wildtype Ad5 is het bovendien uiterst onwaarschijnlijk dat een dergelijke simultane infectie zal optreden (A2.14). 43. Het tropisme van het GGO is ongewijzigd door de genetische modificaties. Gastheer specificiteit en cel tropisme van het GGO en potentiële recombinanten die kunnen worden gegenereerd gedurende de productie of door recombinatie met wildtype Ad5 in de patiënt zijn vergelijkbaar met wildtype Ad5 (A2.12). 44. Het pathogene effect van Ad[I/PPT-E1A] en potentiële recombinanten is in de cellen waarin deze in staat zijn te repliceren, identiek aan het wildtype Ad5 uitgangsvirus. Door replicatie en expressie van adenovirale eiwitten zal de geïnfecteerde cel uiteindelijk worden gedood, waarna aangrenzende cellen kunnen worden geïnfecteerd (A2.13). Ministerie van IenM IM /00 Pagina 10 / 34

11 45. Infectie van de prostaat van een derde door blootstelling aan het GGO kan niet plaatsvinden. In geval van blootstelling van een derde aan het GGO kan het GGO de prostaat niet bereiken aangezien het virus niet door fysiologische barrières zoals de vasculaire en rectale wand en omringende weefsel kan breken. Bovendien wordt het virus in de circulatie snel afgebroken (A4.3). D. Milieugerelateerde gegevens afkomstig uit eerdere experimenten 46. In vitro studies bevestigen de specificiteit van Ad[I/PPT-E1A] voor prostaatcellen. Er is geen replicatie en toxiciteit van Ad[I/PPT-E1A] waargenomen in primaire cel kweken van onder andere humane vasculaire endotheel cellen, bronchio-epitheliale cellen, urotheliale cellen en hepatocyten. Slechts bij fysiologisch irrelevante waarden (een ratio van 50 of hoger van het aantal virusdeeltjes ten opzichte van het aantal doelwitcellen) werd toxiciteit voor hepatocyten waargenomen, maar de dood van de hepatocten kon niet worden gerelateerd aan replicatie maar aan ophoping van virusdeeltjes in het cytoplasma van de hepatocyten (A3.1, aanvullende informatie ). 47. Er bestaat geen optimaal proefdiermodel om de effecten van Ad[I/PPT-E1A] in de mens na te bootsen. Het tropisme van het GGO is beperkt tot de mens en andere diersoorten hebben een sterk verminderde permissiviteit. Daarnaast repliceert het GGO alleen in humane prostaatcellen. Er is daarom gekozen voor de NMRI (Naval Medical Research Institute) muis als geschikt model voor toxiciteitsstudies. Deze muizen zijn een goed gekarakteriseerd proefdiermodel voor toxicologie onderzoek en hebben een intact immuunsysteem waardoor immunologische effecten op het GGO ook geanalyseerd kunnen worden. Bij de proefopzet is gekozen om de effecten van grote hoeveelheden circulerend GGO op andere organen te bestuderen en hiermee te analyseren of lekkage van het GGO uit de prostaat in de circulatie veiligheidsrisico s voor de patiënt met zich meebrengt. Aangezien het GGO niet repliceert in de muizenprostaat en onbekend is of eventuele lekkage vergelijkbaar is met de humane situatie, is gekozen is voor een intraveneuze toediening (aanvullende informatie ). 48. Intraveneuze injectie van 2x10 8, 2x10 9 en 2x10 10 (respectievelijk 0.1x, 1x of 10x de klinische dosis van 5x10 12 virale partikels (vp) Ad[I/PPT-E1A] gecorrigeerd voor het gewicht van de muis) werd goed getolereerd door mannelijke NMRI muizen zonder toxische effecten op de bestudeerde organen. Dit experiment representeert een worst-case klinisch scenario waarbij alle Ad[I/PPT-E1A] partikels vanuit de prostaat in de circulatie zijn gelekt. Biodistributie van het virus naar hersenen, lever, hart, milt, nier, long, prostaat en testis werd bestudeerd met een kwalitatieve PCR. Ad[I/PPT- E1A] werd in de lever en de milt gedetecteerd op dag 1, dag 10 en dag 30 na toediening bij alle dosi. Bij de laagste dosis waren alleen de milt en de lever positief. Met toenemende dosis werd viraal DNA ook in andere organen gedetecteerd (bij de 1x dosis in nieren en longen op dag 1, 10 en 30 en in hart op dag 1 en 10, bij de 10x dosis ook op dag 30 in hart en op dag 1, 10 en 30 in prostaat en testis). Uit deze data kan worden geconcludeerd dat biodistributie van systemisch toegediend Ad[I/PPT-E1A] correleert met de dosis en de bloeddoorstroming van organen (lever en milt zijn de best doorbloede organen). Extrapolatie van deze data naar de mens wordt gehinderd door het feit dat in de mens Ad5 in de circulatie wordt weggevangen door erythrocyten, hetgeen niet optreedt in muizen. Bij 1x en 10x de dosis trad lymfoide vergroting van de milt op die zeer waarschijnlijk gerelateerd is aan een immuunrespons. Bovendien trad afzetting van glycogeen depots in de lever op, waarvan de oorzaak onbekend is, maar waarvan wordt aangenomen dat dit gerelateerd is aan de intraveneuze behandeling met het GGO (A3.1, aanvullende informatie en ). 49. Deze preklinische data tonen aan dat het virus niet cytotoxisch is voor niet-prostaat primaire cellen en organen (A3.1) 50. Er zijn nog geen klinische studies met Ad[I/PPT-E1A] in de mens uitgevoerd. Data uit eerdere klinische studies met vergelijkbare oncolytische adenovirussen laten zien dat selectieve replicatie van oncolytische adenovirussen in patiënten plaatsvindt (A2.13, A3.1). 51. Onyx-015 een E1B/E3 gedeleteerd replicerend adenovirus is aan meer dan 200 patiënten in klinische studies toegediend. Toediening in de hepatische arterie en intraveneuze, intraperitoneale en intratumorale toediening tot een dosis van 2x10 12 vp werden goed getolereerd en geen maximaal tolereerbare dosis kon worden aangetoond. Verder werden in deze studies tumor-selectieve replicatie en anti-tumor activiteit aangetoond. Onyx-015 is Ministerie van IenM IM /00 Pagina 11 / 34

12 niet in patiënten met prostaatkanker getest. Onyx-015 kan na intratumorale toediening in de circulatie lekken, maar er zijn nauwelijks data beschikbaar over uitscheiding naar excreta (A2.13, A3.1). 52. Voor prostaatkanker zijn 5 klinische studies uitgevoerd met vier verschillende oncolytische virussen: Ad5-CD/TKrep, een E1B/E3 gedeleteerde vector die cytosine deaminase (CD) en herpes simplex virus-1 thymidine kinase (HSV-TK) suicide genen tot expressie brengt, Ad5-yCD/mutTKSR39rep-ADP is een E1B en (gedeeltelijk) E3 gedeleteerde vector die één van de E3 genen (het Adenovirus Death Protein) en een verbeterde versie van CD/HSV- TK tot expressie brengt, CV706, een E3 gedeleteerde prostaat-specifieke vector waarin replicatie onder controle staat van de PSA promoter en CG7870, een E3-bevattende prostaat-specifieke vector waarin E1A onder controle staat van de rat probasin promoter en E1B onder controle van de PSA promoter-enhancer. In vergelijking met Ad[I/PPT-E1A], zijn Ad5-CD/TKrep en Ad5-yCD/mutTKSR39rep-ADP niet prostaat-specifiek en brengen zij suicide genen tot expressie voor combinatie therapie met 5-fluorocytosine and ganciclovir. CV706 lijkt sterk op Ad[I/PPT-E1A], maar een verschil is de hormoon-afhankelijkheid voor replicatie van CV706 door aanwezigheid van de PSA promoter en de aanwezigheid van het E1B gen. CG7870 bevat in tegenstelling tot Ad[I/PPT-E1A] de E1B en E3 genen. Lokale toediening van replicatie-competent virus in de prostaat (4 studies met Ad5-CD/TKrep, Ad5-yCD/mutTKSR39rep-ADP en CV706) werd goed getolereerd door de behandelde patiënten. In de studie waarbij het virus (CG7870) in de circulatie werd toegediend werd de dosis-escalatie gestopt bij een dosis van 6x10 12 vp, vanwege indicaties van levertoxiciteit bij een dosis hoger dan 1x10 12 vp. In deze studies werden indicaties voor anti-tumoractiviteit gevonden (A2.13, aanvullende informatie ). 53. Er zijn biodistibutie en shedding data beschikbaar voor de replicatiecompetente vectoren die in de prostaat zijn toegediend. Na intraprostaat injectie van 1x x10 12 Ad5-CD/TKrep in 2 klinische studies kon viraal DNA gedetecteerd worden tot 11 weken na toediening (kwalitatieve PCR), maar kon geen infectieus virus in het bloed of in de urine worden gedetecteerd (cytopathisch effect assay op A549 cellen met een detectielimiet 100 vp/ml). Na intraprostaat toediening van 1x x10 13 vp CV706 kon viraal DNA vanaf dag 15 na toediening niet meer in het bloed worden aangetoond (kwantitatieve PCR, detectielimiet 1300 kopieën/ml). De lekkage van het virus vanuit de prostaat in het bloed was op zijn maximum (op dag 2-8) minder dan 2% van de toegediende dosis. In deze studie is het bloed niet op infectieus virus getest. Shedding van infectieus CV706 virus via de urine kon de eerste week na toediening met een biologische assay worden aangetoond (plaque assay, detectielimiet 50 pfu/ml) (A3.1, A4.2). 54. In een eerdere klinische studie met een replicatiedeficiënte adenovirale vector als adjuvant voor radicale prostatectomie (dosis 2x x10 12 vp) die door de aanvrager is uitgevoerd waren virale culturen van urine en keeluitstrijkjes genomen op dag 2 en dag 7 na toediening negatief (A3.1, aanvullende informatie ). 55. In eerdere klinische trials met replicatiedeficiënte Ad5 vectoren is door analyse (door middel van het testen op het voorkomen van replicatie-competent adenovirus met behulp van een viruskweek of door middel van een PCR assay) geen bewijs van het in vivo optreden van recombinatie tussen de adenovirale vectoren met wildtype Ad5 gevonden (A3.1). 56. Gezien de resultaten uit de klinische studies en de bekende humane neutralisatie mechanismen voor systemisch Ad5 is het niet waarschijnlijk dat wijdverspreide biodistributie van Ad[I/PPT-E1A] naar andere organen na intraprostaat toediening zal optreden. Kortdurende shedding van minimale hoeveelheden infectieus virus kan optreden via de urine (A3.1, A4.3). E. Patiënt of proefdiergebonden aspecten: 57. Doel van de studie is het ontwikkelen van een nieuw oncolytisch adenovirus als adjuvant therapie naast radicale prostatectomie voor de verbetering van de behandeling van mannen gediagnostiseerd met locale prostaat kanker (A1.7). 58. Het betreft een fase I klinische studie waarin als primair doel de veiligheid en tolereerbaarheid van het oncolytische adenovirus Ad[I/PPT-E1A] als adjuvant therapie voor gelokaliseerde prostaatkanker vóór radicale prostatectomie zal worden bestudeerd (A1.2, A1.8). Ministerie van IenM IM /00 Pagina 12 / 34

13 59. De primaire studieparameter die tijdens de studie zullen worden bestudeerd betreft de dosis limiterende toxiciteit (DLT) van Ad[I/PPT-E1A] tussen en vp. Secundaire paramaters die zullen worden bestudeerd betreffen histopathologische en immunologische veranderingen in bloed en prostaat voor en na toediening (A1.8). 60. In de studie zullen patiënten met lokale prostaatkanker ongeveer drie weken voor radicale prostatectomie worden behandeld met Ad[I/PPT-E1A] met een volume van 1 ml verdeeld over 4 gelijke toedieningsplaatsen. Na toediening in de prostaat zal monitoring van de patiënt op het optreden van potentiële bijeffecten plaatsvinden (A1.2, A1.8, A3.7). 61. Het effect op de prostaat en het immuunsysteem van de patiënt zal worden bestudeerd met een focus op de inductie van anti-tumor immuniteit (A1.2). 62. Maximaal 24 patiënten zullen worden behandeld in de fase I studie (A1.4, A3.5). 63. De studie is een dosis escalatie studie en zal de veiligheid testen van 1x10 11, 1x10 12, 5x10 12 en 1x10 13 vp van het GGO (A3.6). 64. Patiënten zullen worden behandeld in de polikliniek van het Erasmus MC en zullen onmiddellijk na behandeling met het GGO worden ontslagen (A3.9). 65. Injectie van het virus in de prostaat zal plaatsvinden onder visuele controle door echografie (transrectale ultrasound) (A1.3, A3.7). 66. De patiënten komen 3 weken, 6 weken en 12 weken na de operatie op controle, en daarna elke 3 maanden in het eerste jaar. Vervolgens vindt elke zes maanden in het tweede jaar en daarna jaarlijkse controle plaats. Bij deze routine controles zal fysieke examinatie plaatsvinden en zal serum PSA worden bepaald. Bovendien zal in het eerste jaar na de operatie bloed worden verzameld voor evaluatie van de therapie geïnduceerde immuunrespons (A1.3). 67. Bloed, urine, prostaatweefsel en lymfeklieren zullen van de patiënten worden verzameld voor klinische en immunologische monitoring. Bloed en urine zullen worden afgenomen 1, 2, 4, 7, 14 en 21 dagen na virus injectie. Tevens zal bloed worden afgenomen 6, 9 en 15 weken en 7 en 13 maanden na virus injectie. De aanwezigheid van het virus in bloed en urine zal in de monsters die zijn genomen op dag 1-21 worden gemeten met een kwalitatieve PCR om inzicht in de biodistributie en shedding van het virus te verkrijgen (A1.3, A3.8, A4.12, A4.13, aanvullende informatie ). 68. Aanwezigheid van minimale hoeveelheden van het GGO in het bloed en urine in de drie weken tussen injectie en radiale prostatectomie kan niet worden uitgesloten. Shedding kan tot 3 weken na injectie optreden omdat het orgaan als virus reservoir na drie weken wordt verwijderd (A3.8). 69. Ongeveer 21 dagen na toediening van het GGO zullen de patiënten radicale prostatectomie ondergaan. De prostaat en drainerende lymfeklieren zullen na radicale prostatectomie histopatologisch worden onderzocht. Tevens wordt de distributie van het GGO in de prostaat bestudeerd en vindt immunologische monitoring plaats. Weefselmonsters zullen voor verdere analyse naar de betrokken afdelingen worden getransporteerd (A1.3, A3.8). 70. In geval een patiënt besluit om geen radicale prostatectomie te ondergaan zal het virus op basis van de beschikbare data uit de literatuur binnen een maand uit de prostaat zijn geëlimineerd (A4.9). 71. De prostaat en lymfeklieren die tijdens de radiale prostatectomie zullen worden verwijderd worden getest op histopathologie, distributie van het GGO en infiltratie van witte bloedcellen. Het virus zal in de prostaat aanwezig zijn (A3.8, A4.13, aanvullende informatie ). F. Informatie over plannen voor beheersing, controle, follow-up en afvalbehandeling: 72. De klinische studie zal plaatsvinden in het Erasmus Medisch Centrum te Rotterdam. In de ziekenhuisapotheek van het Erasmus MC zal opslag en bereiding van het GGO voor toediening in de patiënt plaatsvinden. Toediening van het GGO en monstername zullen plaatsvinden in de polikliniek van de afdeling Urologie. Analyse van de monsters zal plaatsvinden op de afdelingen Klinische chemie, Virologie, Urologie en Medische Oncologie. Op de afdelingen Urologie en Medische Oncologie zal opslag van samples plaatsvinden. Opslag van het GGO, bereiding en toediening van het GGO, observatie van patiënten, monstername, transport, opslag en processing en analyse van monsters (inclusief monsters die het GGO kunnen bevatten) en verwijdering van afval maken allen deel uit van de vergunningaanvraag (A1.2, A1.3, A1.5, aanvullende informatie en ). Ministerie van IenM IM /00 Pagina 13 / 34

14 73. Vanwege de sterk geattenueerde eigenschappen van het GGO en de verwaarloosbare hoeveelheden van potentiële recombinanten van het GGO worden geen schadelijke effecten van transmissie van het virus of recombinanten verwacht en zijn vanuit het milieurisico oogpunt geen veiligheidsmaatregelen noodzakelijk en worden geen in- of exclusiecriteria vanuit het milieurisico oogpunt opgenomen. Om transmissie van het GGO naar het personeel of naar derden te minimaliseren zullen gedurende de preparatie van het GGO, de toediening, de omgang en eventuele hospitalisatie van de patiënten en de behandeling van biologische monsters die het GGO kunnen bevatten, standaard ziekenhuishygiënische en veiligheidsmaatregelen worden gehanteerd (samengevat in de "Hospital Hygiene Regulations" (Appendix 3)), zoals training van het personeel, toediening in een standaard behandelingskamer, protocollen voor het schoonmaken, het gebruik van beschermende kledij, routine maatregelen voor de behandeling van biologische monsters en voorzorgsmaatregelen die door de patiënt worden genomen. Om directe transmissie te voorkomen zal de patiënten worden gevraagd om in de periode tussen toediening en chirurgische verwijdering van de prostaat tijdens seksueel contact een condoom te gebruiken. Het condoom moet in een plastic zak bij het gewone huisafval worden gedeponeerd en na het weggooien van het condoom moeten de handen goed met zeep worden gewassen (A4.4, A4.5, A4.8, A4.10, A4.15, aanvullende informatie ). 74. Het GGO wordt door de fabrikant als een bevroren suspensie geleverd die niet verder verdund hoeft te worden. Handelingen met het GGO in de ziekenhuisapotheek zullen plaatsvinden in een veiligheidskabinet van klasse 2 gesitueerd binnen een laboratorium waarin ML-II werkvoorschriften worden gehanteerd en dat voldoet aan de ML-II inrichtingsvoorschriften. Hierbij worden werkinstructies van de ziekenhuisapotheek gevolgd die zijn samengevat in de "Hospital Hygiene Regulations" (Appendix 3). Het GGO wordt op de dag van behandeling ontdooid en overgebracht naar een injectiespuit met naald. De injectiespuit wordt na het vullen geplaatst in een lekvrije zak (safetybag) die wordt geplaatst in een schokbestendige koelbox die naar de polikliniek wordt getransporteerd door het medische personeel van de afdeling Urologie (A1.3, aanvullende informatie ). 75. Het reinigen van het veiligheidskabinet zal plaatsvinden volgens het bijgeleverde document Reiniging veiligheidswerkbank voor niet-risicovolle producten en genetisch gemodificeerde micro-organismen (A1.3, aanvullende informatie ). 76. Injectie van het virus zal plaatsvinden in een kamer in de polikliniek die zo is geprepareerd dat deze achteraf goed kan worden gereinigd. Tijdens de toediening is de kamer gelabeld met een biorisico teken. Oppervlakken zijn glad en vrij van objecten; een minimaal aantal objecten is aanwezig in de kamer. In de kamer zijn containers voor verwijdering van GGO-afval en een afsluitbare fles voor opvang van urine aanwezig. De patiënt zal worden gevraagd om onderkleding te verwijderen in een aangrenzende kamer en zal gekleed gaan in een wegwerp jas en slippers. De uroloog en verplegend personeel dragen handschoenen, een mondmasker en een wegwerp jas over hun kledij. Na toediening van het GGO zal de kamer worden schoongemaakt, waarna het biorisicoteken kan worden verwijderd. Vanaf het moment van binnenkomst van de patiënt totdat de kamer is schoongemaakt zal de kamer niet voor andere doeleinden worden gebruikt (A1.3, A4.7). 77. Het is niet uit te sluiten dat het GGO na 3 weken nog aanwezig is in de prostaat, hoewel op basis van de literatuur de te verwachten hoeveelheid virus gering zal zijn. Aangezien het milieurisico van het GGO als verwaarloosbaar klein wordt beschouwd zijn geen specifieke veiligheidsmaatregelen tijdens de operatie noodzakelijk. Voor de operatieve verwijdering van de prostaat en drainerende lymfeklieren wordt de Erasmus MC Veilig werken in de operatiekamer Infectiepreventie richtlijn ZH006WIP gevolgd. Deze richtlijn is opgesteld om ziekenhuispersoneel te beschermen tegen infectie met pathogene micro-organismen waarmee de patiënt potentieel besmet kan zijn. Het volgen van deze richtlijn wordt als voldoende beschouwd om het risico van besmetting van ziekenhuispersoneel te minimaliseren (A4.7, aanvullende informatie ). 78. Door de in- en exclusiecriteria die worden gehanteerd (inclusie van patiënten met een normaal functionerend immuunsysteem, en exclusie van immuungecompromitteerde patiënten) is de kans op verspreiding van het GGO via de circulatie verwaarloosbaar (A4.5). 79. Transport van het GGO en van monsters afkomstig van de patiënten en verwijdering van afval zal plaatsvinden volgens appendix 8 en 9 van de regeling GGO (A1.3, A4.14). Minis terie van IenM IM /00 Pagina 14 / 34

15 G. Productie en Batch 80. Het GGO is geproduceerd volgens het generieke GMP vervaardigingsproces voor adenovirale vectoren door de vector productie faciliteit van het Center for Cell and Gene Therapy (CAGT) in Houston in de Verenigde Staten. Het productieproces van het GGO maakt geen deel uit van de vergunningsaanvraag (A1.3, A3.2, A3.3, A3.4). 81. Het plasmide preparaat dat voor de productie is gebruikt is volledig gesequenced (beide DNA strengen) voordat het naar CAGT voor productie is verzonden (A2.10). 82. Kwaliteitscontrole en preklinische veiligheidstests zullen worden uitgevoerd door CAGT, andere contract research organisaties en door partners in het zogenaamde GIANT consortium (A1.3, A3.2). 83. De klinische batch is geproduceerd in HEK293 cellen, een humane embryonale niercellijn die het adenovirale E1 gen constitutief tot expressie brengt. Deze cellijn wordt veelvuldig gebruikt voor de productie van adenovirale vectoren voor klinisch gebruik (A2.10, A3.3). 84. De kwaliteitscontrole van de klinische batch van het GGO omvat een analyse van recombinanten die het E1B gen bevatten (test op zuiverheid). In de klinische batch is 1 partikel van E1B bevattende recombinanten per miljoen partikels van Ad[I/PPT-E1A] aangetoond met een semi-kwantitatieve PCR met een detectie limiet van 100 virale partikels E1B bevattend virus in een achtergrond van 8x10 10 vp Ad[I/PPT-E1A]. Dit kan ook E1B recombinanten betreffen waarin de wildtype E1A promoter aanwezig is vanwege recombinatie met het gehele E1 gen uit het genoom van de packaging cellijn HEK293. Een dergelijke onzuiverheid van % is ver beneden de grenswaarde voor onzuiverheden die gerapporteerd hoeft te worden aan regulatoire autoriteiten. Gedurende infectie moet 1 partikel van de E1B bevattende recombinant competeren met 1x10 6 partikels van het GGO voor infectie van een doelwitcel. Door deze enorme overvloed van Ad[I/PPT-E1A] partikels is het zeer onwaarschijnlijk dat in geval van blootstelling van een derde efficiënte infectie door E1B bevattende partikels resulterend in amplificatie van deze partikels zal optreden. In overeenstemming hiermee werd geen replicatie en cytotoxiciteit van het klinische product in humane primaire (niet-prostaat) cellen en muizen waargenomen. De hoeveelheden van E1B bevattende recombinanten die tevens de wildtype E1A promoter bevatten waaraan derden kunnen worden blootgesteld zullen daarom irrelevant zijn (A2.10, A3.3, A4.3). 85. De kwaliteitscontrole van de batch (bepaling van o.a. de identiteit, zuiverheid en steriliteit van het GGO), alsmede de afwezigheid van verontreiniging door virussen, bacteriën of schimmels, is onder GMP condities uitgevoerd met diverse algemeen geaccepteerde tests (A3.2, A3.3). 86. De kwaliteitscontrole houdt onder andere in dat de Master Cell Bank en Working Cell Bank van de productie cellijn worden getest op een reeks van virale verontreinigingen, waaronder wildtype adenovirus. Eén van de kwaliteitscontrole testen betreft de in vitro assay voor de aanwezigheid van virale contaminanten. In deze test wordt de aanwezigheid van virale besmettingen geanalyseerd in een humane longcellijn (MRC-5 cellen), een niercellijn van de Afrikaanse groene aap (Vero cellen) en een humane baarmoederhalskankercellijn (HeLa cellen). Deze cellijnen zijn gekozen omdat in deze cellen een groot spectrum aan virussen, met name humane virussen inclusief humaan adenovirus, kunnen groeien. Deze drie celtypes zijn hoog permissief voor humaan adenovirus. Eventuele aanwezigheid van wildtype adenovirus kan daarom met deze test aangetoond worden. In de assay zijn de indicator cellijnen geïnoculeerd met cellysaten van de Master Cell Bank en Working Cell Bank en geïncubeerd. Vervolgens zijn deze kweken gedurende 14 dagen tenminste drie keer per week geanalyseerd op virale cytopathische effecten. Na 14 dagen is het kweekmedium getest op haemadsorptie en haemagglutinatie waarbij gebruik is gemaakt van erythrocyten van kippen, cavia s en rhesusapen. Daarnaast is kweekmedium van dag 14 gebruikt voor een nieuwe inoculatie en is deze tweede inoculatie getest op virale cytopathische effecten tot en met dag 28. Tevens is haemadsorptie en haemagglutinatie na 28 dagen getest. De Master Cell Bank en Working Cell Bank dienen negatief te zijn voor virale cytopathische effecten, haemadsorptie en haemagglutinatie. Als positieve controle voor de MRC-5 cellen is het mazelenvirus gebruikt en voor de Vero cellen en de HeLa cellen het parainfluenza virus type 3. De testresultaten voor zowel de Master Cell Bank en de Working Cell Bank waren negatief. Hieruit kan geconcludeerd worden dat de productiecellijn negatief is voor wildtype adenovirus (A3.3, aanvullende informatie en ). Ministerie van IenM IM /00 Pagina 15 / 34

16 87. Het klinisch GGO product laat bij een extreem hoge dosering van 500 GGO deeltjes per cel geen replicatie zien in humane primaire bronchiale epitheelcellen, endotheelcellen, hepatocyten en urotheelcellen, in tegenstelling tot wildtype adenovirus. Er zijn dus geen aanwijzingen dat wildtype adenovirus afkomstig uit de Master Cell Bank of Working Cell Bank aspecifieke replicatie van het klinisch GGO product zou veroorzaken (aanvullende informatie ). 88. De identiteit van het klinische GGO product is met behulp van western blot (expressie van het E1A eiwit in culturen van prostaat kanker cellen) en door middel van restrictie map analyse vastgesteld (A3.3, aanvullende informatie ). 89. De resultaten van alle uitgevoerde testen op Master Cell Bank, Working Cell Bank de klinische batch vallen binnen de specificaties zoals opgenomen in het analyse certificaat. De kwaliteitscontrole testen bevestigen de identiteit, zuiverheid en potentie van de klinische batch Ad[I/PPT-E1A]. Daarnaast is prostaatspecificiteit van het klinische product aangetoond in humane primaire cellen en is geen toxiciteit van het klinische product geobserveerd na systemische toediening in muizen. Gebaseerd op de resultaten van de kwaliteitscontrole en de preklinische studies zal vrijgifte van de klinische batch in de voorgenomen studie door het Erasmus MC plaatsvinden (A3.4, aanvullende informatie ). * voor informatie van BGGO toegepaste bron: RIVM rapport /2008. Environmental risk assessment of replication competent viral vectors in gene therapy trials ( Ministerie van IenM IM /00 Pagina 16 / 34

17 DEEL 2. MILIEURISICOANALYSE VAN DE AANGEVRAAGDE WERKZAAMHEDEN Per sequentie wordt geïnventariseerd welke nieuwe eigenschappen en effecten mogelijk het gevolg zijn van de nieuw ingebrachte of gedeleteerde sequenties. De oorzaak-gevolg relaties tussen de genetische modificatie en het eventuele schadelijke effect worden verduidelijkt. Daarna volgt de evaluatie van de eventuele gevolgen en de waarschijnlijkheid. De milieurisicoanalyse van de aangevraagde werkzaamheden wordt afgesloten met een deelrisicoschatting per eigenschap en sequentie. Tabel 2.1 milieurisicoanalyse van de regulerende sequenties (I/PPT): Zoals uit de tabel blijkt gaat het hier om indirecte effecten. Daarom wordt in deze tabel wordt niet de gebruikelijke indeling gevolgd in de beoordelingsaspecten A H, die wel relevant is in Tabel 2.2. Bepaling van eigenschappen die schadelijke effecten kunnen hebben (Identificatie en toelichting oorzaak-gevolg relaties) Evaluatie van de mogelijke gevolgen van elk schadelijk effect, indien dit optreedt, en evaluatie van de waarschijnlijkheid van het optreden (rekening houdend met de wijze van introductie en het introductie milieu) Schatting van het risico dat aan de betreffende eigenschap van het GGO verbonden is De promoter heeft een functie bij de regulatie van de genexpressie. Een promoter is een specifieke DNA sequentie waaraan RNA polymerase kan binden om vervolgens stroomafwaarts gelegen coderende sequenties af te lezen. Een promoter op zichzelf kan geen schadelijk effect veroorzaken. Echter, de mate waarin een promoter actief is, is van invloed op de mate van expressie van genen die door de promoter worden gereguleerd. De mate van activiteit van een promoter kan afhankelijk zijn van de omstandigheden. Een constitutieve promoter heeft een vaste mate van activiteit, die niet of nauwelijks wordt veranderd door de omstandigheden. Bij een induceerbare promoter wordt de activiteit bepaald door de aan- of afwezigheid van signaalstoffen in de cel. De activiteit van een promoter kan ook afhankelijk zijn van het cel- of weefseltype waarin de promoter zich bevindt. De prostaat-specifieke regulatoire sequentie (I/PPT) in het GGO bestaat uit de muis H19 insulator (I) en drie prostaatspecifieke regulatoire elementen: de prostaat specifieke antigen (PSA) enhancer, de humane prostaat specifieke membraan antigen (PSMA) enhancer en de humane T-cell receptor gamma-chain alternate reading frame protein (TARP) promoter (PPT). I. Evaluatie van mogelijke gevolgen, indien ze optreden De schadelijke effecten die op kunnen treden als gevolg van de aanwezigheid van de expressie regulerende sequenties kunnen alleen worden geëvalueerd in relatie tot de schadelijke effecten van het E1A genproduct waarvan de mate van productie wordt gereguleerd door het I/PPT regulatoire element, rekening houdende met het verwachte expressiepatroon. II. Waarschijnlijkheid van het optreden van het schadelijke effect Eventuele geïdentificeerde schadelijke effecten kunnen uitsluitend optreden in de prostaat. I. Mogelijke gevolgen: De mogelijke gevolgen van de promoter op zich zijn nihil; de gevolgen zijn afhankelijk van de uitkomst van de risicoanalyse van E1A van Ad2 (zie tabel 2.3), rekening houdende met het verwachte expressiepatroon. II. De waarschijnlijkheid: Eventuele geïdentificeerde schadelijke effecten kunnen uitsluitend optreden in de prostaat. III. Het risico: Het risico is afhankelijk van de uitkomst van de risicoanalyse van de E1A sequentie (tabel 2.3). Ministerie van IenM IM /00 Pagina 17 / 34

18 De enhancers zijn sequenties die de activiteit van de TARP promoter positief beïnvloeden waardoor de transcriptie wordt bevorderd. De muis H19 insulator (I) dient als een schild die de regulatoire PPT sequentie beschermt tegen de invloed van interfererende adenovirale sequenties. De aanwezigheid van de H19 insulator sequentie is essentieel bevonden voor volledige activiteit en specificiteit van het GGO. De geïnserteerde insulator sequentie in Ad[I/PPT-E1A] resulteert niet in een eiwit. In vitro studies en preklinische data bevestigen de specificiteit van Ad[I/PPT-E1A] voor prostaatcellen. Of de mate van expressie en het expressiepatroon van een promoter een schadelijk effect heeft wordt niet direct door een promoter veroorzaakt, maar alleen door het genproduct dat door de promoter tot expressie komt. In het GGO reguleert het I/PPT element de expressie van de geïnserteerde E1A sequentie van Adenovirus serotype 2 (Ad2). Ministerie van IenM IM /00 Pagina 18 / 34

19 Tabel 2.2 Milieurisicoanalyse van de uitgangsvector Adenovirus serotype 5 (Ad5) met deletie van E1A, E1B en E3 genen: Bepaling van eigenschappen die schadelijke effecten kunnen hebben (Identificatie en toelichting oorzaak-gevolg relaties) A. Persistentie en invasiviteit Bij de bepaling van het milieurisico van veranderde persistentie en invasiviteit van de vector toegepast in medisch en veterinair onderzoek gaat het om de bepaling van mogelijke effecten van de genetische modificatie op het gastheerbereik, de infectiviteit, en de pathogeniteit en virulentie voor potentiële gastheren (mensen en dieren) in het milieu. Van een hogere persistentie en invasiviteit van een virale vector ten opzichte van het natuurlijk voorkomende wildtype virus waarvan het is afgeleid, kan sprake zijn indien de vector na toediening aan een patiënt, langer dan het wildtype virus in een actieve vorm aanwezig kan blijven, en er vervolgens shedding kan plaatsvinden van infectieuze deeltjes. Deze shedding leidt tot infectie van andere organismen. Daarbij moet in beschouwing genomen worden dat de vector door de genetische modificatie veranderd kan zijn in zijn weefseltropisme, gastheerbereik, en in de mate van infectiviteit en virulentie. Hierbij spelen onder andere de mogelijkheden voor replicatie en transmissie een rol. Deze veranderingen kunnen leiden tot een gewijzigd ziektebeeld in gastheren die vatbaar zijn voor infectie door het wildtype virus, of tot uitbreiding van de ziekte naar nieuwe gastheren. Hierbij is het de vraag of de deleties van de E1A, E1B en E3 genen leiden tot een verandering in persistentie en/of invasiviteit in vergelijking tot het wildtype adenovirus serotype 5 (Ad5). Alle overige functies van Ad5 zijn behouden. E1A gaat in de gastheercel een interactie aan met verschillende eiwitten in de gastheercel zoals regulatoire eiwitten, eiwitten betrokken bij chromatin remodellering en transcriptiefactoren en stimuleert op deze manier transcriptie van adenovirale genen en replicatie van het virus. Expressie van het E1A gen is essentieel voor replicatie van adenovirus en als gevolg van de deletie van dit gen is de uitgangsvector Evaluatie van de mogelijke gevolgen van elk schadelijk effect, indien dit optreedt, en evaluatie van de waarschijnlijkheid van het optreden (rekening houdend met de wijze van introductie en het introductie milieu) I. Evaluatie van mogelijke gevolgen van het schadelijke effect, indien het optreedt Adenovirus serotype 5 (Ad5) komt van nature alleen voor bij de mens. Het merendeel van de humane populatie is seropositief voor wildtype Ad5, de meeste infecties verlopen a-symptomatisch of mild en nemen vanzelf af en behoeven geen behandeling. De deleties in de uitgangsvector hebben geen invloed op het gastheerbereik, gastheerspecificiteit (mens) of cel- en weefseltropisme (epitheelcellen van de longen) ten opzichte van wildtype Ad5. Infectie van humane cellen door Ad5 treedt op door binding van het fiber eiwit van Ad5 aan de CAR receptor die op epitheliale cellen tot expressie komt. Dit fiber eiwit is in de uitgangsvector normaal aanwezig. Indien verhoogde persistentie of invasiviteit, of een uitbreiding van het gastheerbereik van de vector aanleiding zou geven tot ziektebeelden dan zouden de gevolgen groot kunnen zijn, maar alleen indien het ziektebeeld gepaard gaat met significante hinder of klachten. II. Waarschijnlijkheid van het optreden van het schadelijke effect De deleties van de E1A, E1B en E3 genen leiden tot een sterk verzwakt virus dat niet meer in staat is om te repliceren en dat makkelijker door het immuunsysteem kan worden herkend en vernietigd. Als gevolg hiervan is de uitgangsvector verminderd pathogeen ten opzichte van wildtype Ad5. De deleties leiden dus niet tot schadelijke gevolgen zoals een verhoogde persistentie of invasiviteit. De verloren functies kunnen gecomplementeerd worden indien wildtype Ad5 in dezelfde cel aanwezig is als de vector. De expressieproducten van het wildtype virus kunnen in dat geval gebruikt worden door de vector, wat de vector de mogelijkheid biedt tijdelijk te repliceren. Dit kan leiden tot de vorming va nieuwe deeltjes die identiek zijn aan de uitgangsvector en die Schatting van het risico dat aan de betreffende eigenschap van het GGO verbonden is I. Mogelijke gevolgen: De gevolgen van een eventueel verhoogde persistentie of invasiviteit van het GGO kunnen groot zijn, afhankelijk van de ernst van het ziektebeeld dat erdoor wordt veroorzaakt, in de normale gastheer, of, als er sprake is van een uitbreiding van het gastheerbereik, in een nieuwe gastheer. II. De waarschijnlijkheid: Als gevolg van de deleties van de E1A, E1B en E3 genen is de uitgangsvector replicatiedeficiënt en kan deze makkelijker door het immuunsysteem worden herkend en vernietigd. De waarschijnlijkheid dat dit leidt tot verhoogde persistentie of invasiviteit is te verwaarlozen. III. Het risico: Het risico van verhoging van de persistentie of de invasiviteit bij toepassing van de uitgangsvector is verwaarloosbaar klein. Ministerie van IenM IM /00 Pagina 19 / 34

20 replicatiedeficiënt. Een van de belangrijkste functies van het adenovirale E1B gen is de stimulering van virale replicatie door het voorkomen van apoptose van de geïnfecteerde gastheercel door inactivatie van de p53 signaalroute. Deletie van het E1B gen resulteert in verminderde replicatie van adenovirussen, doordat in afwezigheid van het E1B gen premature geprogrammeerde celdood van geïnfecteerde cellen niet kan worden voorkomen. De E3 genen zijn betrokken bij de controle van de immuunrespons van de gastheer en betrokken bij de inductie van celdood en release van het virus. Door deletie van de E3 genen is het GGO verminderd pathogeen ten opzichte van het oudervirus aangezien het virus gemakkelijker door het immuunsysteem kan worden opgeruimd en de dood van geïnfecteerde cellen gevolgd door release van virale partikels en infectie van aangrenzende cellen minder efficiënt verloopt. in staat zijn om andere cellen te infecteren, dit effect is echter uitdovend als de vector zich niet meer in aanwezigheid van wildtype Ad5 bevindt. Samengevat is de uitgangsvector vanwege deze modificaties replicatiedeficiënt en ten opzichte van wildtype Ad5 verminderd pathogeen. Bij de bepaling van het milieurisico van veranderde persistentie en invasiviteit van een GGO toegepast in medisch en veterinair onderzoek gaat het om de bepaling van mogelijke effecten van de genetische modificatie op het gastheerbereik, de infectiviteit, en de pathogeniteit en virulentie voor potentiële gastheren (mensen en dieren) in het milieu. B. Selectieve voordelen Voor de milieurisicoanalyse van een GGO toegepast in medisch of veterinair onderzoek zijn die selectieve voordelen relevant die leiden tot verhoogde persistentie en invasiviteit. De oorzaak-gevolg relaties die hierbij een rol spelen zijn behandeld onder A. Van een selectief voordeel van een virale vector (i.e. het GGO) ten opzichte van het natuurlijk voorkomende wildtype virus waarvan het is afgeleid, kan sprake zijn indien het GGO na toediening aan een patiënt of proefdier, langer dan het wildtype virus in een actieve vorm aanwezig kan blijven, en er vervolgens shedding kan plaatsvinden van infectieuze deeltjes van het GGO in, en deze shedding leidt tot infectie van andere organismen. Daarbij moet in beschouwing genomen worden dat het GGO door de genetische modificatie veranderd kan zijn in zijn weefseltropisme, gastheerbereik, en in de mate van infectiviteit en virulentie. Hierbij spelen onder andere de mogelijkheden voor replicatie en transmissie een rol. Deze veranderingen kunnen leiden tot een gewijzigd I. Evaluatie van mogelijke gevolgen van het schadelijke effect, indien het optreedt Evenals onder A geldt dat indien verhoogde persistentie of invasiviteit, of een uitbreiding van het gastheerbereik van de vector aanleiding zou geven tot ziektebeelden dan zouden de gevolgen groot kunnen zijn, maar alleen indien het ziektebeeld gepaard gaat met significante hinder of klachten. II. Waarschijnlijkheid van het optreden van het schadelijke effect Zoals reeds is aangegeven onder onderdeel A van deze tabel, leiden de deleties van de E1A, E1B en E3 genen tot replicatiedeficiëntie en een verminderde fitheid van de vector ten opzichte van het wildtype Ad5 virus. Het is uiterst onwaarschijnlijk dat de deleties in de E1A, E1B en E3 genen een positief effect hebben op de virusbiologie van de vector. Een toegenomen virulentie is dan ook zeer onwaarschijnlijk. Dat er als gevolg van selectieve voordelen een verhoogde kans ontstaat op het optreden van een mogelijk schadelijk I. Mogelijke gevolgen: De gevolgen van selectieve voordelen kunnen groot zijn, afhankelijk van de ernst van het ziektebeeld dat erdoor wordt veroorzaakt, in de normale gastheer, of, als er sprake is van een uitbreiding van het gastheer bereik, in een nieuwe gastheer. II. De waarschijnlijkheid: De waarschijnlijkheid dat de deleties van de E1A, E1B en E3 genen leidt tot selectieve voordelen is te verwaarlozen. III. Het risico: Het risico van selectieve voordelen als gevolg van de deleties van de E1A, E1B en E3 genen is verwaarloosbaar klein. Ministerie van IenM IM /00 Pagina 20 / 34