Samenvatting: Doelgerichte behandeling van kanker door gentherapie

Transcriptie

1 Chapter Samenvatting: Doelgerichte behandeling van kanker door gentherapie WM Gommans, 1 PMJ McLaughlin, 2 HJ Haisma 1 en MG Rots 1 1 Department of Therapeutic Gene Modulation, University Center for Pharmacy, University of Groningen, Groningen, The Netherlands and 2 Department of Pathology and Laboratory Medicine, Medical Biology Section, University Medical Center Groningen, Groningen, The Netherlands Tijdschrift kanker. 2006: 30(4):26-29

2 Chapter 9 Het toepassen van genetisch gemodificeerde virussen of het interfereren in het DNA van menselijke cellen kan een krachtige nieuwe antikankertherapie opleveren. In dit proefschrift worden twee manieren van genetische interventie besproken. Introductie Het grote verschil tussen kankercellen en normale menselijke cellen is dat kankercellen geen controle meer hebben op de celdeling. Hierdoor blijven deze kankercellen zich vermenigvuldigen en kunnen ze uitgroeien tot tumoren die schade kunnen aanrichten aan de omliggende weefsels. De cellen van een tumor lijken in veel opzichten op de cellen in de rest van het lichaam. Hierdoor worden ze door ons afweersysteem niet meer herkend als een bedreiging. Ook maakt deze overeenkomst tussen kankercellen en normale lichaamscellen het moeilijk om een behandeling te vinden die specifiek is gericht tegen de tumor. Immers, de therapie zou juist op de eventuele unieke eigenschappen van de kankercel moeten aangrijpen om specifiek te kunnen zijn. Toch zijn er bruikbare verschillen tussen normale weefsels en tumoren. Zo is de hoeveelheid van bepaalde eiwitten in kankercellen verlaagd of juist verhoogd. Vaak zijn dat eiwitten die een rol spelen bij de celdeling. Ook de hoeveelheid van andere cellulaire eiwitten kan zijn veranderd. Een voorbeeld van een dergelijk eiwit is het epitheliale glycoproteïne-2 (EGP-2). 1 Dit eiwit komt in de meeste normale weefsels nauwelijks meer voor na het bereiken van de volwassen leeftijd. Echter, de aanwezigheid van dit eiwit is duidelijk aan te tonen in de meeste tumoren. Zo kan dit eiwit vaak worden gedetecteerd in borsttumoren, ovariumtumoren, prostaattumoren en in darmtumoren. De verandering in de hoeveelheid EGP-2 in een cel is een gevolg van een aanpassing in het productieproces van dit eiwit. Dit eiwit en alle andere eiwitten in onze cellen hebben een blauwdruk in het DNA in de vorm van een gen. Bij het juiste signaal wordt een gen afgelezen en wordt er een eiwit geproduceerd. Het signaal dat zorgt voor de eiwitproductie komt tot stand door een delicate wisselwerking tussen andere stukken DNA en eiwitten. Als die eiwitten ( transcriptiefactoren ) een interactie aangaan met een transcriptiefactor interactie met promoter DNA promoter DNA blauw-druk eiwit humaan DNA eiwit productie eiwit (bv. EGP-2) Figuur 1: eiwitproductie in de cel. Transcriptiefactoren binden aan een specifieke DNA-sequentie (in de promoterregio) van het genoom en kunnen vervolgens de productie van een eiwit aan- of uitzetten. 134

3 Samenvatting specifiek stuk van ons DNA (de promoterregio) zal een eiwit worden geproduceerd (figuur 1). Voor elk eiwit bestaat er een specifieke promoterregio die zorgt voor de productie van dat eiwit. Een promoterregio functioneert dus als het ware als een aan- en uitschakelaar die de eiwitproductie reguleert, en de transcriptiefactoren zetten die schakelaar om. Bij kankercellen is vaak die wisselwerking tussen de transcriptiefactoren en de promoterregio verstoord, waardoor eiwitten worden gemaakt die in gezonde cellen niet of nauwelijks aanwezig zijn. Deze veranderingen in het productieproces zorgen er voor dat kankercellen zich anders gedragen dan normale cellen. Zo is het eiwit EGP-2 geassocieerd met de agressiviteit van de kankercel. Als door experimentele methodes de hoeveelheid EGP-2 eiwit in een cel wordt verminderd, wordt er een vermindering in de migratie, invasie en proliferatiepotentieel van deze cellen waargenomen. Het reduceren van de hoeveelheid EGP-2 in een kankercel kan dus een nieuwe methode zijn bij de behandeling van kanker. Bovendien kunnen we gebruik maken van het verschil in de hoeveelheid EGP-2 in normale cellen en kankercellen door een therapie te ontwikkelen die specifiek is gericht tegen EGP- 2-positieve cellen. Deze twee methodes (de therapie specifiek richten op EGP-2-positieve kankercellen en het verminderen van de hoeveelheid EGP-2-eiwit in de kankercel) zullen in de twee volgende secties meer gedetailleerd aan bod komen. Adenovirus Gentherapie kan worden omschreven als het introduceren van genetisch materiaal in een cel om een therapeutisch effect te bewerkstelligen. Bij kanker zal het geïntroduceerde genetische materiaal uiteindelijk voor de eliminatie van de kankercellen moeten zorgen. Om het DNA op een efficiënte wijze in de kankercel te krijgen, kunnen virale vectoren worden gebruikt. Een voorbeeld van een dergelijke vector is het adenovirus, 2 het virus dat bij mensen verkoudheid kan veroorzaken. Dit virus kan op een efficiënte wijze onze lichaamscellen binnendringen en daar zijn DNA afgeven. Van deze eigenschap kunnen we gebruikmaken om genetisch materiaal in de kankercel te brengen. Hiertoe wordt het DNA van het adenovirus aangepast. Ook wordt er DNA verwijderd uit het genoom van het virus waardoor het niet meer in staat is om zich te repliceren. Voor de behandeling van kanker kan bijvoorbeeld het thymidine-kinase gen (TKgen) in het adenovirale genoom worden ingebracht. Thymidine-kinase is een enzym van het Herpes Simplex Virus en kan de toegediende pro-drug Ganciclovir of Aciclovir omzetten in een toxische stof. Deze stof zorgt er uiteindelijk voor dat de kankercel doodgaat. Het adenovirus zal echter niet alleen kankercellen binnendringen. Zodra het virus in de bloedbaan terechtkomt, gaat het vrijwel meteen naar de cellen van de lever. Als daar nu TK wordt geproduceerd, zal na de toediening van Ganciclovir levertoxiciteit ontstaan. Het is dus belangrijk om de productie van het TK-eiwit selectief te laten plaatsvinden in de kankercellen. Zoals gezegd; het eiwit EGP-2 wordt voornamelijk geproduceerd in kankercellen. Dit houdt in dat er transcriptiefactoren aanwezig zijn in de kankercel die binden aan de EGP-2-promoterregio (de aan-/uitschakelaar) en die er voor zorgen dat het EGP-2-eiwit wordt geproduceerd. De EGP-2-promoterregio is uit het menselijke DNA geïsoleerd en gekarakteriseerd. 3 Wij hebben de EGP-2 promoterregio gebruikt om de productie van het TK-eiwit aan of uit te zetten. Dit is gedaan door in plaats van het natuurlijke EGP-2-gen, 135

4 Chapter 9 EGP-2 promoter codering voor EGP-2 eiwit humaan DNA EGP-2 promoter codering voor TK eiwit adenoviraal DNA adenovirus Figuur 2: genetisch gemodificeerde adenovirussen. Het genoom van het adenovirus kan zo worden veranderd, dat infectie kan zorgen voor tumorspecifieke productie van toxische eiwitten. het gen van het TK-eiwit achter de EGP-2-promoter te plaatsen (figuur 2). Dit eiwit kan nu alleen worden geproduceerd in cellen waarin de eiwitten aanwezig zijn die de EGP-2- schakelaar kunnen omzetten (transcriptiefactoren), dus in kankercellen. De EGP-2- promoter met het TK-gen is in het adenovirale genoom geplaatst. Adenovirale infectie van EGP-2-positieve kankercellen resulteerde in productie van het TK-eiwit, de omzetting van Ganciclovir en celdood. In EGP-2-negatieve levercellen was geen celdood detecteerbaar na infectie met dit virus en toevoeging van Ganciclovir. Dit is dus een heel specifieke manier om kankercellen te doden. 4 Ondanks het feit dat het adenovirus een van de meest efficiënte vectoren is om genetisch materiaal af te leveren in een cel, is het niet efficiënt genoeg om alle kankercellen te kunnen infecteren. Voor de behandeling van kanker is dit echter wel noodzakelijk, aangezien anders de niet-geïnfecteerde en dus onbehandelde kankercellen weer verder gaan delen en een groeiende tumor vormen. Zoals eerder gezegd: de genen die een adenovirale vector nodig heeft voor de replicatie zijn verwijderd. Dit zorgt er voor dat het virus het genetische materiaal aflevert in de cel, maar verder geen schade meer kan aanrichten door replicatie. Het doel voor de behandeling van kanker is echter het specifiek aanrichten van schade aan kankercellen. Daarom wordt momenteel veel onderzoek verricht om het adenovirus specifiek te laten repliceren in kankercellen. Dit heeft een groot voordeel. Replicatie zorgt er namelijk voor dat de cel uiteenvalt en nieuwe virusdeeltjes in de tumor terechtkomen, die vervolgens nieuwe cellen kunnen infecteren (figuur 3). Op deze wijze ontstaat er een cyclus van infectie en replicatie, waardoor veel meer kankercellen worden geïnfecteerd en gelyseerd dan bij een niet-replicerend virus. Het is echter belangrijk om de replicatie te beperken tot de kankercellen, aangezien replicatie in gezonde weefsels tot ongewenste schade kan leiden. Om de replicatie te beperken tot de kankercellen kunnen we opnieuw gebruik maken van de EGP-2-promoter. In plaats van TK reguleert de EGP-2- promoter dan het E1-gen. Het adenovirus heeft het E1-eiwit nodig om te kunnen repliceren. 136

5 Samenvatting gezonde cel tumor cel EGP-2 promoter codering voor E1 eiwit adenoviraal DNA Figuur 3: specifieke replicatie van het adenovirus. Doordat een gen, noodzakelijk voor adenovirale replicatie, wordt gecontroleerd door de EGP-2-promoter, zal replicatie alleen plaatsvinden in EGP-2-positieve (tumor)cellen. Deze cellen lyseren en nieuwe virusdeeltjes komen vrij in het tumormilieu. Gezonde cellen worden ook geïnfecteerd door het virus, maar in deze cellen zal het virus niet kunnen repliceren omdat de EGP-2-promoter uitstaat. Doordat de productie van het E1-eiwit nu wordt gereguleerd door de EGP-2-promoter, zal dit eiwit alleen worden gemaakt in EGP-2-positieve (tumor)cellen met als gevolg dat specifiek daar het virus wordt geproduceerd, de kankercellen lyseren en er nieuwe virusdeeltjes vrijkomen in het tumorweefsel. Deze virusdeeltjes kunnen in principe ook de omliggende weefsels infecteren. Maar deze zijn EGP-2-negatief, met als gevolg dat daar het E1-eiwit niet wordt geproduceerd en er geen vorming van nieuwe virusdeeltjes plaatsvindt. Wij hebben kunnen aantonen dat replicatie in tumorweefsel inderdaad met dezelfde efficiëntie plaatsvindt als bij replicatie van natuurlijke adenovirussen. Echter, de replicatie in gezond humaan levermateriaal is tot een factor minder groot in vergelijking met virusproductie van natuurlijke adenovirussen. De replicatie is dus heel specifiek gericht tegen de kankercellen. Door het genetisch modificeren van het adenovirus kan dus een heel specifieke manier worden gevonden voor de behandeling van kanker. Momenteel worden andere adenovirussen die uitgaan van hetzelfde principe als hierboven beschreven, getest in patiënten. In de volgende sectie zal worden beschreven hoe een ander type gentherapie, namelijk het direct beïnvloeden van de EGP-2-eiwitproductie zelf, kan bijdragen aan een middel tegen kanker. Zinkvinger De hoeveelheid EGP-2-eiwit heeft in kankercellen invloed op de agressiviteit van de tumorcel. Als met behulp van experimentele methodes die hoeveelheid EGP-2-eiwit in de cel wordt verlaagd, dan gaat de cel zich minder als een kankercel gedragen: de snelheid van de celdeling neemt af en de cel is minder goed in staat om naar omliggende structuren te migreren. Het verlagen van de hoeveelheid EGP-2 in een kankercel kan dus een nieuwe methode zijn bij de behandeling van kanker. 137

6 Chapter 9 Zoals vermeld kunnen DNA-promoterregios worden gezien als de aan- en uitschakelaar van de eiwitproductie. Maar het zijn de transcriptiefactoren die uiteindelijk de schakelaar kunnen omzetten. Transcriptiefactoren zijn eiwitten die specifieke stukken DNA herkennen en daaraan binden. Daarnaast bevatten transcriptiefactoren een domein dat ervoor zorgt dat de eiwitproductie wordt aan- of uitgezet. Doordat transcriptiefactoren aan een specifieke sequentie in het DNA binden, zal alleen voor dat gen de eiwitproductie worden gemoduleerd. Een voorbeeld van een transcriptiefactor is de zinkvingerproteïne-transcriptiefactor (ZFP-TF) (figuur 4). 5 Het eiwit heeft de vorm van een vinger, en deze structuur ontstaat door de interactie met een zinkatoom. Een ZFP-TF kan een specifiek stuk DNA herkennen en op die plaats de eiwitproductie beïnvloeden. N -1 C β 3 T β C C Zink atoom H H α 6 G C Zinc vinger proteine Figuur 4: zinkvingerproteïne. De aminozuren van het zinkvingerproteïne (ZFP) hebben op specifieke plaatsen in het eiwit contact met de bouwstenen van het DNA. De herkenning van het DNA door de ZFP-TF is dus het gevolg van de interactie tussen de aminozuren van het ZFP-TF en de bouwstenen van het DNA. Het is bekend welke aminozuurvolgorde in de ZFP-TF welke DNA-bouwstenen herkennen. Door nu die specifieke aminozuren te veranderen, herkent de ZFP-TF een andere DNA-sequentie. Op deze manier is het mogelijk om de ZFP-TF aan een ander stuk DNA te laten binden, met als gevolg dat een andere promoterregio wordt gereguleerd en de productie van een ander eiwit wordt beïnvloed. Elke ZFP herkent drie DNA-bouwstenen en deze DNA-volgorde zal heel vaak voorkomen in het humane genoom. Het is mogelijk om meerdere ZFP s aan elkaar te koppelen. Omdat elke ZFP drie DNA-bouwstenen herkent, zal de herkende DNA-sequentie zich met elke ZFP met drie bouwstenen uitbreiden. Een eiwit bestaande uit zes ZFP s kan dus een sequentie binden van 18 DNA-bouwstenen. Deze sequentie zal rekenkundig gezien maar eenmaal in ons genoom voorkomen. Om de eiwitproductie te kunnen beïnvloeden, moet aan het DNA-bindende ZFP een effectordomein worden gekoppeld. Een dergelijk effectordomein kan vervolgens de eiwitproductie aan- of uitzetten. De ZFP brengt dus in principe het effectordomein naar de juiste promoterregio om daar de eiwitproductie te kunnen beïnvloeden (figuur 5). Het DNA-bindende ZFP plus het effectordomein wordt de ZFP-TF genoemd. 138

7 Samenvatting effector domein remming of activering van eiwit productie humaan DNA eiwit (bv. EGP-2) Figuur 5: zinkvingerproteïnetranscriptiefactoren. Verschillende ZFP-DNA-bindende domeinen kunnen aan elkaar worden gekoppeld waardoor een langere en daardoor ook specifiekere DNA-sequentie wordt herkend. Vervolgens kan aan het DNA-bindende domein een effectordomein worden gekoppeld waardoor de eiwitproductie aan of uit wordt gezet. Deze ZFP-TF s zijn ook gemaakt om specifiek aan een sequentie in de EGP-2- promoter te binden. Aan het DNA-bindende ZFP-domein hebben we een inhibitiedomein gekoppeld, waardoor we specifiek de EGP-2-promoter konden uitzetten. Het is dus mogelijk om de eiwitproductie in een cel te moduleren door het maken van artificiële ZFP-TF s. Naast het EGP-2-eiwit zijn er nog veel meer cellulaire eiwitten die ook een rol spelen bij kanker. Ook tegen deze eiwitten zouden artificiële transcriptiefactoren kunnen worden ontwikkeld. Door deze ZFP-TF s heel specifiek de eiwitproductie te laten beïnvloeden, kunnen deze artificiële modulators van het humane genoom bijdragen aan een specifieke therapie tegen kanker. Samenvatting In dit proefschrift zijn twee mogelijkheden besproken waarop gentherapie kan bijdragen aan een middel tegen kanker. Enerzijds kunnen eiwitten specifiek worden geproduceerd in kankercellen, waardoor er een toxisch product ontstaat of virale replicatie plaatsvindt die beperkt blijft tot de kankercellen. Anderzijds kunnen eiwitten die een rol spelen bij kanker specifiek wel of niet worden geproduceerd, door interventie met artificiële transcriptiefactoren. Deze twee uiteenlopende voorbeelden van genetische modificatie laten zien hoe dergelijke benaderingen kunnen bijdragen aan een mogelijk krachtige nieuwe therapie tegen kanker. 139

8 Chapter 9 Referenties 1. Balzar M, Winter MJ, de Boer CJ, Litvinov SV. The biology of the 17-1A antigen (Ep-CAM). J Mol Med. 1999; 77: Verma IM, Weitzman MD. Gene therapy: twenty-first century medicine. Annu Rev Biochem. 2005; 74: McLaughlin PM, Trzpis M, Kroesen BJ, Helfrich W, Terpstra P, Dokter WH, Ruiters MH, de Leij LF, Harmsen MC. Use of the EGP-2/Ep-CAM promoter for targeted expression of heterologous genes in carcinoma derived cell lines. Cancer Gene Ther. 2004; 11: Gommans WM, van Eert SJ, McLaughlin PM, Harmsen MC, Yamamoto M, Curiel DT, Haisma HJ, Rots MG. The carcinoma-specific epithelial glycoprotein-2 promoter controls efficient and selective gene expression in an adenoviral context. Cancer Gene Ther. 2006; 13: Gommans WM, Haisma HJ, Rots MG. Engineering zinc finger protein transcription factors: the therapeutic relevance of switching endogenous gene expression on or off at command. J Mol Biol. 2005; 354: