Huidautofluorescentie in Systemische Amyloïdose

Transcriptie

1 UNIVERSITAIR MEDISCH CENTRUM GRONINGEN in Systemische Amyloïdose Stage Wetenschap Eva M. Boorsma s /3/7 Dr. H.L.A. Nienhuis, internist-klinisch immunoloog/allergoloog i.o. Prof. Dr. A.J. Smit, vasculair geneeskundige Dr. B.P.C. Hazenberg, reumatoloog Reumatologie en Klinische Immunologie

2 Samenvatting (Nederlands) Introductie: amyloïdose is een groep ziekten gekenmerkt door neerslag van amyloïd, een eiwit dat sterk bestand is tegen proteolyse. Neerslag van deze eiwitten in verschillende organen leidt tot falen van deze organen, met oxidatieve stress als gevolg. Dit zijn omstandigheden waaronder advanced glycation end products (AGE s) kunnen vormen. Daarnaast zijn er aanwijzingen dat AGE s weer een rol spelen in de vorming van amyloïd door destabiliseren van eiwitten. AGE s kunnen in de huid gemeten worden door gebruik te maken van hun autofluorescerende eigenschappen. In dit onderzoek werd gekeken of patiënten met amyloïdose een verhoogde huidautofluorescentie (HAF) hebben vergeleken met gezonde controles. Materiaal en Methode: in totaal werden 88 metingen verricht bij patiënten met de AGE-reader welke gevalideerd is voor het meten van AGE s in de huid. Biomarkers werden bepaald middels gestandaardiseerde laboratoriumtechnieken. Aan de hand van het buikvetbiopt werd mate van amyloïddepositie bepaald. Voor de statistische analyse is gebruik gemaakt van gepaarde t-test, Pearson en Spearman correlatietesten, ANOVA en Kruskal- Wallis en Generalized Estimating Equations. Resultaten: in patiënten met AA amyloïdose wordt een verhoogde HAF gevonden vergeleken met waarden berekend aan de hand van een gevalideerde formule. Voor de andere types amyloïdose werd dit niet gevonden. Er werd geen relatie gevonden tussen mate van amyloïddepositie en huidautofluorescentie. Er werd een relatie gevonden met nierfunctie, een zwakke relatie gevonden met ziekteduur en geen relatie met inflammatieparameters. Discussie: de verhoogde HAF in patiënten met AA amyloïdose is meest waarschijnlijk een afspiegeling van verhoogde accumulatie van AGE s in een milieu van oxidatieve stress en verminderde klaring van AGE- precursors door nierinsufficiëntie. Er zijn geen aanwijzingen dat gevonden HAF veroorzaakt wordt door autofluorescentie van amyloïd. Abstract (English) Introduction: amyloidosis is a group of diseases marked by deposition of amyloid, an aggregate of protein highly resistant to proteolysis. Deposition of these proteins in different organs gives rise to organ dysfunction, leading to oxidative stress. These proteins are expected to be prone to form advanced glycation end products (AGE s). In turn there is evidence that AGE s can play a role in the formation of amyloid by destabilizing proteins. AGE s can be measured in the skin by using their auto fluorescent characteristics. In this thesis we investigated weather amyloidosis patients had higher skin auto fluorescence (SAF) compared to healthy subjects. Methods: 88 measurements were performed in patients. The AGE-reader was used to carry out the measurements. Biomarkers were assessed using routine laboratory techniques. Based on abdominal fat biopsy the degree of amyloid deposition was estimated. Statistical analyses were conducted using paired t-test, Pearson and Spearman tests, ANOVA and Kruskal-Wallis tests and Generalized Estimating Equations. Results: SAF was increased in patients with AA amyloidosis compared to calculated values bases on a validated formula. For the other types of amyloidosis no differences could be found. There was no correlation with degree of amyloid deposition. There was a correlation with kidney function and disease duration, but no correlation with inflammatory status. Discussion: increased SAF in AA amyloidosis patients is most likely a reflection of increased accumulations of AGE s in an environment of oxidative stress. There are no indications that auto fluorescence of local amyloid caused increased SAF in these patients.

3 Inhoud INTRODUCTIE 5 Amyloïdose 5 Advanced glycation endproducts 5 Oxidatieve stress 6 AGE s in amyloïdose 6 Autofluorescentie van amyloïd 7 Vraagstelling 7 MATERIAAL EN METHODE 9 Patiënten 9 ATTR amyloïdose 9 AL amyloïdose 9 AA amyloïdose 9 Referentiewaarden 9 9 Fluorescentiemicroscoop Biomarkers Buikvetbiopt Beeldvormend onderzoek Statistische Analyse RESULTATEN 3 Baseline karakteristieken 3 4 in relatie tot amyloïddepositie 5 in relatie tot ziekteduur 8 in relatie tot inflammatie, nierfunctie en glykemische status DISCUSSIE EN CONCLUSIE Verhoogde huidautofluorescentie van AA patiënten

4 Advanced glycation endproducts en amyloïdose Autofluorescentie van amyloïd 3 Sterktes en zwaktes van de studie 4 Aanbevelingen voor vervolgonderzoek 4 REFERENTIES 7 APPENDIX 3

5 Introductie Amyloïdose Amyloïdose is een groep van ziekten gekenmerkt door het neerslaan van eiwitfibrillen met een typische antiparalelle betasheet- structuur: amyloïd. Deze opbouw is zeer resistent tegen proteolyse en daarmee het opruimen van neergeslagen amyloïd uit het lichaam. In systemische amyloïdose leidt stapeling van amyloïd in vitale organen tot orgaanfalen en uiteindelijk tot de dood. Amyloïd kan worden gevormd uit verschillende precursoreiwitten. Op basis van precursoreiwitten worden verschillende types amyloïdose onderscheiden. De meest voorkomende types zijn AL-, ATTR- en AA- amyloïdose. De verschillende types amyloïdose hebben verschillende voorkeurslocaties met betrekking tot de organen waar het amyloïd neerslaat. In AL- amyloïdose is een plasmaceldyscrasie verantwoordelijk voor het ontstaan van amyloïd, waarbij overmatig vrije lichte ketens worden geproduceerd door een plasmakloon, zoals bij een monoclonale gammopathie (MGUS) of multipel myeloom. In dit geval is het amyloïd opgebouwd uit deze vrije lichte ketens. AL amyloïdose geeft voornamelijk problemen van de nieren, het hart, en de lever en zenuwen. Bij AA amyloïdose is het precursoreiwit serum amyloïd A, een acute fase eiwit. Deze vorm van amyloïdose kan optreden ten gevolge van langdurige ontsteking. In ontwikkelingslanden is dit de meest voorkomende vorm. Dit is dan veelal het gevolg van chronische infecties als lepra, malaria en tuberculose(), terwijl AA- amyloïdose in westerse landen vrijwel uitsluitend gezien wordt in het kader van ontstekingsziekten als reumatoïde artritis of morbus Crohn. Bij AA- amyloïdose staat nierfalen veelal op de voorgrond (8%) (), hoewel andere organen ook betrokken kunnen zijn. ATTR- amyloïdose is een autosomaal dominant overerfbare aandoening die ontstaat door puntmutaties in het gen dat codeert voor het transthyretine (TTR) eiwit. Door de mutatie zal het TTR anders gaan vouwen waardoor het kan gaan stapelen. ATTR kenmerkt zich door polyneuropathie en hartfalen. Er bestaat ook een vorm van ATTR amyloïdose waarbij een niet gemuteerd TTR kan stapelen als amyloïd. Deze vorm van ATTR amyloïdose treedt uitsluitend op bij mensen op oudere leeftijd. Advanced glycation endproducts Advanced glycation endproducts (AGE s) zijn gemodificeerde suikers die in hoog glykemisch milieu of onder invloed van oxidatieve stress binden aan eiwitten of lipiden (3,4). De aanwezigheid en accumulatie van AGE s in de weefsels beïnvloedt zowel intra- als extracellulaire structuur en functie. AGE s dragen onder andere bij aan macro- en microvasculaire complicaties van diabetes mellitus. Wanneer eiwitten of lipiden langere tijd blootgesteld zijn aan glucose zal middels glycatie en oxidatie eerst een reversibele binding ontstaan tussen onder andere eiwitten en glucose. Het bekendste voorbeeld hiervan is het HbAc, welke gebruikt wordt als maat voor glucosespiegels over langere tijd(5). Na dalen van bloedglucosespiegels zullen deze verbindingen ook weer loslaten en een nieuw evenwicht tussen eiwit en vrij glucose ontstaan. Dit proces verloopt echter zeer traag en wordt voornamelijk bepaald door de levensduur van het desbetreffende eiwit. Wanneer glucosespiegels langere tijd hoog zijn zullen nieuwe irreversibele verbindingen gevormd worden in de vorm van AGE s. Deze stapeling wordt 5

6 geaccelereerd door verminderde renale klaring van deze producten bij nierfalen(6) en/of door oxidatieve stress(7). Glycatie treedt vooral op bij eiwitten met een lange halfwaardetijd (8). Advanced glycation endproducts hebben verschillende pathofysiologische effecten:. Cross-links worden gevormd met eiwitten in de extra-cellulaire matrix waardoor weefsels stugger worden;. Binding van AGE s op de receptor voor AGE s (RAGE) leidt tot activatie van intracellulaire pro-inflammatoire pathways in verschillende celtypen; 3. De functie van eiwitten die via AGE s gecrosslinkt zijn wordt verstoord. Oxidatieve stress Vrije zuurstofradicalen ontstaan als bijproducten van normale aerobe verbranding. Deze radicalen zijn zeer reactief met andere moleculen in het lichaam, met name vetten en eiwitten. Buiten de radicalen die ontstaan uit metabolisme wordt het lichaam tevens blootgesteld aan externe oxidatieve factoren, waaronder roken (9). Onder normale fysiologische omstandigheden wordt een deel van deze radicalen weggevangen door antioxidanten, welke een reactie met de radicalen aangaan voordat zij schade kunnen brengen aan het lichaam. Wanneer er een disbalans is tussen vrije zuurstofradicalen en antioxidanten is er sprake van een toestand die oxidatieve stress genoemd wordt(). Daarnaast bestaat er nog carbonylstress. Een vergelijkbaar mechanisme dat het gevolg is van anaerobe verbranding. Zowel oxidatieve als carbonylstress dragen bij aan de vorming van advanced glycation endproducts. Een dergelijke disbalans wordt gezien bij tal van pathologische toestanden, waaronder chronische ontsteking en roken. Bovendien bevat tabaksrook zelf precursors van AGE s(). AGE s in amyloïdose Amyloïd is zeer goed bestand tegen proteolyse en blijft daardoor langdurig in het weefsel zitten. Aanwezigheid van deze eiwitten leidt tot verminderde functie van de betreffende organen. Orgaandisfunctie gaat vervolgens weer gepaard met oxidatieve stress. De langdurige aanwezigheid van eiwitten in een omgeving van oxidatieve stress zou hypothetisch gezien kunnen leiden tot toegenomen aanwezigheid van advanced glycation endproducts bij patiënten met amyloïdose. Met name nierfalen is sterk gerelateerd aan de accumulatie van AGE s(,3). Ook chronische inflammatie, zoals in patiënten met AA amyloïdose, zou ertoe kunnen leiden dat AGE s accumuleren. Eerder werd in het UMCG al gekeken naar de mate van AGE-accumulatie bij 55 patiënten met systemische lupus erythematosus in vergelijking met leeftijd- en geslachtgematchte controles. De Leeuw et al. vonden in deze studie significant hogere waardes voor autofluorescentie in SLE- patiënten dan in de gezonde controles(4). Bovendien was opvallend dat ziekteduur een onafhankelijk predictor was voor advanced glycation endproducts in deze patiëntenpopulatie. Als verklaring voor dit verschil geven de auteurs de continue laaggradige inflammatoire toestand in patiënten met SLE. Daarnaast wordt oxidatieve stress, aanwezig in deze staat van chronische ontsteking, afzonderlijk van de ontsteking op zichzelf, genoemd als component bijdragend aan verhoogde AGE- waarden en daarmee het cardiovasculair risicoprofiel bij systemische lupus erythematosus. 6

7 Ook in patiënten met auto-immuun thyreoïditis bleek sprake van verhoogd aantal circulerende zuurstofradicalen en verminderde aantal antioxidanten. In deze studie bleek tevens dat deze patiënten verhoogde serum AGE spiegels hadden(5). Van belang is dat deze AGE-spiegels omgekeerd evenredig waren met het biological antioxidant potential. Dit wil dus zeggen dat in een omgeving van verminderde antioxidanten meer AGE s gevormd worden. Daarnaast zouden AGE s een rol kunnen spelen in de amyloïdogenese. Enkele studies hebben al aanwezigheid van AGE s in amyloïd deposities laten zien bij patiënten met ATTR amyloïdose(6). Recente studies hebben aangetoond dat glycatie van fibrinogeen leidt tot verminderde chaperonne activiteit, waardoor het minder goed in staat is TTR-tetrameren te stabiliseren(7). Doordat TTR tetrameren minder stabiel zijn kunnen zij uiteenvallen in monomeren, gemakkelijker aggregeren en neerslaan als amyloïd. Een andere recente studie vond dat glycatie van albumine de ruimtelijke structuur verandert van globulair naar fibrillen, wat de amyloïdogenese aanwakkert (8). Aanwezigheid van carboxyethyllysine had hierin het grootste schadelijke effect. Autofluorescentie van amyloïd Onderzoek uit liet zien dat in retinale muismodellen amyloïdplaques ex vivo hyperautofluorescent waren onder bepaalde golflengtes (excitatie op 83 nm, emissie op 63) (9). Dit onderzoek werd in 3 gevolgd door een case report uit Italië(), over een vrouwelijke patiënt met familiare ATTR- amyloïdose waarbij hyperautofluorescente laesies op de retina werden gevonden. Bij een patiënt met tracheobronchiale amyloïdplaques werden de gevonden plaques tijdens bronchoscopie beschenen met blauw licht ( nm)(). Dit deed de plaques helder oplichten. In het case report wordt niet beschreven om welke vorm van amyloïdose het gaat en of er sprake was een systemische ziekte. Echter, vrijwel alle klinische relevante vormen van endobronchiale amyloïdose zijn een vorm van AL- amyloïdose (). Van β-amyloïdplaques, die de basis vormen voor het ontstaan van M. Alzheimer, is het al langer bekend dat ze autofluoresceren. Excitatie met UV-licht (36-37 nm) geeft emissie van blauw licht door de amyloïdketens in het brein en de bloedvaten(3). Aanvullend onderzoek naar autofluorescentie van amyloïd volgt door Chan et al. Zij tonen voor β- peptides, tau- en lysozym- eiwitten aan dat zij tijdens de vorming van amyloïd autofluoresceren(4). Bij het vormen van waterstofbruggen verplaatst een elektrode. Deze laagenergetische transitie is de verklaring voor de emissie van (zichtbaar) licht. Om de hypothese van de vorming van waterstofbruggen te ondersteunen werd gekeken naar een ongekleurde oplossing van voorlopereiwitten. Deze oplossing had geen fluorescente kenmerken. Vervolgens werd het amyloïd blootgesteld aan een oplossing van guanidium hydrochloride wat het amyloïd deed oplossen tot een homogeen mengsel van monomeren. Ook dit mengsel toonde geen autofluorescentie. Daarnaast zien zij een relatie tussen de mate van dichtheid van het amyloïd en mate van emissie. De auteurs stellen dat autofluorescentie een intrinsieke eigenschap is van β- sheet structuren en dus van amyloïd. Dit suggereert dat alle vormen van amyloïdose autofluorescente eigenschappen zouden hebben. Vraagstelling Aangezien de neergeslagen eiwitten vanwege hun typische betasheetstructuur zeer moeilijk opgeruimd kunnen worden door het lichaam, worden deze lange tijd blootgesteld aan factoren die het eiwitglycoseringsproces katalyseren. Bovendien zal in het kader van orgaanfalen het lichaam vermoedelijk meer dan in een gezonde populatie blootgesteld worden aan oxidatieve stress, hetgeen het proces van AGE- vorming verder versnelt. 7

8 Daarnaast lijkt de aanwezigheid van AGE s in het serum en in de weefsels een katalysator te zijn voor de vorming van amyloïd. Tot slot zijn er aanwijzingen dat amyloïd zelf autofluoreserende eigenschappen heeft. Op basis van het bovenstaande kan worden gehypothetiseerd dat een verhoogde huidautofluorescentie gevonden wordt in patiënten met systemische amyloïdose. Bovengenoemde hypothese roept de volgende vragen op:. Is huidautofluorescentie verhoogd in patiënten met systemische amyloïdose?. Is de mate van huidautofluorescentie gerelateerd aan de mate van amyloïddepositie? 3. Neemt de mate van huidautofluorescentie toe bij langere ziekteduur? 4. Is de hoeveelheid huidautofluorescentie gerelateerd aan inflammatie, nierfunctie en glykemische status in patiënten met amyloïdose? 8

9 Materiaal en Methode Patiënten Aan de hand van een poweranalyse (power 8%, α.5) werd bepaald dat om een verschil van.4 arbitraire eenheden in autofluorescentie vast te stellen 5 patiënten geïncludeerd moeten worden. Zowel patiënten met AA, AL- en ATTR-amyloïdose werden geïncludeerd volgens onderstaande criteria: ATTR amyloïdose Inclusiecriteria: a. Bewezen TTR mutatie met diagnose van ATTR amyloïdose of wild-type ATTR amyloïdose: immunohistochemisch bewezen TTR amyloïd bij patiënt zonder mutatie. b. Informed consent. Exclusiecriteria: donker huidtype, type 5-6 AL amyloïdose Inclusiecriteria: a. Positief vetbiopt en aanwezigheid van een klonale plasmacel dyscrasie. Een klonale plasmaceldyscrasie kan worden gediagnostiseerd bij detectie van vrije lichte keten kappa of lambda in serum of urine of bij detectie in het beenmerg van een relatieve overmaat aan cellen die één van de vrije lichte ketens produceren. b. Informed consent. Exclusiecriteria: donker huidtype, type 5-6 AA amyloïdose Inclusiecriteria a. Bewezen aanwezigheid van AA- amyloïdose in vetbiopt in aanwezigheid van een verklarende onderliggende inflammatoire aandoening. b. Informed consent Exclusiecriteria: donker huidtype, type 5-6 Referentiewaarden Op basis van metingen bij gezonde Nederlandse (Kaukasische) vrijwilligers werd gevonden dat de HAF geleidelijk toenam met leeftijd. Ook vonden Koetsier et al dat bij rokers de HAF.6 AU hoger lag dan bij niet-rokers, ongeacht de leeftijd van de rokende proefpersoon. Aan de hand van deze gegevens kon de volgende formule worden opgesteld: emean_af=.83+(.3l)+.6r, waarin L de leeftijd is en R roken, weergegeven als =ja, =nee. De formule is gevalideerd om referentiewaarden te geven van gezonde controle personen met een licht huidtype (Fitzpatrick huidtype I-IV) als functie van leeftijd en rookstatus (5). Aan de hand van deze formule werden normaalwaarden voor de patiënten berekend en vergeleken met de daadwerkelijk gevonden waarden. Al in 986 werd een klassiek fluorescentiespectrum van advanced glycation endproducts gevonden en een relatie met ernst van diabetische complicaties gesuggereerd(6). Na excitatie met licht met een golflengte van 37 nm, emitteren AGE s licht met een golflengte van 44 nm. De AGE-reader is een apparaat dat op een slimme manier gebruik maakt van deze 9

10 eigenschap. De onderarm wordt op het apparaat gelegd waarna een stukje huid van cm wordt belicht met licht in het spectrum van 3-4 nm, met een piekgolflengte van 37 nm (7,8). Het is hierbij van belang een stuk huid te kiezen zonder moedervlekken, littekens of andere onregelmatigheden van de huid. Vooralsnog is het apparaat uitsluitend gevalideerd voor de blanke huid. Dit is de reden geweest alleen patiënten met een licht huidtype (Fitzpatrick I-IV) te includeren. wordt gedefinieerd als de gemiddelde intensiteit van fluorescentie per nm van het volledige emissiespectrum (4-6 nm) als ratio van de gemiddelde fluorescentie per nm van het 3-4 nm spectrum(8). Deze methode corrigeert voor verschillende lichtabsorptie van de huid bij verschillende pigmentatie. Deze huidautofluorescentie (HAF) wordt weergegeven in Arbitrary Units (AU). De AGE-reader is gevalideerd voor het registreren van 3 specifieke AGE moleculen, te weten pentosidine, carboxymethyllysine en carboxyethyllysine in patiënten met diabetes, nierfalen en in gezonde controles(8). Er zijn nog meer advanced glycation endproducts die niet autofluoresceren. Ook een relatie tussen deze niet fluorescerende AGE s in het serum en de HAF-waarde is aangetoond(7). De gevonden HAF- waarde kan dus beschouwd worden als een groepsmeting van alle advanced glycation endproducts. De AGE-reader maakt voor excitatie gebruik van licht in het spectrum van 3-4 nm (7,8). Voor zover bekend zullen AA-amyloïd, ATTR-amyloïd en AL amyloïd niet gaan autofluoresceren bij deze excitatiegolflengtes. Zoals eerder genoemd kan β-amyloïd wel gaan autofluoresceren bij excitatiegolflengtes tussen de 36 en 37nm, echter patiënten met de ziekte van Alzheimer werden niet in deze studie geïncludeerd. Om te evalueren of amyloïd in de huid toch zou kunnen autofluoresceren en of dit detecteerbaar zou zijn met de AGE-reader werd gekeken naar de zogeheten witmetingen van de AGE-reader. Middels wit licht word een totaal fluorescentiespectrum bepaald, voorafgaand aan de specifiekere meting van het spectrum van emissie van de AGE s. Wanneer er dan een toename is van eiwitten die fluoresceren in een ander spectrum, geeft de witmeting een extra piek. Een selectie van patiënten werd gemaakt aan de hand van het type amyloïdose. Vervolgens werden van elk type 4 patiënten met een negatief buikvetbiopt en 4 patiënten met een sterk positief (4+) vetbiopt geselecteerd. Er konden geen verschillen gevonden worden in het patroon van de witmeting binnen de geselecteerde patiënten. Fluorescentiemicroscoop Er werd een additioneel experiment uitgevoegd om te beoordelen of humaan AA-amyloïd autofluoresceert en dus zou kunnen bijdragen aan huidautofluorescentie in patiënten met AA amyloïdose. Seriële coupes van een nierbiopt van een patiënt met bewezen AA-amyloïdose met renale betrokkenheid werden bestudeerd. Coupes gekleurd met h-ftaa (9,3) als positieve controle, gekleurd met curcumine als experimentele kleuring en ongekleurde coupes werden bekeken onder de fluorescentiemicroscoop (Leica DM). Deze microscoop was uitgerust met een spectraalsysteem (Cri Nuance FX Multispectral Imaging system, Woburn, USA) met verschillende excitatiefilters (DAPI- filter (4-7 nm), FITC- filter (5-7), Cy3-filter (53-7)). De fluorescentiemicroscoop heeft de eigenschap licht met een specifieke emissie te filteren van het licht waarmee het preparaat geëxciteerd is. Op deze manier wordt fluorescentie van specifieke moleculen, cellen of weefsels zichtbaar gemaakt.

11 Met deze opzet werd gekeken of humaan AA-amyloïd autofluorescerende kenmerken heeft en bij welke excitatie golflengtes dit gevonden kan worden. Biomarkers Ten tijde van AGE- meting werd bloed afgenomen voor bepaling van o.a. CRP, kreatinine, AF, GGT en ALAT middels gestandaardiseerde routine laboratoriumtechnieken. Bovendien werd de mate van orgaanbetrokkenheid gemonitord aan de hand van NT pro-bnp als marker voor hartfalen, alkalisch fosfatase en γ-gt om intra-hepatische cholestase aan te tonen. ALAT werd ook bepaald, dit om andere onderliggende leverpathologie minder aannemelijk te maken. Eventuele betrokkenheid van de nieren werd bepaald aan de hand van de kreatineklaring en de mate van proteïnurie, zowel kwalitatief als kwantitatief. SAA werd uit het serum en het buikvet bepaald middels ELISA zoals beschreven door Hazenberg et al (3). Voor deze ELISA werd gebruik gemaakt van monoclonale antilichamen tegen humaan serum amyloïd A als coatings- en captureantilichaam. Buikvetbiopt Typisch voor amyloïdose is een positieve Congo Rood- kleuring welke onder gepolariseerd licht appelgroen kleurt. De mate van aanwezigheid wordt visueel gescoord op een schaal van (geen amyloïd in het biopt) tot 4+ (veel amyloïd zichtbaar). Gezien de minimale risico s verbonden aan het afnemen van een buikvetbiopt is dit de diagnostische methode van voorkeur. Gevonden HAF- waarden werden uitgezet tegen de gevonden hoeveelheid amyloïd in het biopt op het moment van meten. Beeldvormend onderzoek Ongeacht het precursoreiwit bevat amyloïdeiwit Serum Amyloïd P (SAP), een glycoproteïne dat onder invloed van calcium bindt aan amyloïd. SAP- scintigrafie is een techniek waarbij met jodium-gelabeld SAP zichtbaar gemaakt kan worden waar in het lichaam amyloïd afgezet is. De orgaanspecifieke uptake wordt visueel gescoord, dit in combinatie met de totale weefselretentie na 4-48 geeft een beeld van de uitgebreidheid van de ziekte (3). Indien de patiënt gepland stond voor een SAP-scintigrafie rondom de meting werd de visuele semi-kwantitatieve bepaling van amyloïdneerslag in nieren, milt en lever vergeleken met de HAF- waarden gevonden middels AGE-meting. Daarnaast werden HAF-waarden vergeleken met totale weefselretentie van serum amyloïd P. De weefselretentie kan worden gezien als datgene wat na maximale klaring achterblijft en daarmee indirect een maat voor de hoeveelheid amyloïd in het lichaam. Hierbij dient wel de kanttekening gemaakt te worden dat bij een slechtere nierfunctie de uitscheiding van afbraakproducten van radioactief jodium slechter is en de weefselretentie hiermee foutief verhoogd. Statistische Analyse Middels een Q/Q-plot werd parametriciteit van de verschillende uitkomstvariabelen getoetst. Autofluorescentie van de huid bleek een normaal verdeelde waarde te zijn, evenals weefselretentie en kreatinineklaring. Andere parameters waren niet normaal verdeeld. Om onderlinge verschillen in uitkomstparameters tussen de drie patiëntengroepen te toetsen werd voor de variabelen met een normale verdeling een ANOVA gebruikt. Nonparametrische variabelen werden met behulp van de Kruskal-Wallis test vergeleken. Nominale variabelen werden middels Chi kwadraat getoetst. Voor variabelen waar onderling een significant verschil werd gevonden werd middels ongepaarde t-test voor de parametrische variabelen en Mann Whitney s U test voor non- parametrische variabelen gezocht tussen welke groepen er een verschil was.

12 Gemeten huidautofluorescentiewaarden werden gepaard getoetst aan voor de leeftijd verwachte referentiewaarden. Er is gekozen voor een gepaarde t-test, omdat verwachte waarden berekend zijn per individuele patiënt en dus als baseline meting beschouwd kunnen worden. Aan de hand van Spearmans correlatietest werden correlaties gezocht tussen de verschillende uitkomsten en autofluorescentie van de huid. Gezien de parametriciteit van weefselretentie, werd voor correlaties tussen weefselretentie en autofluorescentie een Pearsontest voor correlaties gebruikt. Vervolgens werden relevante correlaties in een liniair regressiemodel nogmaals getoetst. Voor de follow- up data is gebruik gemaakt van generalized estimating equations. Dit is een model waarin gecorrigeerd wordt voor het verschil in interval tussen de meetmomenten van verschillende patiënten. Door het verschil in meting over de tijd van alle patiënten mee te nemen wordt een gemiddelde geschat voor de hele groep.

13 Resultaten Baseline karakteristieken In de periode van januari 8 tot januari 7 werden patiënten geïncludeerd, waarvan 5 AA- amyloïdose, 73 AL en 4 ATTR-amyloïdose hadden. Bij herhaaldelijke polibezoeken werden patiënten opnieuw gescand. Dit heeft geleid tot follow up tot 5 jaar na de eerste meting. In totaal werden 88 metingen gedaan. Iedere arm werd 3 maal gescand met de AGEreader, waaruit een gemiddelde huidautofluorescentie berekend werd. In tabel worden de baseline karakteristieken van elke groep weergegeven. De follow upgegevens zijn hier niet in meegenomen. Parametrische data worden weergegeven als gemiddelde en standaard deviatie. Non-parametrische data worden als mediaan en interquartiele range (IQR) getoond, tenzij anders aangegeven. Significante verschillen tussen de individuele groepen worden met een asterisk in de tabel aangegeven. Biochemische afwijkingen weergegeven per kolom komen overeen met voorkeurslocaties voor amyloïd van de verschillende precursoreiwitten passend bij de verschillende soorten amyloïdose. Zo is de belangrijkste klinische presentatie van AA- amyloïdose nierfunctiestoornissen, voornamelijk nefrotisch syndroom. Dit uit zich in de baseline karakteristieken als slechtere nierfunctie, met name ten opzichte van de ATTR- groep, waarin nierbetrokkenheid vrijwel nooit wordt gezien. Daarnaast zijn AL- amyloïdosepatiënten gemiddeld ouder dan AA- of ATTRamyloïdosepatiënten en zijn er meer rokers in de AA- en ATTR- groepen. Tot slot zijn bij AA- patiënten gemiddeld hogere ontstekingswaarden in het bloed te vinden. Dit is geheel volgens verwachting, aangezien inflammatie-eiwitten de precursoren van amyloïd zijn in deze patiëntengroep. Opvallend is verder dat patiënten in de AL-groep geen duidelijk hogere vrij lichte ketens in het serum hebben dan andere amyloïdose patiënten. Een verklaring hiervoor kan zijn dat patiënten ten tijde van de meting al ingesteld zijn op behandeling door de hematoloog, waarbij gestreefd wordt naar minimale waarden van vrije lichte ketens (VLK). 3

14 Tabel : baseline karakteristieken AA (N=5) AL (N=73) ATTR (N=4) P-waarde Leeftijd (jaren) 54,8 (8,6) 63, () * 49 (6) ** <, Geslacht (man) 6 (4%) 3 (44%) 3 (54%),345 Rokers (%) % 5,5% * 6,7% ** <, Kreatinineklaring (ml/min) 5 (65) 78 (35) 9 (5) *,46 Serum Kreatinine (umol/l) 99 (84-33) 84 (68-6) 73 (6-94) *, CRP (mg/l) 9 (5-4) (-5) * (-) */** <, SAA (mg/l) 7,5 (4,3-38,3) (-3,5) * (-) * <, Proteïnurie (g/4h),8 (,-7,),34 (,-3,8), (-,) */** <, NT pro-bnp (ng/l) 773 (44-58) 76 (9-539) 39 (-8), Troponine T (ug/l) (-,3) (-,4) (-,3),8 γ-gt (U/L) 5,5 (9,3-37) 4,5 (6-55,8) (,-3,),68 Alkalisch Fosfatase (U/L) 7 (5-78) 73 (6-96) 6 (5-74),73 ALAT (U/L) 6 (-4) 9 (4-8) (8-5),38 Bilirubine totaal (umol/l) 6 (5-7,5) 9 (5-3) (7-7,8) *,4 VLK Kappa (mg/l) 75 (7-67) 4 (8-8) * (7-8) *,8 VLK Lambda (mg/l) 68 (-3) 47 (9-57) 3 (-5) */**, Visuale score vetbiopt (totaal (%)) : (6,7%) : 3 (%) : 3 (%) 3: (6,7%) 4: 6 (4%) : 9 (,3) : 5 (,5%) : 3 (7,8%) 3: (5,%) 4: 4 (3,9%) : 4 (6,7%) : 6 (6,7%) : (4,%) 3: 4 (6,7%) 4: 5 (,8%) Gewogen AA in 457,8 (33),3 (,6) *, (,6) * <, vetbiopt (µg/mg) Weefselretentie 49 (5) 49 (6) 45 (),699 SAP Alle normaal verdeelde waarden worden weergegeven als mean(±sd). Alle niet- normaal verdeelde waarden worden weergegeven als mediaan (IQR). Afkortingen: CRP: C-reactive protein; SAA: serum amyloïd A; NT pro-bnp: N- terminaal pro-breinnatriuretisch peptide; γ-gt: γ-glutamyltransferase ALAT: alanine-aminotranferase; VLK: vrije lichte keten; SAP: serum amyloïd P Indien er middels ANOVA of Kruskal Wallis een significant verschil tussen de drie groepen werd gevonden, werd gezocht waar dit verschil zich bevindt met behulp van ongepaarde t-test of Mann Whitney U. Legenda: * significant verschil ten opzichte van de AA- groep; ** significant verschil ten opzichte van de AL- groep.,645 In figuur worden de huidautofluorescentiewaarden per groep weergegeven. Aan de hand van de formule opgesteld door Koetsier et al(5) zijn normaalwaarden berekend voor elke patiënt. Middels een gepaarde t-toets werden gemiddelde HAF-waarden gemeten bij amyloïdosepatiënten vergeleken met de referentiewaarden. De eerste meting van elke patiënt werd vergeleken, wat een absoluut verschil in gemiddelden aantoonde van.494 AU (±.55) in de groep van AA- amyloïdosepatiënten (p=.36). In de ATTR- en ALamyloïdosepopulatie kon geen significant verschil aangetoond worden tussen de gemeten en berekende waarden. Figuur toont de scatterplot van deze gevonden resultaten. De blauwe lijn geeft het gemiddelde aan. 4

15 5 4 3 P= P=.544 a AA HAFref b AL HAFref 4 P=.97 3 Figuur a: gemeten HAF voor AA amyloïdosepatiënten vergeleken met berekende waarden. Patiënten met AA laten significant hogere HAF zien. b: AL patiënten laten geen significant verschil zien. c: ATTR patiënten laten geen significant verschil zien. c ATTR HAFref Legenda: HAFref = huidfluorescentie volgens referentiewaarde. in relatie tot amyloïddepositie Om te beoordelen of huidautofluorescentie gerelateerd is aan de mate van amyloïddepostitie werd per patiëntengroep een onderverdeling gemaakt in de mate van amyloïddepostitie op basis van de semi kwantitatieve beoordeling van vetbiopten. In figuur worden de resultaten per patiëntengroep weergegeven. In geen van de patiëntengroepen werd een relatie gevonden tussen de mate van amyloïddepostitie en huidautofluorescentie. Hierbij is duidelijk zichtbaar dat voor AA amyloïdose het verschil tussen verwacht en gevonden HAF ongeacht de mate van amyloïd in het biopt verhoogd, dit is voor de andere patiëntengroepen niet het geval. 5

16 HAFpat - HAFref HAFpat - HAFref HAFpat - HAFref Vetbiopt AA Vetbiopt AL Vetbiopt ATTR Figuur : verschil tussen gevonden en verwachte HAF uitgezet voor de visuele scores per patiëntengroep. Er werden geen significante verschillen gevonden tussen de verschillende bioptuitslagen. Legenda: HAFpat- HAFref = verschil tussen gemeten HAF bij patiënt en verwacht HAF volgens referentiewaarde. Een andere maat voor de hoeveelheid amyloïddepostitie in het lichaam is de totale weefselretentie (WR) van SAP. In figuur 3 staat per patiëntengroep het verschil tussen gemeten en verwachte huidautofluorescentie vergeleken tussen patiënten met een verhoogde weefselretentie van SAP ( 5%) en patiënten met een normale SAP- weefselretentie uit dezelfde patiëntengroep. Het is niet altijd mogelijk om een weefselretentie te bepalen, bijvoorbeeld bij patiënten die afhankelijk zijn van hemodialyse. Deze patiënten zijn in figuur 3 niet meegenomen. Voor alle patiëntengroepen lijkt huidautofluorescentie verhoogd te zijn in patiënten met verhoogde weefselretentie en dus een grotere mate van systemische amyloïddepostitie. Alleen voor de grootste groep patiënten, de AL- amyloïdosepatiënten is dit ook significant (p=,). Vervolgens werd gekeken of de absolute waarde van de weefselretentie gecorreleerd kon worden aan de mate van huidautofluorescentie. Dit was wederom alleen voor patiënten met AL-amyloïdose significant (p=,). Zoals eerder al gesteld is de weefselretentie erg afhankelijk van de nierfunctie. Wanneer in lineare regressie gecorrigeerd wordt voor kreatineklaring, is deze correlatie niet meer significant (p=.884). 6

17 HAFpat - HAFref Autofluorescence HAFpat - HAFref Autofluorescence HAFpat - HAFref Autofluorescence Weefselretentie AA 3 P=,5 4 R= -,89 p=, Weefselret <5 Weefselret > Weefselretentie (%) Weefselretentie AL 3 P=,4 5 R=,373 p=, Weefselret <5 Weefselret > Weefselretentie (%) Weefselretentie ATTR 3 P=,4 4 R=,473 p=, Weefselret <5 Weefselret > Weefselretentie (%) Figuur 3: Linker kolom: verschil tussen gevonden en gemeten HAF voor normale en verhoogde weefselretentie per patiëntengroep. Voor patiënten met AL wordt een significant verschil gevonden. Rechterkolom: correlatie tussen HAF en weefselretentie als continue variabele. Voor de AL patiëntengroep wordt een correlatie gevonden. Legenda: HAFpat-HAFref = verschil tussen gemeten HAF bij patiënt en verwacht HAF volgens referentiewaarde. 7

18 Verschil in HAF tov eerste meting (AU) Verschil in HAF (%) in relatie tot ziekteduur Bij een deel van de AL patiënten zijn in de periode van 8 tot 6 herhaaldelijk huidautofluorescentie metingen gedaan. AA en ATTR zijn zeldzamere aandoeningen, van de AA- patiënten zijn geen follow-up data, van de ATTR- patiënten zijn er slechts 5 meerdere keren gemeten, dit was onvoldoende om te analyseren. In totaal werden 73 AL- patiënten geïncludeerd. 35 hiervan kregen een tweede meting. patiënten kregen 4 of meer metingen. Deze patiënten staan in de appendix (figuur 9) uitgezet tegen de tijd in jaren. In de onderste grafiek staat voor dezelfde patiënten de verwachte huidautofluorescentie. Omdat de intervallen van de metingen niet gelijk is, kan dit alleen beschrijvend weergegeven worden. Er lijkt echter wel sprake van een snellere toename van huidautofluorescentie binnen deze patiëntengroep. Deze patiënten zijn vervolgens opgedeeld in twee groepen aan de hand van de kreatinineklaring (figuur, appendix). In de figuur is zichtbaar dat patiënten met nierfunctiestoornissen hogere HAF-waarden hebben. Het is echter niet te zeggen of de HAF-waarden over de tijd ook sneller toenemen. Vervolgens is gekeken naar het verschil tussen de eerste en laatste meting. Hier werd geen significante stijging over de tijd in gevonden. Ook wanneer de metingen in intervallen van een jaar worden ingedeeld nemen deze niet significant toe over de tijd. Deze data staat weergegeven in figuur 4. 5 r =.4 p= Tijd in jaren 4 over de tijd - -4 Jaar Jaar Jaar 3 Jaar 4 Jaar 5 Figuur 4: Bovenste grafiek: lineaire regressie van het procentuele verschil in huidautofluorescentie tussen de eerste en laatste meting. Er wordt geen significante stijging gevonden. De onderste grafiek toont het verschil in HAF per jaar ten opzicht van de eerste meting. AU = Arbitrary Units. 8

19 Middels generalized estimating equations (GEE) werd vervolgens gecorrigeerd voor het verschil in interval. In dit model worden de gemeten waarden per moment geëxtrapoleerd voor de volledige groep. Op deze manier wordt een schatting gemaakt van de gemiddelde verandering in HAF voor de hele groep. Eerst werd tijd als continue variabele in dit model gestopt. Er wordt dan een toename van,74 AU per jaar berekend (P=.8). Hierbij wordt dus elk willekeurig moment geschat voor de gehele groep op basis van wat er bekend is uit gegevens van andere patiënten uit de groep. Wanneer in dit model leeftijd ook als factor meegenomen wordt AGE s nemen immers altijd over de tijd toe is dit nog een extra toename van.66 AU per jaar (p=,49). Om de data zichtbaar te maken werden de verschillende meetmomenten ingedeeld in categorieën ten opzichte van het eerste meetmoment. De eerste meting werd meting genoemd. Alle metingen binnen het eerste jaar werden meting genoemd, alle metingen binnen het tweede jaar werden meting 3 genoemd enzovoort. Op elk vastgesteld moment na de eerste meting wordt voor de gehele groep geschat wat de gemiddelde huidautofluorescentie op dat moment zou zijn. Gezien de arbitraire indeling van deze momenten en het vormen van (kleine) subgroepen, is dit niet meer significant (p=.36). Het geeft echter wel een weergave van de stijging over de jaren (figuur 5, blauwe lijn). Ditzelfde model is gebruikt om een gemiddelde van de referentiewaarden over de tijd te plotten (figuur 5, roze lijn). Duidelijk zichtbaar is dat patiënten gedurende het gehele proces gemiddeld hogere HAF- waarden laten zien dan op basis van de referentie verwacht wordt. De lijnen lopen echter min of meer evenwijdig aan elkaar. De eerste 3 jaren laten een steilere curve zien. Ook follow- up tot dit moment laat geen statistisch significante verandering zien. HAF over de tijd.8.6 Verwachte HAF op basis van GEE Gemiddelde referentie op basis van GEE Tijd (in jaren) Figuur 5: Berekende stijging in HAF voor patiënten met AL- amyloïdose, gebaseerd op meetmoment. Een duidelijke stijging over de tijd is zichtbaar. Legenda: HAF = huidautofluorescentie; GEE = generalized estimating equations. 9

20 in relatie tot inflammatie, nierfunctie en glykemische status De laatste vraag die we wilden beantwoorden is de relatie met inflammatie, nierfunctie en glycemische status. Aan de hand van het serumkreatinine werd de nierfunctie bepaald en gecorreleerd aan de mate van autofluorescentie van de huid (figuur 6). Uitsluitend voor AL kon hier een significant verband gevonden worden. Inflammatie werd bepaald middels CRP en SAA. Dit werd gedaan voor AA en AL amyloïdose. Bij ATTR is er over het algemeen geen sprake van inflammatie, bloedwaarden van CRP en SAA waren vrijwel allemaal hetzelfde en niet verhoogd. Er kon geen relatie gevonden worden tussen deze markers van inflammatie en vorming van AGE s in de huid (figuur 7). Glucose- of HbAc controles worden niet standaard gedaan bij amyloïdose, hier zijn dus geen gegevens van. Anamnestisch had slechts van de 5 patiënten in de AA groep diabetes mellitus.

21 3 R= -,84 p=,773 AA- amyloidose 5 R =,4 p=,3 4 3 AL amyloidose a 3 4 Log Kreat 3 4 Log Kreat b 4 R=,79 p=,447 3 ATTR amyloidose c Log Kreat Figuur 6: Correlaties tussen serumkreatinine en HAF. 3b: correlatie binnen de groep van AL patiënten (n=73). In de andere groepen kon geen significante correlatie gevonden worden. 4 AA Amyloïdose R=,66 p=,84 5 AL Amyloïdose R=,99 p=,4 a logsaa b logsaa 5 AA Amyloïdose R=,44 p=,477 5 AL Amyloïdose R=, p=, c logcrp d logcrp Figuur 7: Er konden geen relaties gevonden worden tussen HAF in AA en SAA (6a), HAF in AL en SAA (6b), HAF in AA en CRP (6c) of HAF in AL en CRP (6d).

22 Discussie en Conclusie Verhoogde huidautofluorescentie van AA patiënten De belangrijkste conclusie die getrokken kan worden uit bovenstaande resultaten is dat bij patiënten met AA amyloïdose er sprake is van verhoogde huidautofluorescentie vergeleken met berekende waardes op basis van gezonde leeftijd en geslacht- gematchte personen. was niet verhoogd bij patiënten met AL en ATTR amyloïdose. Advanced glycation endproducts en amyloïdose De verhoogde huidautofluorescentie in patiënten met AA amyloïdose is meest waarschijnlijk een afspiegeling van verhoogde accumulatie van AGE s. werd gemeten met de AGE-reader, dit apparaat beschijnt de huid met licht in het specifieke spectrum van 3-4 nm en meet dan de intensiteit van de huid afkomstige licht in het spectrum van 4-6nm. Deze methode is gevalideerd voor verschillende AGE s in de huid aan de hand van huidbiopten. Vermoedelijk wordt de accumulatie van AGE s in deze patiënten veroorzaakt door nierinsufficiëntie en verhoogde oxidatieve stress ten gevolge van chronische ontsteking. AA amyloïdosepatiënten hadden in dit onderzoek significant hogere ontstekingsparameters en slechtere nierfunctie dan patiënten met ATTR of AL amyloïdose. Er werden geen correlaties gevonden tussen kreatinine en huidautofluorescentie of CRP en HAF, maar waarschijnlijk komt dit door een gebrek aan power. Er zijn slechts 5 patiënten met AA amyloïdose geïncludeerd, terwijl een steekproefgrootte van 5 berekend was voorafgaand aan het onderzoek. Daarnaast is CRP een momentopname van ontsteking, terwijl accumulatie van AGE s ontstaat tijdens langdurige oxidatieve stress. Eerdere studies laten zien dat nierinsufficiëntie geassocieerd is met verhoogde AGE accumulatie. Door nierfalen worden AGE s en AGE-precursors minder goed geklaard waardoor ze accumuleren. In de literatuur worden gemiddelde HAF-waarden van 3,64 AU gevonden voor patiënten met dialyse-afhankelijk nierfalen (CKD klasse 5)(3). Wanneer deze patiënten getransplanteerd worden, verbetert dit, hoewel het nog steeds significant hoger is dan in gezonde controles (). Andere studies laten een gemiddelde van,5 AU zien voor patiënten met mild tot matig nierfalen (CKD klasse -3b)(33). Voor patiënten met AA amyloïdose wordt een gemiddelde huidautofluorescentie van,67 met een standaard deviatie van,68 gevonden, aanzienlijk lager dan dat van patiënten met eindstadium nierfalen, maar hoger dan patiënten met nierfalen zonder dialysebehoefte. Daarnaast zijn er verschillende studies die een relatie laten zien tussen chronische ontstekingen en daarmee gepaard gaande oxidatieve stress en AGE accumulatie(8,,34). Ook roken is geassocieerd met oxidatieve stress en geeft verhoogde accumulatie van AGE s. Er zitten procentuele verschillen in het aantal rokers per patiëntengroep. Er wordt significant minder gerookt in de groep van AL amyloïdosepatiënten in vergelijking met de andere twee groepen. De gebruikte formule corrigeert echter al voor roken, de verschillen tussen gevonden en gemeten waarde zijn dus niet toe te schrijven aan oxidatieve stress door roken. De meest bekende oorzaak van AGE accumulatie is diabetes mellitus. Diabetes mellitus lijkt echter niet de verklaring voor de verhoogde AGE accumulatie in de patiënten met AA amyloïdose aangezien slechts van de 5 patiënten bekend was met deze ziekte, na exclusie van deze patiënt bleef de HAF significant verhoogd.

23 Een subklinische diabetes (gestoorde glucosetolerantie) is echter niet uitgesloten in deze populatie. Deze patiëntengroep wordt vaker behandeld met steroïden zoals prednison, welke als bijwerking een gestoorde glucosetolerantie kunnen hebben. 8 van de 5 AAamyloïdosepatiënten gebruikten prednison in een dosering tussen 7,5 en 3 mg per dag op het moment van de HAF- metingen. Het is niet uitgesloten dat prednisongebruik en daarmee gepaarde gestoorde glucosetolerantie bijdraagt aan verhoogde AGE s in deze patiëntengroep. Autofluorescentie van amyloïd Verschillende studies hebben laten zien dat bepaalde vormen van amyloïd autofluorescerende eigenschappen hebben. Bij het grootste deel van de geïncludeerde patiënten in dit onderzoek werd amyloïd in het subcutane buikvet gevonden. Uit eerder onderzoek blijkt dat 5% van de patiënten met systemische amyloïdose ook amyloïddepositie in de huid van de onderarm heeft(35). Dat autofluorescentie van AA- amyloïd de oorzaak is van de verhoogde HAF in patiënten met AA amyloïdose is echter onwaarschijnlijk. Ten eerste kon geen relatie gevonden worden tussen mate van huidautofluorescentie en gevonden amyloïd in buikvet (p=,88). Als het amyloïd de oorzaak zou zijn van de autofluorescentie zou een hoge huidautofluorescentie verwacht worden bij meer amyloïd in de huid. De initiële correlatie tussen weefselretentie en huidautofluorescentie verdwijnt na correctie voor nierfunctie. Ten tweede werden er met aanvullende witmetingen (excitatie met licht in het spectrum van in ieder geval nm) geen andere autofluorescentiepatronen gezien die zouden kunnen wijzen op autofluorescentie van andere moleculen in de huid, zoals amyloïd. Tot slot werd met behulp van fluorescentiemicroscopie gekeken of autofluorescentie aantoonbaar was in een nierbiopt met daarin depositie van AA-amyloïd. Het biopt werd bekeken met verschillende excitatiefilters in het gebied van UV, blauw en groen licht (totale spectrum: 4-7 nm). Afbeeldingen verkregen tijdens microscopie zijn weergegeven in figuur 8. Er werd met geen enkele excitatiegolflengte autofluorescentie gevonden van ongekleurd amyloïd. Dit maakt het onwaarschijnlijk dat verhoogde huidautofluorescentie in AA amyloïdosepatiënten veroorzaakt wordt door autofluorescentie van amyloïd. Onze resultaten komen overeen met eerder onderzoek van Wien et al(36). Zij hebben gekeken naar autofluorescentie van AA- amyloïd in nertsen. Hoewel bij van de nertsen wel autofluorescentie gevonden werd, kon dit in humane preparaten niet gereproduceerd worden. Deze 8 humane preparaten waren afkomstig van patiënten met zowel AA-, ATTR- en ALamyloïdose. Een mogelijke verklaring voor afwezigheid van een verband tussen HAF en mate van amyloïddepositie zou kunnen zijn dat glycatie van eiwitten een langdurig proces is en dit ten tijde van AGE-meting nog niet (voldoende) geglyceerd is. Eerdere studies laten echter zien dat in situaties van acute oxidatieve stress er ook sprake is van een tijdelijke toename van HAF (37). Aanvullend follow- up onderzoek is nodig bij AA-amyloïdosepatiënten om uit te wijzen of depositie van amyloïd in het buikvet op langere termijn geassocieerd is met verhoogde accumulatie van advanced glycation endproducts. Follow-up HAF- metingen waren wel beschikbaar van patiënten met AL- amyloïdose. Wanneer tijd als continue variabele wordt gebruikt is er sprake van een significante stijging van huidautofluorescentie over een periode van 5 jaar. Dit is een stijging van.66 AU 3

24 tegenover de.3 AU die Koetsier et al voor gezonde controles berekenden(5). Deze stijging in niet meer significant wanneer dit in categorieën ingedeeld wordt. Het verdwijnen van de significantie is toe te schrijven aan het onderverdelen van de populatie. Er ontstaan op die manier subgroepen van ongeveer patiënten. Dit heeft te weinig power om een statistisch significante schatting op te maken voor de volledige groep. Er zou bij deze analyse ook nog sprake kunnen zijn van een selectiebias. Patiënten waarvan langere follow-up data beschikbaar zijn, zijn mogelijk gezonder en laten ook op lange termijn lagere HAF-waarden zien dan patiënten met minder metingen. Dit zou kunnen betekenen dat een initieel lage HAFwaarde geassocieerd is met een gunstigere prognose. Dit is in dit onderzoek echter nog onvoldoende onderzocht. Sterktes en zwaktes van de studie Dit is de eerste studie die een verhoogde huidautofluorescentie, als marker voor verhoogde AGE accumulatie, in patiënten met AA-amyloïdose laat zien. AA-amyloïdose en ATTR amyloïdose zijn relatief zeldzaam, daardoor is het (nog) niet gelukt om voldoende mensen te includeren om te voldoen aan de berekende steekproefgrootte. Theoretisch zou het kunnen zijn dat de huidautofluorescentie in patiënten met ATTR amyloïdose wel verhoogd is vergeleken met gezonde mensen, maar dat dit niet is gevonden (type II fout), echter ook een trend naar verhoogde huidautofluorescentie werd in deze patiënten niet gezien. Doordat patiënten uitsluitend gemeten werden op momenten dat zij ook een poliklinische afspraak hadden waren we voor het verkrijgen van de data afhankelijk van deze afspraken. Follow-up data zouden beter te analyseren zijn geweest als er een vast interval tussen de metingen had gezeten. Ook voor het vergelijken met de SAP-scintigrafie waren we afhankelijk van geplande scans. De gevonden weefselretentie kon daardoor van maanden tot maximaal een jaar tevoren zijn. Aanbevelingen voor vervolgonderzoek Met deze studie hebben we geen aanwijzingen gevonden dat humaan AA amyloïd autofluoresceert en er was geen sprake van verhoogde huidautofluorescentie bij patiënten met systemische AL- en ATTR- amyloïdose. Meten van huidautofluorescentie als maat voor amyloïddepositie blijft een interessant concept. Het is snel, weinig belastend voor de patiënt en geeft ter plaatse inzicht in de mate van amyloïddepositie in de huid. Met deze studie is dit concept nog niet volledig onderzocht. Aan de hand van aanvullend onderzoek zal verder uitgezocht moeten worden of ATTR en AL amyloïd autofluorescerende eigenschappen hebben en welke excitatiegolflengtes hiervoor nodig zijn. Dit zou middels fluorescentiemicroscopie met een vergelijkbare opzet als hierboven beschreven onderzocht kunnen worden. Vervolgens zou gekeken moeten worden of het exciterende licht de huid afdoende penetreert om het amyloïd te bereiken. De AGE-reader penetreert diep genoeg om AGE s te exciteren, dit is echter geen garantie dat dit voor amyloïd ook geldt. In een alternatieve opzet om amyloïd te detecteren door meting van huidfluorescentie zou gebruik gemaakt kunnen worden van curcumine. In onderzoek naar m. Alzheimer, een aandoening die ook veroorzaakt wordt door amyloïd, wordt curcumine regelmatig genoemd als remming van amyloïdogenese (38,39). Bovendien kunnen door orale toediening van curcumine β-amyloïdplaques in de retina zichtbaar gemaakt worden (4-4). Curcumine bindt echter ook andere vormen van amyloïd (43). Curcumine is een klein molecuul en het bindt 4

25 aan amyloïd op een vergelijkbare manier als Congo Rood. In tegenstelling tot Congo Rood is curcumine niet toxisch als het oraal of intraveneus wordt toegediend. Curcumine autofluoresceert bij een excitatie golflente van rond de 4nm en heeft een emissie van rond de 55. In het nierbiopt dat we gekleurd hebben met curcumine werd autofluorescentie van (AA-) amyloïd gezien (figuur 8c). Figuur 8: seriële vriescoupes nierbiopt van patiënt met AA amyloïdose. Afbeeldingen verkregen middels Nuance FX spectraalsysteem (CRi, Woburn, USA), vergroting x a: Congorood- kleuring toont amyloïd (4+) aan rondom de niertubuli in hetzelfde patroon als zichtbaar in curcumine (8c) - en h-ftaa (8d)- kleuring. b: Dezelfde coupe als 7a onder gepolariseerd licht. De appelgroene dubbelbreking is bewijzend voor amyloïdose. c: Curcumine DAPI filter(4-7) emissiepiek 55 (spectrum 49-7) d: h-ftaa- kleuring Cy3- filter (53-7) emissiepiek 55 e: Ongekleurde coupe Cy3- filter (53-7) gecombineerd met FITc- filter (5-7). Er wordt geen aankleuring gezien in een herkenbaar patroon, dit geldt ook voor alle andere filters en emissiespectra. 5