Kweek van Chaetoceros muelleri op afvalwater viskweek

Transcriptie

1 Kweek van Chaetoceros muelleri op afvalwater viskweek Eindrapport Instituut: Hogeschool Zeeland Opleiding: Aquatische Ecotechnologie Onderdeel: Minor Projectleider: ir. A Verkuysse J.A.M. van der Welle Lectoraatsbegeleider: msc. J. van Houcke Ir. M. Michels drs. J.R. Heringa Opdrachtgever: ir. M. Michels Plaats en jaartal: Vlissingen 2011 Datum van uitgave: 5 juli 2011 Studenten: Niels Gelderland Roel Maas

2 Kweek van Chaetoceros muelleri op afvalwater viskweek Eindrapport Instituut: Hogeschool Zeeland Opleiding: Aquatische Ecotechnologie Onderdeel: Minor Projectleider: ir. A Verkuysse J.A.M. van der Welle Lectoraatsbegeleider: msc. J. van Houcke Ir. M. Michels drs. J.R. Heringa Opdrachtgever: ir. M. Michels Plaats en jaartal: Vlissingen 2011 Datum van uitgave: 5 juli 2011 Studenten: Niels Gelderland Roel Maas

3 Samenvatting Het kweken van schelpdieren in bassins op land (onder gecontroleerde omstandigheden) vereist dat er grote hoeveelheden microalgen voorhanden zijn om een goede groei en productie van schelpdieren te realiseren. Voor het kweken van deze algen (voor schelpdieren) zijn de nodige kosten verbonden. De grootste kostenposten zijn: grondprijs, het kweeksysteem en voedingstoffen voor de algen. Om schelpdierkweek op land rendabel te maken zullen, waar mogelijk, deze kosten gereduceerd moeten worden. Een stichting die zich bezig houdt met het kweken van vis op het land is stichting Zeeuwse Tong. Voor het project De Zeeuwse Tong is het van belang dat er een gesloten kringloop ontstaat in de zilte productie op het land. Dit houdt in dat tong gekweekt wordt zonder vervuiling, verlies van nutriënten of vervuild afvalwater. Hiervoor is een kringloop ontwikkeld. Eerst wordt de tong gevoerd met zagers. Op het afvalwater van de tong zullen hierna algen worden gekweekt. Deze algen worden aan schelpdieren toegevoegd, waarna de overgebleven algen met afvalwater weer naar de zagers worden verpompt. Hierna begint de kringloop weer opnieuw. Bij het promotie onderzoek van ir. M. Michels wordt er in een fotobioreactor gekweekt met de algensoort Chaetoceros muelleri, welke tot de diatomeeën behoort en zou kunnen dienen als voedselbron in de aquacultuur. Deze algen worden momenteel gekweekt op het standaard Walne medium, wat hoge kosten met zich meebrengt. In de toekomst zou deze fotobioreactor mogelijk op afvalwater van een viskwekerij kunnen draaien. Eerdere experimenten met Chaetoceros muelleri laten zien dat het afvalwater in potentie geschikt is. Voor opschaling naar praktijkschaal is nadere studie nodig over de bruikbaarheid van het afvalwater. Er is onderzoek en monitoring gedaan naar de groei van de algen en de opname van fosfaat, nitraat en silicaat door de algen op het Walne-medium en het afvalwater van de viskwekerij is. In het onderzoek is naar voren gekomen dat het afvalwater een prima vervanger is voor het huidig gebruikte Walne-medium. Er is een evenredige groei en opname van de nutriënten te zien. In een kleinschalige proef is een continu systeem met input en output getest, de manier waarop het op grote schaal toegepast zou moeten worden. De proef heeft laten zien dat opschaling mogelijk is en er een continue productie van algen met een dergelijk systeem mogelijk is.

4 Inhoudsopgave 1. Inleiding 1 2. Achtergronden Chaetoceros muelleri Groei van een algencultuur Medium Literatuur Verhouding N:P:Si Behandeling afvalwater 6 3. Methode Opzet experiment Batch-cultuur Continu cultuur Beluchting Belichting Steriel werken Enten en bemonstering Autoclaveren Chloreren Monitoring Algentellingen Biomassabepalingen Nutriënten bepaling Volumetrische productiviteit Resultaten en discussie Batch-cultuur Algengroei Algenconcentratie Biomassa Biomassa per alg Nutriënten opname door Chaetoceros muelleri Opname N door Chaetoceros muelleri Opname P door Chaetoceros muelleri Opname Si door Chaetoceros muelleri Continu cultuur Algengroei en productiviteit continu cultuur Algengroei Productiviteit continu cultuur Nutriënten opname door Chaetoceros muelleri 24

5 4.3 Verhouding N:P:Si Verhoudingen N:P:Si in Walne-medium Verhoudingen N:P:Si in het afvalwater Limitering Conclusie Discussiepunten Literatuur 32 Bijlage 33 Bijlage 1. Protocol NO3- analysis in seawater 33 Bijlage 2. Overige grafieken Walne- en afvalwater batch kweken 35 Bijlage 3. Gegevens gewicht per alg 44 Bijlage 4. Gegevens alle kweken 45 Bijlage 5. Gegevens ratioberekeningen 48

6 1. Inleiding Verschillende Zeeuwse ondernemers en onderzoeksprojecten zijn bezig met het klein- of grootschalig kweken van schelpdieren op het land. Schelpdieren (mosselen, oesters, kokkels) worden nog voornamelijk in het buitenwater gekweekt, omdat het voedsel, (micro) algen, voor deze schelpdieren daar kosteloos voorhanden is. Het kweken van schelpdieren in bassins op land (onder gecontroleerde omstandigheden) vereist dat er grote hoeveelheden microalgen voorhanden zijn om een goede groei en productie van schelpdieren te realiseren. Voor het kweken van deze algen (voor schelpdieren) zijn de nodige kosten verbonden. De grootste kostenposten zijn: grondprijs, het kweeksysteem en voedingstoffen voor de algen. Om schelpdierkweek op land rendabel te maken zullen, waar mogelijk, deze kosten gereduceerd moeten worden. Een stichting die zich bezig houdt met het kweken van vis op het land is stichting Zeeuwse Tong. Voor het project De Zeeuwse Tong is het van belang dat er een gesloten kringloop ontstaat in de zilte productie op het land. Dit houdt in dat tong gekweekt wordt zonder vervuiling, verlies van nutriënten of vervuild afvalwater. Hiervoor is een kringloop ontwikkeld. Eerst wordt de tong gevoerd met zagers. Op het afvalwater van de tong zullen hierna algen worden gekweekt. Deze algen worden aan schelpdieren toegevoegd, waarna de overgebleven algen met afvalwater weer naar de zagers worden verpompt. Hierna begint de kringloop weer opnieuw. Op deze manier ontstaat een gesloten kringloop waarin zo min mogelijk afvalwater geloosd wordt en een minimum aan vervuiling optreedt. Het kweken van algen op afvalwater van een viskwekerij omvat dus een onderdeel van deze kringloop. Eerdere experimenten op de Hogeschool Zeeland (HZ), met de kweek van de alg Phaeodactylum op het afvalwater van Seafarm (tarbotkwekerij) in 900 liter bakken, hebben laten zien dat de productie van deze alg vergelijkbaar is met die productie op standaard medium. Ook andere experimenten in het afgelopen semester met Chaetoceros muelleri laten zien dat het afvalwater in potentie geschikt is. Voor opschaling naar praktijkschaal is nadere studie nodig over de bruikbaarheid van het afvalwater. Bij het promotieonderzoek van ir. M. Michels wordt er in een fotobioreactor gekweekt met de algensoort Chaetoceros muelleri, welke tot de diatomeeën behoort en zou kunnen dienen als voedselbron in de aquacultuur. Deze algen worden momenteel gekweekt op het standaard Walne medium. In de toekomst zou deze fotobioreactor mogelijk op afvalwater van een viskwekerij kunnen draaien. Aan ons de taak om te onderzoeken en monitoren wat de groei van de algen en de opname van fosfaat, nitraat en silicaat door algen op het Walne medium en het afvalwater van de viskwekerij is. Hierdoor moet het duidelijk worden of er een vergelijkbare biomassa of zelfs hogere biomassa aan algen behaald kunnen worden Om dit doel te bereiken is de volgende centrale vraag opgesteld: Is het mogelijk om met het afvalwater van een viskweek (Seafarm) een vergelijkbare biomassa aan algen (Chaetoceros muelleri) te behalen in vergelijking met het Walne medium? 1

7 Naast deze centrale vraag, worden de volgende deelvragen gesteld: 1. Wat is de nitraat/fosfaat/silicaat verhouding in het Walne medium en het afvalwater? 2. Wat is de opname van nitraat/fosfaat/silicaat in mg/per biomassa algen in het Walne medium en het afvalwater 2

8 2. Achtergronden 2.1.Chaetoceros muelleri De diatomeeënsoort Chaetoceros muelleri is tijdens het onderzoek gebruikt. Diatomeeën zijn algen en vormen een belangrijke groep binnen het fytoplankton in zee. Diatomeeën hebben een harde beschermlaag, opgebouwd uit silicaat. Ze worden daarom ook wel kiezelwieren genoemd. Chaetoceros is het grootste geslacht onder de zoutwater diatomeeën met ongeveer 400 soorten. De soort Chaetoceros muelleri heeft vier uitsteeksels om het drijfvermogen te vergroten. Ze variëren in grootte van 3-20 µm. Chaetoceros is een voedingsbron voor rotiferen, mossels, oesters en garnalen. De optimale groeitemperatuur voor Chaetoceros ligt rond de 18 C. (Hoff en Snell, 2001) Scientific classification Domain: Eukaryota Kingdom: Chromalveolata Phylum: Heterokontophyta Class: Order: Bacillariophyceae Centrales Fig. 1: Chaetoceros muelleri Suborder: Biddulphiineae Family: Genus: Chaetocerotaceae Chaetoceros (Ehrenberg, 1844) Fig. 2: Wetenschappelijke classificatie 3

9 2.2.Groei van een algencultuur Een algencultuur ontwikkelt zich door enkele groeifasen te doorlopen. In figuur 3 worden deze fasen weergegeven in een groeicurve. De fasen worden aansluitend besproken. Fig. 3: Groeifasen algencultuur (Hoff en Snell, 2001) 1. Introductiefase (Lag-fase) De introductiefase of Lag-fase is de fase waarin de dichtheid van het aantal cellen niet of nauwelijks toeneemt. De algen hebben een korte periode nodig om te acclimatiseren en te wennen aan hun nieuwe omgeving alvorens ze gaan groeien. 2. Exponentiële fase (Log-fase) Nadat de algen zich hebben geacclimatiseerd aan de kweekcondities, vindt er een exponentiële groeifase plaats. Hierin zal de celdeling zich zodanig versnellen dat de stijging in aantal als logaritmisch beschouwd kan worden. De exponentiële groeifase is afhankelijk van de aanwezige lichtcondities, temperatuur en nutriënten en verschilt per algensoort. 3. Stationaire fase In deze fase zullen er evenveel algen bijkomen als dat er afsterven. Bij een grotere dichtheid van algen binnen de cultuur zal dit leiden tot een korte stationaire fase. Cellen welke in deze fase geoogst worden, hebben vaak al een lagere calorische waarde, omdat door de algen onderlinge concurrentie plaats vindt op gebied van ruimte, licht en nutriënten wat energie kost. 4. Crash fase De dichtheid van de cultuur neemt sterk af (cultuur stort in). Oorzaken hiervan kunnen zijn: gebrek aan nutriënten, tekort aan koolstofdioxide of verandering van de ph. Een ingestorte cultuur kan niet opnieuw worden opgestart. 4

10 2.3.Medium Om een algencultuur te laten groeien zijn er nutriënten nodig. Normaal gezien zitten deze nutriënten in een medium. Omdat de diatomee een zoutwater alg is, werd er gebruikt gemaakt van zoutwatermedium. Het in dit onderzoek gebruikte zoutwatermedium is het Walne-medium (Laing 1991). Deze is opgebouwd uit de deeloplossingen A, B, C, D en E. De deeloplossingen A (1000ml) en B (100 ml) moeten ter preparatie worden verhit. Voor het maken van standaardoplossing C (200ml), D (1000ml) en E (250ml) is het zwenken van de oplossing voldoende. Tabel 1. De stoffen en concentraties voor oplossing A Oplossing Hoeveelheid Concentratie Stof A 1.0 ml/l 0,8 g/l FeCl 3 0,4 g/l MnCl 2, 4H 2 O 33,6 g/l H 3 BO 3 45,0 g/l EDTA 20,0 g/l NaH 2 PO 4, 2H 2 O 100,0 g/l NaNO 3 1,0 ml Solution B Tabel 2. De stoffen en concentraties voor oplossing B Oplossing Hoeveelheid Concentratie Stof B 1,0ml in opl. A 2,1 g/100ml ZnCl 2 2,0 g/100ml CoCl 2, 6H 2 O 0,9 g/100ml (NH4)6Mo 7 O 24, 4H 2 O 2,0 g/100ml CuSO 4, 5H 2 O 10,0 ml geconcentreerd HCl Tabel 3. De stoffen en concentraties voor oplossing C Oplossing Hoeveelheid Concentratie Stof C 0,1ml/l 0,2 g/200ml Vitamine B 1 25,0 ml Solution E Tabel 4. De stof en concentratie voor oplossing D Oplossing Hoeveelheid Concentratie Stof D 2 ml/l in opl. 40,0 g/l Na A en C 2 SiO 3, 5H 2 O Tabel 5. De stof en concentratie voor oplossing E Oplossing Hoeveelheid Concentratie Stof E 25,0ml in 0,1 g/250ml Vitamine B opl. C 12 5

11 De oplossingen A en D worden allereerst toegevoegd aan gefiltreerd zeewater. Oplossing D bevat silicaat wat nodig is voor de opbouw van het exoskelet van de diatomeeënsoort die tijdens het experiment is gebruikt. Om dit te desinfecteren, wordt de erlenmeyer met de oplossingen en het zeewater in de autoclaaf gezet. Hierna moet de erlenmeyer afkoelen en kunnen de algen worden toegevoegd (in dit geval 100 ml) met een steriele pipet. Deze hoeveelheid is afhankelijk van het volume waarin het wordt geïnoculeerd. In 100 ml ongeveer 10 ml toevoegen, in 2 L ongeveer 100 ml toevoegen en bij een volume van 40 L dient ongeveer 2 L toegevoegd te worden. Om te voorkomen dat de vitaminen kapot gaan, moet oplossing C pas worden toegevoegd als de erlenmeyer is afgekoeld. Ook dit moet op steriele wijze gebeuren. 2.4 literatuur Voor de literatuurrecherche is er gekeken naar de verhoudingen van de nutriënten C:N:P:Si (koolstof : stikstof : fosfor : silicium), in de diatomee Chaetoceros muelleri. ook is er gekeken naar de verschillende voorbehandelingen van afvalwater voor algenkweek. De verhouding in Chaetoceros muelleri staat gelijk aan de verhoudingen in de opname, welke tot de deelvragen van het onderzoek behoort. In het onderzoek wordt gebruik gemaakt van afvalwater voor de kweek van algen. Omdat de informatie uit de literatuurrecherche zeer relevant is voor ons onderzoek en de resultaten kan onderbouwen worden deze hier kort beschreven Verhouding N:P:Si Bij de literatuurrecherche is er gekeken naar de verhouding tussen C:N:P:Si in Chaetoceros muelleri. In het onderzoek wordt er niet gekeken naar C en wordt daarom hier niet behandeld. In de literatuurrecherche zijn er geen gegevens gevonden over de verhoudingen van de aangegeven elementen voor Chaetoceros muelleri. Wel zijn er van twee nauwverwanten soorten van Chaetoceros muelleri de ratio van N:P:Si gevonden. Een artikel over de optimalisatie van de N:P:Si ratio voor de alg Chaetoceros gracilis geeft een N:P:Si ratio van 12:1:10,5 (Sektiana S.P. 2008)en een andere optimalisatie voor Chaetoceros amani geeft ook een N:P:Si ratio van 12:1:10,5 ( Pembimbing M.T. (2006). Deze soorten zijn nauwverwant en maakt het aannemelijk dat de N:P:Si ratio voor Chaetoceros muelleri ook ongeveer 12:1:10,5 bedraagt Behandeling afvalwater Voordat het afvalwater geschikt is voor de kweek van algen is het van belang dat het afvalwater voorbehandeld wordt. In het onderzoek is het afvalwater gefiltreerd om het grove organisch materiaal eruit te filtreren en vervolgens gechloreerd of geautoclaveerd afhankelijk van het volume. Sunja et all(2010) beschrijft een onderzoek waarin algen gekweekt werden op afvalwater dat op twee manieren voorbehandeld werd, namelijk: Filtreren op verschillende filtratie (0,20 0,45 en 1,0 µm filters) en door UV-B straling in verschillende doses (270, 540 en 1620 mj*cm -2 ). Ter controle werd er ook een kweek gehouden op afvalwater die in de autoclaaf was gezet. 6

12 Het experiment werd uitgevoerd in een 1L Erlenmeyer met 500 ml effluentwater, die eerst in een schudincubator had gestaan. J Fig. 4: Verloop verschillende voorbehandeling afvalwater op de groei van algen Uv-straling is een technologie die wordt gebruikt in de aquacultuur om micro-organismen te inactiveren. Uv-straling wordt toegepast in Europese kwekerijen en groeien uit installaties die gebruikmaken van recirculatie systemen om bijvoorbeeld tarbot en zeebaars te kweken. Bij een hogere dosis aan UV zullen er meer micro-organismen inactief worden, Sharrar and Summerfelt (2007) In figuur 4 is te zien dat de algen bij het gefilterde afvalwater met filtratie 0,2 µm het beste groeit en bij de Uv-stralen (540 en 270) lagen ver onder de controle lijn. Dit is te verklaren doordat de dosis UV niet hoog genoeg was om bacteriën en protozoa inactief te maken. De overige methodes liggen dicht tegen de controle lijn aan, wat betekent dat deze acceptabel zijn om algen op te kunnen kweken. 7

13 3. Methode 3.1.Opzet experiment Het doel van het experiment is om algen te kweken op afvalwater in vergelijking met Walne-medium. De algen werden eerst op kleine schaal (10 ml in 100 ml) gekweekt om een eigen cultuur te hebben, waardoor ze, door middel van overenten, in tact kunnen blijven. De 100 ml kweek wordt uiteindelijk overgeënt naar een erlenmeyer van 2,5 liter, om de algen eerst tot een geschikt aantal te laten groeien alvorens ze in de cilinders van 20 L worden geënt (figuur 5). Dit wordt gedaan, omdat de algen bij een lage concentratie een kleinere kans hebben om te overleven. In de cilinders worden de algen gekweekt op afvalwater of op het zout grondwater met Walne-medium. Al het gebruikte afvalwater is eerst gefiltreerd met behulp van een trechter met filter om alle vlokken te verwijderen. Het afvalwater en het grondwater met het Walne-medium in de cilinders is ook steriel, dit wordt in hoofdstuk nader behandeld In het onderzoek is er gebruik gemaakt van twee verschillende kweekculturen. Een batch-cultuur, waarbij er niet wordt geoogst en geen nieuw medium wordt toegevoegd, waardoor op den duur de crash fase behaald wordt en een continu-cultuur. Bij deze cultuur wordt er geoogst tijdens de exponentiële (log) fase en wordt er nieuw medium toegevoegd, waardoor de cultuur kan blijven groeien Batch-cultuur De opzet van de batch-cultuur is in figuur 5 te zien waar twee kweken zijn weergegeven. Het zijn 25 liter cilinders die met 20 liter medium of afvalwater gevuld zijn waar algen op groeien. Deze gesloten cultuur is aangesloten op beluchting en wordt door tl-buizen voorzien van licht. Het bemonsteren gebeurt door een slang aan te sluiten op de ingang van de beluchting en de slang van de beluchting aan te sluiten op het ontluchtings gat, waardoor er algen met medium door het buisje van de ontluchting omhoog komt en zo bemonsterd kunnen worden. Op deze manier wordt de kans op besmetting van buitenaf zo klein mogelijk gehouden. Op deze manier zijn er drie kweken op afvalwater vergeleken met drie kweken op grondwater met Walne-medium toegevoegd. Elke door de weekse dag is er een monster genomen, van de genomen monsters werd het volgende bepaald: algenconcentratie (cel/ml), biomassa, fosfaat, nitraat en silicaat. De waarden voor fosfaat, nitraat en silicaat kunnen worden omgerekend naar fosfor (P), stikstof (N) en silicium (Si). Door het dagelijks monitoren kan het verloop van de groei gezien worden en de opname van P,N en Si wat terug is te zien in een afname in het water. Doordat bekend is hoeveel van de elementen N, P en Si in het begin in water zit en op het einde kan er gezien worden hoeveel van elke elementen is opgenomen, waardoor het mogelijk is een begin ratio en een opname ratio weer te geven. Door de opname ratio te vergelijken met de begin ratio kan het limiterende element bepaald worden. Ook de toename van de biomassa is bekend, waardoor bij het delen van hoeveelheid opgenomen elementen N,P en Si bij de toename van de biomassa aan alg het massa deel (percentage) van het element in de alg bepaald kan worden. Aan de hand van het limiterend element en het percentage wat dit element bevat van de alg, kan de maximale productiviteit berekend worden. 8

14 Deze resultaten van Walne-medium en afvalwater worden onderling vergeleken en zo mogelijke verschillen aan het licht te brengen. Door de resultaten te vergelijken kan er gezien worden in hoeverre het afvalwater geschikt is voor de kweek van Chaetoceros muelleri in verhouding met het standaard Walne-medium. De kweken zijn gedurende 7 tot 11 dagen gemonitoord, in de resultaten van de bepalingen zullen van Walne-medium en afvalwater elk van één kweek de resultaten worden weergegeven. Fig. 5: Algenkweekopstelling Continu cultuur Er is ook gebruik gemaakt van een continu cultuur, de manier waarop het kweken en oogsten van de algen in grote schaal toegepast zal moeten worden. De continu cultuur is gekweekt op gefiltreerd afvalwater. Deze cultuur wordt gekweekt in dezelfde cilinders die gebruikt worden voor de batch cultuur met dezelfde beluchting en licht. Op de cilinder worden twee tappunten aangebracht die leiden naar twee andere cilinders (figuur 6) Door een doseerpomp (figuur7 ) wordt er uit de cilinder met de algenkweek geoogst. Met dezelfde snelheid word er nieuw gefiltreerd afvalwater uit een grote cilinder gepompt, waardoor het volume van de algenkweek gelijk blijft. In figuur 8 is de opzet schematisch weergegeven. De doseerpomp wordt aangesloten tijdens de exponentiële fase waar de groei optimaal is, zodat voor de hoogste productiviteit gezorgd wordt. In dit geval is de pomp op 6 aangezet. De doseerpomp pompt gedurende 15 uur met een snelheid van 0,264 l/uur, zodat elke dag 4 liter geoogst wordt en vers afvalwater wordt toegevoegd. De cilinder bevat 20 liter, wat neerkomt op een verversing van 20% per dag. De zelfde bepalingen zoals beschreven bij de batch cultuur worden hier verricht. Doordat er telkens vers afvalwater wordt toegevoegd, blijven er nutriënten beschikbaar voor de groei. Door de kwaliteit van het afvalwater (inflow) te vergelijken met de oogst (outflow) kan het 9

15 zuiveringsrendement van de algenbepaald worden. Ook wordt de volumistische productiviteit berekend die in paragraaf verder wordt toegelicht Fig.7: Doseerpomp Fig. 6:Opstelling Continu Cultuur Fig. 8: Schematische opstelling Continu cultuur 10

16 3.1.3 Beluchting Om een algencultuur te kunnen kweken, is beluchting noodzakelijk. Algen hebben CO 2 nodig om te kunnen groeien. De lucht wordt aangevoerd door een luchtpomp. De lucht wordt getransporteerd in rubberen slangetjes. De lucht gaat door een luchtfilter om de kans tot besmetting te verkleinen. Er zit een tweede gat in het deksel waar lucht vanuit kan ontsnappen, anders zou door de luchtdruk het deksel eraf schieten. Het gat is gedicht met watten om besmetting van buitenaf te voorkomen Belichting Om de algencultuur optimaal te kweken, wordt gebruik gemaakt van Tl-licht (24 uur/dag) en zonlicht, dat noodzakelijk is om fotosynthese en groei te doen plaatsvinden. De Tl-buizen zijn aan de achterkant van de opstelling geplaatst, zodat het zonlicht niet wordt afgeschermd. De erlenmeyers en cilinders worden zo opgesteld dat de omstandigheden voor elke erlenmeyer gelijk is. 11

17 3.2 Steriel werken Het is van groot belang dat de algenculturen niet besmet worden. Daarom is het van groot belang dat er steriel gewerkt wordt Enten en bemonstering Wanneer de stop van de erlenmeyers die gebruikt worden om de algen te kunnen kweken wordt verwijderd om een monster te nemen of om over te enten, moet er een brandende gasbrander met blauwe vlam naast de erlenmeyers staan om te voorkomen dat er van bovenaf bacteriën, protozoa en zoöplankton in de erlenmeyers terecht kunnen komen. De pipet (glas) waarmee het monster genomen wordt, wordt verhit in de vlam van de gasbrander om mogelijk levend materie te vernietigen. Voordat de erlenmeyer weer wordt afgesloten wordt de kop van de erlenmeyer ook verhit in de vlam. Voor het overenten wordt een vacuüm verpakte steriele pipet gebruikt Autoclaveren De erlenmeyers met het Walne-medium of gefiltreerd afvalwater die gebruikt worden bij het opkweken van de algen worden gesteriliseerd. Hierbij is gebruik gemaakt van de autoclaaf (figuur 9). De autoclaaf werkt door het onder druk zetten van stoom waardoor onder andere glaswerk gesteriliseerd kan worden. Om na het autoclaveren besmetting te voorkomen zijn de erlenmeyers, voordat ze de autoclaaf ingaan, eerst verpakt met aluminiumfolie. Ook de doppen met luchtslangen moeten worden verpakt. Als de erlenmeyers zijn afgekoeld kunnen de algen worden toegevoegd Chloreren De cilinders bevatten grote hoeveelheden afvalwater of zout grondwater met het Walne-medium, die niet geautoclaveerd kunnen worden. Om het afvalwater en zout grondwater steriel te krijgen wordt chlorering toegepast. Er word 20ml chloor aan de cilinders (20L) toegevoegd om al de levende materie te doen vernietigen. De gaten in de deksel worden afgesloten zodat er niks van buitenaf in de cilinder kan komen. Na 24 uur word er 2 gram natriumthiosulfaat toegevoegd die met behulp van beluchting, het aanwezige chloor uit de cilinder te doet verdrijven. zodat de algen aan een leefbare omgeving toegevoegd kunnen worden. Fig. 9: Autoclaaf 12

18 3.3 Monitoring In dit hoofdstuk worden alle metingen en bepalingen die uitgevoerd zijn behandeld en beschreven Algentellingen De algentellingen worden gedaan met een Bürkertürk telraam (figuur 10) op een lichtmicroscoop. Met een glazen pasteurpipet wordt een hoeveelheid algen op het telraam aangebracht. Door cohesiewerking tussen het telraam en het afdekglaasje, wordt het monster onder het afdekglaasje gezogen. Een Bürkertürk telraam bestaat uit grote hokken met een oppervlakte van 0,04 mm 2 en een diepte van 0.1 mm. Daarnaast bestaat het telraam ook uit kleine hokjes met een oppervlakte van 0,025 mm 2. Met een 400x vergroting op de microscoop kunnen het aantal algen per 0,004 mm 3 geteld worden. Om een representatief getal voor het aantal algen per 0,004 mm 3 te krijgen, werden er 25 grote hokken geteld. Wanneer het aantal algen per 0,004 mm 3 bekend is, kunnen het aantal algen per liter berekend worden. Als één groot hok tussen 25 en 30 algen telt, worden er voor het gemak minimaal 40 kleine hokjes geteld. Dit geeft dezelfde nauwkeurigheid. Voorbeeld berekening Voor het berekenen van het aantal algen per milliliter is gebruik gemaakt van de volgende formule: = (getal* 1000)/(25*0,004) Stel nu dat er in 25 hokjes van de Bürkertürk bij elkaar opgeteld 270 algen aanwezig zijn. Het aantal algen per milliliter is dan: =(270*1000)/(25*0,004) = algen per milliliter. Fig.10: Bürkertürk telraam 13

19 3.3.2 Biomassabepalingen Door middel van algentellingen kan niet alleen de concentratie van de algen berekend worden, maar kan er ook gekeken worden naar biomassabepalingen, die mede verantwoordelijk is voor kwaliteit van de algen. Zo kan bijvoorbeeld de biomassa van twee monsters verschillen terwijl de algenconcentratie gelijk is. In dat geval is de kwaliteit van het monster met de lagere biomassa slechter dan het monster met een hogere biomassa. Omdat bij biomassabepalingen met minimale gewichten gewerkt wordt, is het van belang dat de metingen uiterst nauwkeurig worden uitgevoerd. Hiervoor is een vaste volgorde ontwikkeld. Om een nauwkeurige meting van het gewicht van het filter te verkrijgen is het van belang dat het filter voor gedurende 24 uur in de droogstoof van 80 o C wordt geplaatst. Hierna is het van belang dat het filter in een exsiccator (figuur 11) kan afkoelen zodat het filter geen vocht uit de lucht aantrekt. Het gewicht wordt dan bepaald met een analytische balans (figuur 12) Een bekende hoeveelheid volume wordt gefiltreerd met behulp van een vacuümpomp (figuur 13). Om te voorkomen dat er zout in het filter achterblijft wordt er voor- en nagespoeld met ammoniumformaat. Hierna moet het filter voor 24 uur in de droogstoof geplaatst worden (figuur 14). Na 24 uur wordt het filter in de exsiccator gezet om af te koelen. Dit wordt gedaan met een grijptang, om contact met de handen te voorkomen, zodat er bijvoorbeeld geen vet overgebracht wordt en de meting nauwkeurig blijft. Na enige tijd kan het gewicht gewogen worden van het filter met algen. Het verschil in gewicht is gelijk aan de biomassa van algen. Fig.11: Exsiccator Fig.12: Analytische balans 14

20 Fig.13: Vacuümpomp Fig.14: Aluminium bakje met algen op filter in droogstoof Nutriënten bepaling De nutriënten nitraat, fosfaat en silicaat zijn gedurende het onderzoek dagelijks gemonitord, om het verloop in de tijd te kunnen zien. Silicaat en fosfaat zijn in de HACH-kit bepaald volgens het algemene voorschrift. Voor het bepalen van nitraat is er gebruikt gemaakt van de Perkin Elmer Spectrophotometer (Bijlage 1). Deze methode is gebaseerd op het analyseren in ultraviolette straling. De absorptie is gemeten op 220 nm. en 275 nm. De reden waarom nitraat op deze manier gemeten wordt is omdat nitraat in zout water alleen door middel van ultraviolette straling gemeten kan worden en dus niet met de HACH-kit Volumetrische productiviteit Uit de verversingssnelheid valt op te maken hoeveel liter er per dag uit de continu cultuur geoogst wordt. Dit zegt echter weinig over de totale hoeveelheid biomassa die geoogst wordt. Als er bijvoorbeeld 2 liter cultuur met een biomassa van 0,5 g l -1 geoogst wordt, dan is de totale productie 1 g. Als er daarentegen 1 liter cultuur met een biomassa van 1,2 g l -1 geoogst wordt, dan is de totale productie 1,2 g. De productiviteit van een continu cultuur wordt aangeduid met volumetrische productiviteit. De volumetrische productiviteit (g l -1 dag -1 ) wordt bepaald door de verversingssnelheid (dag -1 ) met de biomassa (g l -1 ) te vermenigvuldigen. Omdat er gestreefd wordt naar een optimale productiviteit is een maximale volumetrische productiviteit gewenst. 15

21 4.Resultaten en discussie 4.1 Batch-cultuur Hier zullen al de resultaten van de kweken in de batch-cultuur weergegeven worden. In de grafieken worden telkens de gegevens van een kweek op afvalwater en het Walne-medium weergegeven, zodat er een goede vergelijking gemaakt kan worden. De kweken zijn in triplo uitgevoerd. In de grafieken zijn telkens de gegevens van slechts één kweek weergegeven, de overige grafieken en de tabellen zijn in bijlage 1 weergegeven. De weergegeven gegevens van de cultuur op Walne-medium behoren allen tot dezelfde cultuur Algengroei Algenconcentratie (aantal algencellen/ml *10 6 ) 8,00 Algenconcentratie 7,00 Algenconcentratie 6,00 5,00 4,00 3,00 2,00 Walne (18-3 t/m 4-4) Afvalwater '2' (16-5 t/m 24-5) 1,00 0, Fig. 15 :Algenconcentratie Batch In figuur 15 is de algenconcentratie weergegeven. Het verloop van de grafieken komt overeen met de theoretische groeifases. Op het begin is een introductie fase te zien waar de groei op gang komt, gevolgd door een exponentiële fase. De groei gaat steeds langzamer naarmate de top van de groei behaald wordt. Bij de cultuur op het Walne-medium is de stationaire fase goed te zien, gevolgd door de crash fase waar de cultuur instort. Bij de cultuur op afvalwater is er gestopt met de monitoring zodra er een afname in groei gemeten was. De groei van beide culturen heeft dezelfde vorm. De cultuur op afvalwater laat een snellere groei zien, maar gekeken naar de andere culturen kan er niet geconcludeerd worden dat ze sneller groeien op afvalwater. Mogelijk heeft de start van de groei te maken met hoe fit en geacclimatiseerd de cultuur is. De cultuur op het Walne-medium laat een maximale concentratie algen zien van 6,78*10 6 cellen/ml. De culturen op afvalwater laten een maximale concentratie van 5,66*10 6 cellen/ml. 16

22 Biomassa Biomassa concentratie Biomassa concentratie (g/l) 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 Walne (18-3 t/m 4-4) Afvalwater '2' (16-5 t/m 24-5) Fig. 16 :Biomassa concentratie Batch Figuur 16 laat zien dat de biomassatoename overeenkomt met de algenconcentratie, als gevolg van meer algen neemt de biomassa logischer wijs toe. De crash fase van de algen is ook goed terug te zien in de afname van biomassa aan algen. De biomassa aan algen is op het afvalwater maximaal de helft van de maximale biomassa die behaald is op het Walne-medium. Ook al is de algenconcentratie op het Walne-medium hoger, dan zou er in verhouding alsnog hogere waarden voor de biomassa aan algen op afvalwater gevonden moeten worden. Dit is bij de andere ook terug te zien. In de volgende paragraaf wordt dit verder behandeld. 17

23 Biomassa per alg Door naar de biomassa per alg te kijken kan er wat gezegd worden over de kwaliteit van de algen. Als de biomassa per alg hoog is betekend dat, dat de alg in het algemeen groter is en in beter conditie verkeerd met hogere voedingswaarden. Door de biomassa van de algen te delen door de cel concentratie kan het gewicht per alg berekend worden. In tabel 6 staat de gemiddelde biomassa per alg van de door ons drie gemeten culturen op het Walne-medium en in tabel 7 die van de gemiddelde biomassa per alg op afvalwater. In bijlage 3 staan uitgebreidere tabellen weergegeven, waaruit onderstaande tabellen zijn gemaakt. Tabel 6:Gemiddelde biomassa per alg op het Walne-medium Kweek Walne Gemiddelde biomassa per alg (pg) Gemiddelde (pg) 20-3 t/m ,53 79, t/m , t/m ,30 Tabel 7: Gemiddelde biomassa per alg op het afvalwater Kweek afvalwater Gemiddelde biomassa per alg (pg) Gemiddelde (pg) 28-3 t/m ,89 58, t/m , t/m ,97 Zoals in de tabellen hierboven te zien is, is de gemiddelde biomassa van de algen op het Walne-medium hoger, gemiddeld gezien 36%. Dit houd in dat in theorie de voedingswaarden en de kwaliteit van de alg op het Walne-medium hoger ligt. 18

24 4.1.2 Nutriënten opname door Chaetoceros muelleri De grafieken van de opname van N, P en Si zullen in dit hoofdstuk behandeld worden. Wederom zijn de overige grafieken weergegeven in bijlage Opname N door Chaetoceros muelleri Concentratie N Concentratie N (mg/l) 18,00 16,00 14,00 12,00 10,00 8,00 6,00 4,00 2,00 0, Walne (18-3 t/m 4-4) Afvalwater (28-3 t/m 8-4) Fig. 17: Concentratie N Batch Figuur 17 laat de concentratie N zien gedurende de groei van de algencultuur. De afname van de concentratie N is te wijten aan de opname/groei van de algen. De vorm van de grafieken lopen omgekeerd evenredig met die van de algenconcentratie, wat het verband goed zichtbaar maakt. Bij het afvalwater ligt de beginconcentratie N hoger, namelijk 15,82 mg/l van het afvalwater tegenover 11,60 mg/l van het Walne-medium. Bij beide culturen wordt ongeveer dezelfde opname van ongeveer 11,5 mg/l gezien. Bij het Walne-medium constateert dat erin dat N ongeveer volledig opgenomen is en dus limiterend en verdere groei van de cultuur zal remmen. Een aantal nitraat bepalingen zijn mis gelopen, vandaar dat er slechts van één cultuur op afvalwater het verloop van N is, wat het dus niet mogelijk maakt deze met elkaar te vergelijken. Mogelijk varieert de concentratie N van de tarbotkwekerij Seafarm en dus de begin concentratie N. 19

25 Opname P door Chaetoceros muelleri Concentratie P Concentratie P (mg/l) 4,00 3,50 3,00 2,50 2,00 1,50 1,00 0,50 0, Walne (18-3 t/m 4-4) Afvalwater '2' (16-5 t/m 24-5) Fig. 18 :Concentratie P Batch Figuur 18 laat een directe sterke afname zien van de concentratie P. Bij N (figuur 17) is eerst een kleine geleidelijke afname te zien gedurende de introductie (lag) fase. Bij de overige culturen is dit ook een aantal keren goed te zien. Mogelijk slaan de algen een overmaat aan P op als mogelijke buffer. Bij het afvalwater ligt de begin concentratie P tussen de 3,23 en 3,78 mg/l. In het Walne-medium is de beginconcentratie twee maal rond de 2,1 mg/l en is er één uitschieter van 3,67 mg/l. De uitschieter is mogelijk te wijten aan de kwaliteit van het grondwater. Opvallend is dat de P concentratie in alle gevallen snel een concentratie van 0,10 mg/l aanneemt en vervolgens stabiel blijft en niet richting de 0 gaat. Bij die lage concentratie van P rond de 0,10 mg/l gaat de groei nog enkele dagen door, wat een aanwijzing is dat fosfaat intracellulair wordt opgenomen. 20

26 Opname Si door Chaetoceros muelleri Concentratie Si (mg/l) Concentratie Si 16,00 14,00 12,00 10,00 8,00 6,00 4,00 2,00 0, Walne (18-3 t/m 4-4) Afvalwater '2' (16-5 t/m 24-5) Fig. 19 : Concentratie Si Batch Het verloop van de concentratie Si te zien in figuur 19 lijkt sterk op die van P te zien in figuur 18. De beginconcentratie Si bij de cultuur op Walne-medium varieert van 9,35 tot 15,43 mg/l. Deze variatie is wederom mogelijk te wijten aan de kwaliteit van het zoute grondwater. De begin concentratie van het afvalwater ligt rond de 13 mg/l. Bij het instorten van de culturen op het Walne-medium is er in alle gevallen nog voldoende Si over voor de groei. De laagst gemeten waarde is 0,48 mg/l op het Walnemedium. Bij het afvalwater komt deze waarde een stuk lager uit en eindigt deze rond de 0,10 mg/l. Om het verband tussen de concentratie van de nutriënten en dus de opname door de algen weer te geven met de concentratie algen is hieronder in figuur 20 een voorbeeld waarbij de biomassa en de concentratie Si is samengevoegd om het verband duidelijk weer te geven. Concentratie Si (mg/l) 14,00 12,00 10,00 8,00 6,00 4,00 2,00 0,00 Biomassa concentratie/ concentratie Si ,3 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 Biomassa concentratie (g/l) Concentratie Si afvalwater '1' (16-5 t/m 24-5) Biomassa concentratie Afvalwater (16-5 t/m 24-5) Fig. 20: Biomassa concentratie/concentratie Si 21

27 4.2 Continu cultuur Er is ook gebruik gemaakt van een continu cultuur, de manier waarop het kweken en oogsten van de algen in grote schaal toegepast zal moeten worden. Later in dit hoofdstuk zal een voorbeeld berekening gemaakt worden naar de oogst in het geval van opschaling. Dezelfde metingen en nutriënten bepalingen zijn verricht als bij de Batch-cultuur en zullen worden besproken Algengroei en productiviteit continu cultuur Naar de biomassa en de concentratie algen wordt hier gekeken. Met behulp van de biomassa en algenconcentratie kan berekend worden hoeveel algen en hoeveel aan biomassa geoogst wordt per dag, doordat het volume van de oogst bekend is. Ook wordt er een voorbeeld gegeven in het geval van opschaling in de praktijk Algengroei (aantal algencellen/ml *10 6 ) 3,5 Algenconcentratie Algenconcentratie 3 2,5 2 1,5 1 0,5 Continu (31-5 t/m 15-6) Fig. 21: Algenconcentratie Continu Van dag 1 tot dag 5 is er in figuur 21 een sterke groei te zien en verkeert de cultuur in de exponentiele fase, de fase waarin de groei van de alg het sterkst is. Na zes dagen is de cultuur op continu gezet, dat houdt in dat er elke dag 20% wordt ververst. Hetgene dat geloosd wordt is de oogst aan algen. Aangezien de bellenkolom(cilinder) gevuld is met 20 liter betekent dit een oogst van 4 liter per dag. Door eerder onderzoek van de batch culturen is bekend dat bij een concentratie van 3*10 6 alg/ml hij nog in de exponentiele fase zit. Vanaf dag 6 t/m dag 10 schommelt de groei tussen de 2,4 en 3 miljoen algen/ml. Vanaf dag 10 tot dag 14 is er niet gemeten in verband met Pinksteren. In dit lange weekend is het mis gelopen. De doseerpomp had enkel vers afvalwater toegevoegd maar niet uit de cultuur geoogst, wat tot een overstroming geleid heeft. De overstroming van de bellenkolom heeft hoogstwaarschijnlijk voor besmetting gezorgd die in de cultuur is aangetroffen, waardoor de cultuur achteruit ging en stop is gezet op dag 15. De algenconcentratie blijft gedurende het eerste deel van het continu draaien redelijk stabiel. De algencultuur wordt dagelijks voor 20% verdund, die 20% wordt er dagelijks aangegroeid door de cultuur aangezien de cel concentratie redelijk gelijk blijft. 22

28 Biomassaconcentratie Biomassaconcentratie (g/l) 0,2 0,18 0,16 0,14 0,12 0,1 0,08 0,06 0,04 0, Fig. 22: Biomassa concentratie Continu Continu (31-5 t/m 15-6) Zoals te verwachten loopt figuur 22 evenredig met figuur 21 van de algenconcentratie. Ook hier is te zien dat de cultuur instort na dag Productiviteit continu cultuur Elke dag wordt er 20% geoogst (4 liter), dat gebruikt kan worden als voer voor schelpdieren. Over de eerste vijf dagen wordt er met de volgende biomassa aan algen per liter geoogst; Tabel 8: Gegevens algenconcentratie/biomassaconcentratie Continu Datum Dag Aantal algencellen/ml *10 6 Biomassaconcentratie (g/l) Biomassaconcentratie (g/l) gem 6-jun 6 2,82 0,19 7-jun 7 2,98 0,17 8-jun 8 2,62 0, jun 9 2,42 0,17 10-jun 10 2,58 0,1525 0,172 Er wordt gemiddeld 0,172 g/l alg geoogst per dag wat neerkomt op een productie van 4 x 0,172 = 0,688 gram per dag. Volumetrische productiviteit De volumetrische productiviteit (g l -1 dag -1 ) wordt bepaald door de verversingssnelheid (dag -1 ) met de biomassa (g l -1 ) te vermenigvuldigen. De verversingssnelheid staat gelijk aan de oogst, die 0,2 (20%) bedraagt. De volumetrische productiviteit bedraagt dus 0,172 x 0,2 = 0,0344 (g l -1 dag -1 ) Voorbeeld voor opschaling tarbotkwekerij Seafarm De kwekerij heeft een debiet van 10m³/uur, wat neerkomt op 240m³/per dag. Elke dag wordt er 20% geoogst en heeft het water dus een verblijftijd van 5 dagen. Om het water tijdelijk op te kunnen vangen moet het kweeksysteem een volume hebben van 1200m³ (5 x 240). 23

29 Elke dag wordt er 240m³ geoogst, waarbij er gemiddeld 0,172 g/l alg geoogst wordt. Per dag is er dan een productie van 240x1000x0,172= gram/per dag, dat is 41,28 kg/dag. De totale productie aan alg per jaar zou dan 365 x 41,28 =15067,2 kg. Met deze productie kan een grote hoeveelheid schelpdieren gevoed worden. Het kweeksysteem zou in het geval van Seafarm een enorme omvang moeten zijn om de hoeveelheid water aan te kunnen, wat mogelijk niet reëel is. Er zou slechts een deel van het water gebruikt kunnen worden voor de kweek van algen en het zuiveren van het afvalwater. Het zuiveringsrendement van het kweken op algen zal in het volgende hoofdstuk gegeven worden Nutriënten opname door Chaetoceros muelleri In de eerste dagen zijn er geen nutriënten toegevoegd aan de cultuur en kan de opname door de algen gezien worden. Door naar de nutriënten concentratie op het begin, die hetzelfde is als de input en naar de concentratie te kijken van de output (oogst) kan het zuiveringsrendement berekend worden 25 Concentratie N Concentratie N (mg/l) Continu (31-5 t/m 15-6) Fig. 23: Concentratie N Continu Op het begin neemt de concentratie N logischer wijs af (figuur 23) en loopt omgekeerd evenredig met figuur 21 van de algenconcentratie. Nadat de cultuur continu gaat draaien en er dus nieuwe nutriënten bijkomen neemt de concentratie N lichtjes toe. Na het mislopen vanaf dag 10 is de groei van de algen ingestort en de opname dus afgenomen, waardoor de concentratie verhoogd is. Het zuiveringsrendement bedraagt,, x100%= 75%. Mocht de cultuur op een later moment met een. hoger concentratie aan algen op continu cultuur gezet worden zou het zuiveringsrendement hoger uitkomen. 24

30 2,5 Concentratie P Concentratie P (mg/l) 2 1,5 1 0,5 Continu (31-5 t/m 15-6) Fig. 24: Concentratie P Continu Figuur 24 van concentratie P geeft het zelfde verloop weer als figuur 23 van de concentratie N. Ook hier gelden de zelfde verklaringen voor. Het zuiveringsrendement van P bedraagt,, x 100% = 88%, 12 Concentratie Si Concentratie Si (mg/l) Continu (31-5 t/m 15-6) Fig. 25: Concentratie Si Continu In figuur 25 is een afname van silicium te zien tijdens het deel dat hij als batch cultuur draait. Zodra hij continu gaat draaien neemt de concentratie Si toe. Mogelijke verklaring ervoor dat de concentratie toeneemt en niet redelijk gelijk blijft is dat de algen een buffer aan silicaat opgeslagen hebben en die vervolgens eerst verbruiken. Het is geen probleem dat silicium toeneemt, want silicium is geen eutrofierend element en hoeft dus niet gezuiverd worden. Er is in elk geval genoeg silicium aanwezig in het afvalwater en zal de groei van de algen dus niet remmen. 25

31 4.3 Verhoudingen N:P:Si In dit hoofdstuk word gekeken naar de opname verhoudingen van N:P:Si door Chaetoceros muelleri. Ook wordt er gekeken naar verhoudingen in het afvalwater en het Walne-medium. Met behulp van deze gegevens kan bij voorhand al bepaald worden welke van de nutriënten zal limiteren doordat de opname ratio bekend is. Ook is er gekeken welk deel van de biomassa van de alg uit de elementen N:P:Si bestaat Verhoudingen N:P:Si in Walne-medium Er is van culturen, de molaire ratio van de elementen N, P en Si van het Walne-medium op het begin en van de ratio waarin de elementen zijn opgenomen. Er zijn grote verschillen in de waarden van de opname ratio te zien. De volledige tabellen zijn in bijlage 5 terug te vinden. Tabel 9: Ratio Walne kweek (18-3 t/m 24-3). Ratio (begin) Ratio (opgenomen) N:P 12,644 4,765 Si:P 5,105 3,072 N:Si 2,477 1,551 Tabel 10: Ratio Walne kweek (18-3 t/m 4-4). Ratio (begin) Ratio (opgenomen) N:P 11,710 12,452 Si:P 6,003 6,242 N:Si 1,951 1,995 Tabel 11: Ratio Walne kweek (19-4 t/m 29-4). Ratio (begin) Ratio (opgenomen) N:P / / Si:P 4,637 3,410 N:Si / / Te zien is dat de begin ratio van N:P:Si redelijk overeenkomt. De ratio s van de elementen liggen binnen de hieronder aangegeven grens; Tabel 12: Ratio grens Walne kweken N:P ratio Si:P ratio N:Si ratio 11,71-12,64 4,637-6,003 1,951-2,447 De opname ratio geeft grote verschillen, met name betreft de N:P ratio. De Ratio gevonden bij de kweek van 18-3 t/m 24-3 geeft een erg lage N:P ratio, maar de Si:P en de N:Si ratio komen goed overeen wat het niet aannemelijk maakt dat er een meetfout gemaakt is. De ratio's van de opnamen van de elementen liggen binnen de hieronder aangegeven grens; 26

32 Tabel 13: Ratio grens Walne kweken N:P ratio Si:P ratio N:Si ratio 4,765-12,452 3,071-6,242 1,551-1, Verhoudingen N:P:Si in het afvalwater de molaire ratio van de elementen N, P en Si in het afvalwater kwamen overeen, zo ook de ratio van de opname vandaar dat in tabel 16 het gemiddelde staat weergegeven. Helaas is er slechts van één cultuur een goede N waarde gemeten. Tabel 14: Ratio afvalwater kweek (28-3 t/m 8-4). Ratio (begin) Ratio (opgenomen) N:P 10,831 8,263 Si:P 3,872 4,110 N:Si 2,797 2,011 Tabel 15: Ratio afvalwater kweek 1 (16-5 t/m 24-5). Ratio (begin) Ratio (opgenomen) N:P / / Si:P 4,253 4,318 N:Si / / Tabel 16: Ratio afvalwater kweek 2 (16-5 t/m 24-5). Ratio (begin) Ratio (opgenomen) N:P / Si:P 3,915 3,946 N:Si / Tabel 17: Gemiddelde Ratio afvalwaterkweken. Ratio (begin) Ratio (opgenomen) N:P 10,831 8,263 Si:P 4,013 4,125 N:Si 2,797 2,011 De begin ratio van het afvalwater ligt binnen de volgende grens: Tabel 18: Begin Ratiogrens afvalwaterkweken N:P ratio Si:P ratio N:Si ratio 10,831 3,872 4,253 2,797 27

33 De opname ratio kwam ook overeen en ligt binnen de volgende range: Tabel 19: Opname Ratio afvalwaterkweken N:P ratio Si:P ratio N:Si ratio 8,263 3,946 4,318 2,011 zoals te zien is komen de begin ratio's van Walne-medium en afvalwater goed overeen. Ook komen de ratio's in de opnamen overeen, ook al is er een twijfelachtige N:P ratio op Walen-medium gevonden, valt de N:P ratio van het afvalwater toch binnen deze ratio Limitering Door het weten van de ratio van de elementen N:P:Si in het afvalwater of op het Walne-medium kan bepaald worden welke van de elementen limiterend is. Hieronder zal berekend worden welke van de elementen limiterend is bij de kweek op afvalwater. Er wordt ook berekend hoeveel de maximale productie zou kunnen zijn afhankelijk van het limiterende element. Dit betreft een Batch cultuur. Gemiddelde ratio afvalwater Tabel 20: Gemiddelde Ratio afvalwaterkweken. Ratio (begin) Ratio (opgenomen) N:P 10,831 8,263 Si:P 4,013 4,125 N:Si 2,797 2,011 Te zien is dat in bovenstaande tabel de ratio van de elementen op het begin anders zijn dan de ratio van de opname. Is de ratio van de opname lager geworden lager dan de begin ratio, dan is het element waardoor gedeeld wordt in overvloed. Is de ratio hoger geworden, dan is het delende element in overvloed. In het geval van de gemiddelde ratio van het afvalwater word de N:P ratio lager en zorgt P dus voor de limitering, want als er relatief meer P wordt opgenomen dan N, wordt de N:P ratio lager. Dan is er dus meer N over, dus P limiteert. Als er gekeken wordt naar de Si:P ratio laat deze zien dat Si voor de limitatie zorgt. Si is dus limiterend voor de groei. Nu is bekend welk element limiterend is. Er is berekend hoeveel milligram per element nodig is om 1 milligram algen te verkrijgen. Ook is de massa die het element in de alg bevat in percentage weergegeven. De gemiddelde waardes staan hieronder weergegeven, de overige staan vermeld in bijlage 5 Gemiddelde massa per element in afvalwater Tabel 21:Gemiddelde massa per element in (mg) en (%) van afvalwater Nutrient Ratio Walne kweek (18-3 t/m massa 24-3) per element (mg) massa per element (%) P 0,019 1,923 Si 0,072 7,168 N 0,081 8,065 In tabel 20 is te zien dat voor 1 mg aan algen er 0,072 mg N nodig is. De begin concentratie van N bedraagt 11,34mg/l (bijlage 3). Met de aanwezige 11,34mg/l kan er dus maximaal, = 157,5 mg/l aan, 28

34 alg gehaald worden. Voor één batch cultuur van 20l zou er dan maximaal 3,15 gram aan alg geproduceerd worden. De gemiddelde massa per element in het Walne-medium: Tabel 22:Gemiddelde massa per element in (mg) en (%) van Walne Nutrient massa per element (mg) massa per element (%) P 0,009 0,873 Si 0,032 3,189 N 0,029 2,870 29

35 5. Conclusie De resultaten en de grafieken laten zien dat de groei en de opname van de nutriënten van de culturen op afvalwater overeenkomen met die van de culturen op het Walne-medium. Op het Walne-medium wordt een concentratie van 6,78*10 6 algen/l en op afvalwater 5,66*10 6 algen/l behaald. Bij de continu cultuur wordt gemiddeld 0,172 g/l alg geoogst per dag wat neerkomt op een productie van 4 x 0,172 = 0,688 gram per dag. De volumetrische productiviteit van de continu cultuur bedraagt 0,0344 g l -1 dag -1 Wanneer de continu cultuur draait schommelt de algenconcentratie tussen de 2,4 en 3*10 6 cellen/ml. Tijdens het continu draaien blijven de concentratie van N en P stabiel. De Si concentratie neemt vreemd genoeg gestaagd toe. Het afvalwater is geschikt voor het kweken van algen en geschikt voor opschaling. In het geval van Sea farm zou er in theorie een productie van 15067,2 kg aan alg gehaald kunnen worden, het kweeksysteem zou dan een volume van 1200m³ moeten hebben. Het zuiveringsrendement door de algen bedraagt voor N 75% en P 88%. De begin ratio van de elementen N:P:Si bij het Walne medium ligt in de volgende range; N:P ratio Si:P ratio N:Si ratio 11,71-12,66 4,637-6,003 1,951-2,447 De opname ratio van de elementen N:P:Si bij het Walne medium is als volgt: N:P ratio Si:P ratio N:Si ratio 4,765-12,452 3,071-6,242 1,551-1,995 De begin ratio van de elementen N:P:Si in het afvalwater is als volgt: N:P ratio Si:P ratio N:Si ratio 10,831 3,872 4,253 2,797 De opname ratio van de elementen N:P:Si in het afvalwater is als volgt: N:P ratio Si:P ratio N:Si ratio 8,263 3,946 4,318 2,011 In het onderzoek is naar voren gekomen dat het afvalwater een prima vervanger is voor het huidig gebruiktewalne-medium. Er is een evenredige groei en opname van de nutriënten te zien. Met de proeven van het continu systeem is getest of het op grote schaal toegepast zou kunnen moeten worden. De proef heeft laten zien dat opschaling mogelijk is en er een continue productie van algen kan plaatsvinden. 30