Nieuwe inzichten in het pathogeen belang, de diagnose en de behandeling van pensbot-infecties bij rundvee

Transcriptie

1 UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT DIERGENEESKUNDE Academiejaar Nieuwe inzichten in het pathogeen belang, de diagnose en de behandeling van pensbot-infecties bij rundvee door Karen MALRAIT Promotoren: Dr. Johannes Charlier Prof. Dr. Jozef Vercruysse Onderzoek in het kader van de Masterproef 2014 Karen Malrait

2

3 Universiteit Gent, haar werknemers of studenten bieden geen enkele garantie met betrekking tot de juistheid of volledigheid van de gegevens vervat in deze masterproef, noch dat de inhoud van deze masterproef geen inbreuk uitmaakt op of aanleiding kan geven tot inbreuken op de rechten van derden. Universiteit Gent, haar werknemers of studenten aanvaarden geen aansprakelijkheid of verantwoordelijkheid voor enig gebruik dat door iemand anders wordt gemaakt van de inhoud van de masterproef, noch voor enig vertrouwen dat wordt gesteld in een advies of informatie vervat in de masterproef.

4 UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT DIERGENEESKUNDE Academiejaar Nieuwe inzichten in het pathogeen belang, de diagnose en de behandeling van pensbot-infecties bij rundvee door Karen MALRAIT Promotoren: Dr. Johannes Charlier Prof. Dr. Jozef Vercruysse Onderzoek in het kader van de Masterproef 2014 Karen Malrait

5 VOORWOORD Op de eerste plaats wens ik mijn promotor Johannes Charlier, postdoctoraal medewerker aan de vakgroep virologie, parasitologie en immunologie, hartelijk te danken voor de begeleiding van deze masterproef gedurende de voorbije maanden. Niet alleen bood hij mij hulp bij de inhoudelijke zaken van deze thesis, maar nam ook, waar nodig, bepaalde praktische analyses op zich gedurende de drukke examenperiode. Hij begeleidde mij ook tijdens de staalnames in het slachthuis en bij de behandelingsproeven. Ook Nathalie De Wilde, assistente in het labo van de vakgroep parasitologie, dank ik voor haar medewerking. Zij hielp mij ook met de staalnames in het slachthuis te Brugge en met de bedrijfsbezoeken voor de behandelingsproeven en stond mij steeds met raad en daad bij tijdens de microscopische analyses in het laboratorium. Ik wens hierbij ook nog uitdrukkelijk enkele medewerkers van de vakgroep parasitologie te bedanken, die steeds klaar stonden met een woordje uitleg of om mij te helpen bij het microscopiewerk dat noodzakelijk was voor mijn onderzoek: Sien Verschave, Stijn Casaert, Fiona Vande Velde, Johnny Vlaminck, Karen Soenen en Ellen De Meyere. Ook de dierenartsen die bereid waren tot medewerking en meststalen hebben opgestuurd voor het pensbotproject ben ik erg dankbaar, evenals diergeneeskundestudent Tom Slegh die tevens stalen doorstuurde. Ik wil ook graag Jo Maris en Hans Van Loo van Dierengezondheidszorg (Veepeiler Rund) hartelijk danken voor hun medewerking die zij verleend hebben aan dit project. DGZ zelf wil ik danken voor het mogelijk maken van de case-control studie door het opmaken van de staalnamedozen en voor de logistieke ondersteuning bij het versturen ervan. Elanco Animal Health dank ik voor hun medewerking bij de behandelingsproef. Het personeel van het runderslachthuis in Brugge was steeds erg vriendelijk en we konden er probleemloos terecht voor meerdere staalnames, waarvoor ook mijn gemeende dank. Ten slotte dank ik mijn ouders en broer, mijn vriend Kevin en al mijn vrienden en familie voor de ongelooflijke steun die zij mij gedurende de voorbije jaren gegeven hebben. Mijn aandacht gaat hierbij in het bijzonder uit naar Elke Depreester, dierenarts en tevens één van de personen op wie ik altijd kan rekenen bij een al dan niet diergeneeskundige vraag. Zij hielp mij ook met de statistische analyses die onmisbaar waren voor deze masterproef. Ilse, Ann en Laure dank ik uitdrukkelijk voor de smsjes en steun tijdens de examens. Ik wil ook graag Birthe Neefs en Annelien Leyman bedanken voor het nalezen van mijn masterproef op typfoutjes en voor de terechte opmerkingen.

6 INHOUDSOPGAVE VOORWOORD..... INHOUDSOPGAVE. Samenvatting... 1 I. Literatuurstudie... 2 Inleiding Morfologie Soorten en verspreiding Levenscyclus en epidemiologie Soorten tussengastheren Pathogeen belang Immature stadia Adulte stadia Immuniteit Diagnose Mestonderzoek Immature stadia Adulte stadia Serologie Moleculaire technieken Controle Behandeling Preventie Chemoprofylaxie Weidebeheer en slakkencontrole II. Eigen onderzoek Introductie Objectieven Materialen en methodes... 20

7 3.1 Verband tussen het aantal uitgescheiden eieren en de infectiegraad met adulte pensbotten Slachthuisbezoek Mestconsistentie Mestonderzoek aan de hand van mini-flotac Data-analyse Rol van pensbot-infecties bij najaarsdiarree aan de hand van een case-control studie Studie-opzet Mestonderzoek aan de hand van mini-flotac Data-analyse Evaluatie van closantel bij de behandeling van infecties met adulte pensbotten Studie-opzet Behandeling Data-analyse Resultaten Verband tussen het aantal uitgescheiden eieren en de infectiegraad met adulte pensbotten Slachthuisbezoek en mestonderzoek Mestconsistentie Rol van pensbot-infecties bij najaarsdiarree aan de hand van een case-control studie Aantal bedrijven en locatie Verband tussen mestonderzoek en voorkomen van najaarsdiarree Verband tussen periode staalname en leeftijd op de aanwezigheid van pensboteieren Evaluatie van closantel bij de behandeling van infecties met adulte pensbotten Bespreking Referentielijst Bijlagen Bijlage 1: Montage van de mini-flotac Bijlage 2: Nieuwsbrief DGZ Bijlage 3: Invulfiche... 46

8 Samenvatting Paramphistomen of pensbotten worden aanzien als een emerging disease bij runderen in Europa. Er zijn vaker rapporteringen over de aanwezigheid van pensboteieren bij courant mestonderzoek en er zijn ook al klinische gevallen beschreven. De immature stadia blijken vooral klinische symptomen te veroorzaken. De adulte parasieten zouden van veel minder pathogeen belang zijn. In deze studie wordt eerst het verband beschreven tussen een bepaalde toegekende pensscore in het slachthuis (volgens een schatting van het aantal aanwezige pensbotten) en het aantal pensboteieren per gram faeces, welke achteraf bepaald werd in het laboratorium. De sensitiviteit en specificiteit voor deze test waren 94% respectievelijk 98%. Bijna 1 dier op 3 in het slachthuis bleek besmet te zijn. Er werd ook een lineair verband aangetoond tussen de pensscore en de mestconsistentie: hoe hoger de pensscore, hoe slechter de consistentie (dus hoe meer pensbotten aanwezig, hoe vaker plattere mest). Voor de rol van pensbot-infecties bij het voorkomen van najaarsdiarree kon echter geen significant verband aangetoond worden tussen zowel de aanwezigheid van pensbot, leverbot, strongyliden en tenslotte Eimeria en het klinisch symptoom diarree. De stalen werden genomen tussen september 2013 en januari 2014 en kwamen van bedrijven gelegen in Vlaanderen en Nederland. In januari werden procentueel gezien de meeste bedrijven positief bevonden op paramphistomen. Er is geen significant verband gevonden tussen de leeftijd van de dieren en de infectiegraad met pensbotten. Bij de behandelingsproef werd closantel, dat subcutaan werd toegediend aan een hoge dosis (10 mg/kg lichaamsgewicht) niet effectief bevonden voor de behandeling van dieren geïnfecteerd met volwassen pensbotten. Sleutelwoorden: Paramphistomose, paramphistomen, pensbot, trematoden, mini-flotac 1

9 I. Literatuurstudie Inleiding Paramphistomen of pensbotten zijn trematoden die zich in het rumen bevinden bij herkauwers. Ze hebben een wereldwijde distributie en er bestaan veel verschillende soorten. Deze parasieten maken gebruik van een tussengastheerslak om hun levenscyclus te vervolledigen. Vandaar dat hun epidemiologie sterk gelijkend is met die van leverbot. In tropische streken veroorzaken pensbotten klinische verschijnselen en kunnen zelfs leiden tot sterfte. Er is echter weinig geweten over de exacte prevalentie en het pathogeen belang van deze relatief onbekende parasiet in Europa. Infecties met pensbotten bij herkauwers blijken nochtans in opmars te zijn in West-Europa. Volgens Mage en Dorchies is in Frankrijk de aanwezigheid van eieren van paramphistomen in de mest sinds 1998 een frequente bevinding. Echte prevalentiecijfers zijn echter schaars, maar de detectie van paramphistomosis in Frans rundvee is de laatste 20 jaar wel verhoogd. Ook de incidentie van geïnfecteerde slakken is logischerwijs gestegen tussen 1990 en 2000 (Mage et al., 2002). Ook volgens Chauvin (2012) is de infestatie van pensbotten in Frankrijk in stijgende lijn. Vroeger werden zelden Paramphistomum spp. gezien bij Brits rundvee. Vanaf 2007 werden occasioneel geïnfecteerde dieren gevonden (Foster et al., 2008). Ook in Ierland worden de eieren tot 5 keer vaker teruggevonden dan voorheen na routine parasitaire mestonderzoeken (Murphy et al., 2008), vandaar dat er in 2008 een nieuwsbrief verspreid werd die de aandacht vestigde op het mogelijk toenemend belang en de aanwezigheid van deze parasiet in Brits en Iers rundvee (Foster et al., 2008, Murphy et al., 2008). Bij een studie uit het noorden van Portugal en het noordwesten van Spanje bleek 12% van de onderzochte dieren geïnfecteerd te zijn met Calicophoron daubneyi (Arias et al., 2011). Deze trend zet zich blijkbaar ook in België verder: meststalen worden vaker positief getest op de aanwezigheid van eieren van paramphistomen (D.G.Z. Vlaanderen en Laboratorium voor Parasitologie Faculteit Diergeneeskunde, ongepubliceerde gegevens). Op verschillende bedrijven die onderzocht werden voor mogelijke leverbotproblematiek worden prevalenties vastgesteld van pensbot tussen 60 en 100%. Waarom de prevalentie stijgt in Europa is nog niet exact geweten. Het veranderende klimaat kan een invloed uitoefenen. Volgens Van Dijk et al. (2010) kunnen hogere temperaturen een significant effect uitoefenen op zowel de ontwikkeling van de tussengastheerslakken als op de snelheid van de ontwikkelende stadia van pensbotten in de slak. Hogere temperaturen leiden tot een hogere graad van uitscheiding van infectieve stadia uit de slak (Poulin, 2006). Een bijkomend probleem vormt zich door het feit dat er slechts weinig producten beschikbaar zijn die een werking hebben tegen pensbotten (Alzieu en Dorchies, 2007). Er wordt ook geopperd dat door de betere controle op leverbot, deze parasiet minder gaat concurreren met pensbot en deze laatste zich aldus makkelijker kan handhaven (Alzieu en Dorchies, 2007). In het eerste deel van deze masterproef wordt de systematiek van deze parasiet besproken, evenals de morfologie, de epidemiologie, het pathogeen belang en de mogelijke controle van pensbot- 2

10 infecties. Indien specifieke informatie voorhanden is, zal vooral gefocust worden op Europese gegevens. Het tweede deel van deze thesis bestaat uit een eigen onderzoek, waarbij zal gefocust worden op het pathogeen belang, de diagnose en de behandeling van pensbot-infecties, om beter inzicht te verwerven in deze onderschatte parasiet. 3

11 1. Morfologie Onder de pensbotten zijn verschillende genera van diergeneeskundig belang, nl. de Paramphistomum, Cotylophoron (Hendrix en Robinson, 2006) en Calicophoron species (Bowman, 1995). Deze trematoden behoren tot de zogenaamde amphistomen (amphi = dubbel, stome = mond), die zowel een orale als een ventrale zuignap bevatten (Hendrix en Robinson, 2006). De orale zuignap bevindt zich aan het voorste einde en wordt gebruikt als voedingsorganel (dit vormt als het ware de mond). Hiermee zit de trematode vast in de pens of netmaag. De ventrale zuignap, die sterker ontwikkeld is, zit aan het achterste einde en is blootgesteld aan de inhoud van de maag (Hendrix en Robinson, 2006). De trematoden van de Paramphistomidae familie zijn dik en circulair op doorsnede en de cuticula is meestal zacht (Soulsby, 1965). Ze hebben een conische en licht gewelfde vorm met een witachtige inhoud waar vitelliene klieren omheen liggen (Losson et al., 1998) (zie fig.1). De intestinale caeca zijn enkelvoudig, de testes zijn gelobd en bevinden zich meestal voor de ovaria. Ventrale zuignap Orale zuignap Fig. 1 : Ventraal aanzicht van Cotylophoron cotylophoron (uit Soulsby, 1982) In verse staat zijn de paramphistomen licht tot helder rood gekleurd en peervormig (zie fig. 2). Ze hebben een afmeting van 5 tot 13 mm op 2 tot 5 mm (Hendrix en Robinson, 2006) en lijken wat op vliegenmaden (Chandler, 1949). A B Fig. 2 : Macroscopisch uitzicht van pensbot, aangetroffen bij het openen van de pens van een geslacht dier A: helderrood, B: lichtrood (eigen foto) De prepatente periode voor de meeste Paramphistomum species is 80 tot 95 dagen (Hendrix en Robinson, 2006). 4

12 2. Soorten en verspreiding Er zijn veel Paramphistomum spp. wereldwijd aanwezig. In het bijzonder in Afrika zijn er veel verschillende soorten beschreven (Kaufmann, 1996). De Europese soorten worden beschreven in tabel 1. De precieze identificatie van de parasieten is echter moeilijk en complex (Soulsby, 1965). Sommige soorten blijken zeer pathogeen te zijn, terwijl andere daarentegen als apathogeen beschouwd worden (Janssens et al., 1989). Er wordt in veel ziekterapporteringen geen vermelding gemaakt van de specifieke Paramphistomum species, wat ertoe leidt dat deze ziekte vaak verkeerd beoordeeld wordt (Mage et al., 2002). Volgens Janssens et al. (1989) zijn de Paramphistomumpopulaties in onze streken niet erg pathogeen. Cotylophoron cotylophorum is op grote schaal beschreven bij herkauwers. Deze species lijkt op P. cervi (Soulsby, 1965). Sommige auteurs (onder meer Dawes, 1946 in Soulsby, 1965) vinden de karakteristieken om deze species van elkaar te onderscheiden insufficiënt en beschouwen ze dan ook als synoniemen. In Frankrijk komen verschillende Paramphistomum species frequent voor. Zowel P. cervi, P. daubneyi, P. ichikawai of P. microbothrium werden gerapporteerd (Mage et al., 2002). Ook in Duitsland zou P. microbothrium voorkomen (Soulsby, 1982). P. daubneyi zou de meest voorkomende soort zijn in West-Europa (Mage et al., 2002), maar recentere studies in Groot-Brittannië (Gordon et al., 2013) en Spanje (González-Warleta et al., 2013) tonen enkel Calicophoron daubneyi aan. P. daubneyi en C. daubneyi zouden echter synoniemen zijn (GBIF, 2013). Vanaf hier zal dan ook alleen nog maar gesproken worden van C. daubneyi. P. leydeni en P. scotiae zijn ook synoniemen (GBIF, 2013). Volgens Losson et al. (1998) komt in Frankrijk C. daubneyi vooral bij runderen voor, terwijl P. cervi en P. ichikawai vooral bij schapen aanwezig zijn. Tabel 1 : Overzicht Europese Paramphistomum species met verspreiding en referentie Species Paramphistomum cervi Calicophoron daubneyi (= Paramphistomum daubneyi) Geografische verspreiding Frankrijk Spanje Rusland Bulgarije Polen Italië Frankrijk Groot Brittannië Referentie Mage et al., 2002 Ferreras et al., 2014 Horak, 1971 in Anuracpreeda et al., 2008 Horak, 1971 in Anuracpreeda et al., 2008 Horak, 1971 in Anuracpreeda et al., 2008 Horak, 1971 in Anuracpreeda et al., 2008 Mage et al., 2002 en Abrous et al., 1999 Gordon et al.,

13 Schotland Spanje Italië Gordon et al., 2013 González-Warleta et al., 2013 en Arias et al., 2013 en Sanchís et al., 2013 en Ferreras et al., 2014 Rinaldi et al., 2005 Paramphistomum ichikawai Frankrijk Mage et al., 2002 Paramphistomum microbothrium Frankrijk Sardinië Ex-Joegoslavië Hongarije Mage et al., 2002 Horak, 1971 in Anuracpreeda et al., 2008 Horak, 1971 in Anuracpreeda et al., 2008 Horak, 1971 in Anuracpreeda et al., 2008 Cotylophoron cotylophoron Europa Soulsby, 1965 Paramphistomum hibernae Schotland, Ierland Soulsby, 1965 Paramphistomum leydeni (= P. scotiae) Schotland, Ierland Soulsby, Levenscyclus en epidemiologie Bij de ontwikkeling van pensbot is er sprake van een indirecte levenscyclus, waarbij zoetwaterslakken de tussengastheer vormen (Kaufmann, 1996). De cyclus is gelijkaardig in elk species (Soulsby, 1965) en toont een grote gelijkenis met die van Fasciola hepatica (leverbot) (zie figuur 3). Eieren worden uitgescheiden in de faeces van geïnfecteerde herkauwers en dit gebeurt vanaf 12 weken na infectie (Losson et al., 1998). Naargelang de species en de omgevingsfactoren (temperatuur, vochtigheidsgraad, ) kan de ontwikkeling van de jonge stadia (miracidia) zich voltrekken binnen een termijn van 12 dagen (bv. bij een temperatuur van 27 C ontwikkelen miracidia van Ceylonocotyle streptocoelium volledig binnen deze periode), bij andere soorten kan het zelfs nog sneller gaan. Het vrijkomen van de miracidia is van dezelfde factoren afhankelijk en gebeurt ongeveer tussen 12 en 17 dagen (P. ichikawai respectievelijk Ceylonocotyle streptocoelium, deze laatste soort pensbot is voornamelijk te vinden in warmere streken zoals Australië) (Durie, 1953 in Soulsby, 1965). 6

14 Fig. 3 : Levenscyclus Paramphistomum species (uit Animal Health Ireland, 2013) Bij blootstelling aan licht komen de miracidia snel uit het ei en kunnen ze slakken infecteren. Als de slak echter geen geschikte tussengastheer is, zullen de miracidia door de slak gedood worden. De penetratie van Ceylonocotyle streptocoelium in de slak gebeurt via de pneumostoom (ademhalingsporie) en ook doorheen het achterste deel van de mantelholte (zie fig. 4). Ook kunnen zachte weefsels van de slak doorboord worden, zoals het hoofd, de tentakels en de voet. Dit werd door Bennet (1936 in Soulsby, 1965) beschreven voor Paramphistomum microbothrioides. 7

15 Fig. 4 : Anatomie zoetwaterslak (uit Bateman et al., 1987) De daarop volgende ontwikkeling in de slak is vergelijkbaar tussen alle species. Als typevoorbeeld wordt hier de levenscyclus van Ceylonocotyle streptocoelium uit Australië beschreven (Durie, 1953 in Soulsby, 1965). Bij het doorboren van de mantelholte van de slak hechten de miracidia zich vast aan het achterste eind naast de hartholte. Binnen een tijdspanne van 2 tot 3 uur verliezen zij hun ciliën. Twaalf uur later wordt er een sporocyst gevormd. Deze is langwerpig, licht contractiel en meet 93 op 53 µm. Tussen dag 5 en 8 na infectie vergroot de sporocyst enorm en bevat reeds een aantal rediae. Op dag 11 zijn de sporocysten volledig matuur en bevatten elk maximum 8 rediae. Deze rediae worden vrijgesteld vanuit de sporocyst tussen dag 10 en 11. In dit stadium meten ze 200 tot 300 op 90 tot 100 µm. Daarna verlengen de rediae enorm, dit is te wijten aan het hoge aantal cercariën dat zich erin ontwikkelt, waardoor de maximale omvang (nl. 0.5 op 1 mm lengte) na 21 dagen wordt bereikt. Ze bevatten op dat moment 15 tot 30 cercariae. In sommige gevallen worden ook dochterrediae gevormd. Dit kan te wijten zijn aan slechte omstandigheden zoals een lage temperatuur (Soulsby, 1965). Wanneer de cercariae vrijgelaten worden door de rediae bevinden ze zich in een immature vorm en zetten ze hun ontwikkeling enige tijd door in de slakkenweefsels vooraleer ze uitgescheiden worden. Bij een temperatuur van 27 C zijn er 13 dagen nodig voor dit maturatieproces (Durie, 1953 in Soulsby, 1965). De mature cercariae zijn donkerbruin tot zwart in kleur en bevatten 2 opvallende oogvlekjes (zie fig. 5). Ze meten 350 op 200 µm en hebben een staartlengte van 450 µm. De uitdrijving van cercariae gebeurt overdag. Fig. 5 : Vrijgekomen cercaria met oogvlekjes (uit Rohde en Lee, 1967) 8

16 Bij een temperatuur van 20 C zullen er 63 dagen nodig zijn vooraleer de cercariae vrijgesteld worden uit de slak. Bij een hogere temperatuur zullen er minder dagen nodig zijn. Het uitbreken van de cercariae gebeurt sporadisch, er zijn momenten van hoge uitscheiding die gevolgd worden door momenten van lage uitscheiding. Het aantal vrijgestelde cercariae is ook afhankelijk van de grootte van de slak en zijn voedingstoestand (Soulsby, 1965). Vrijgekomen cercariae zijn actief gedurende minuten tot enkele uren vooraleer ze encysteren op een voor hen geschikt oppervlak (Soulsby, 1965), meestal gebeurt dit op planten die in nauw contact staan met water (Kaufmann, 1996). Ze hechten zich hierbij vast met hun achterste zuignap. Er wordt een soort secretiemateriaal rond het lichaam afgezet en de staart komt losser te liggen tijdens deze encystering. Deze valt tenslotte af binnen de 10 minuten na het vervolledigen van de encystering. De metacercariële cyste is nu ongeveer 225 µm in diameter, donkerder in kleur en zal bij ideale omstandigheden kunnen overleven gedurende 2 à 3 maanden (Soulsby, 1965). De metacercariën vormen de infectieve stadia (Kaufmann, 1996), de eindgastheer wordt besmet door het opeten van deze metacercariae die zich op het gras bevinden. De metacercariae worden vrijgesteld in de darmen waar zij het eerste deel van hun levenscyclus vervolledigen (Soulsby, 1965). De jonge trematoden hechten zich vast aan de mucosae van de darm, voeden zich en groeien door tot zij migreren naar de pens, waar ze tenslotte volwassen worden. Volgens LeRoux (1930 in Soulsby, 1965) blijft de immature trematode gedurende 6 tot 8 weken in het duodenum en zijn er opnieuw 4 tot 8 weken nodig na migratie door de netmaag naar de pens vooraleer de eiproductie op gang komt (Losson, 1998 en Soulsby, 1965). De totale levenscyclus duurt dus ongeveer 3 à 4 maanden (Soulsby, 1965). De totale levensduur van pensbotten kan volgens Rojo-Vázquez et al. (2012) tot 4 jaar bedragen, andere bronnen spreken van een levensduur van 5 tot zelfs 7 jaar (Alzieu en Dorchies, 2007). Zowel gedomesticeerde als wilde (Kaufmann, 1996) herkauwers kunnen eindgastheer zijn (Hendrix en Robinson, 2006). In Afrika zijn ook (sabel)antilopen en buffels beschreven als eindgastheer. Zelfs paarden kunnen een mogelijk reservoir vormen (Soulsby, 1965). In figuur 6 wordt een overzicht gegeven van het uitzicht van de verschillende stadia van trematoden. 9

17 Fig. 6 : Typevoorbeelden van de verschillende stadia van trematoden (uit Rohde en Lee, 1967) 4. Soorten tussengastheren De intermediaire gastheren van Paramphistomum spp. zijn zoetwaterslakken. Zij komen zelden uit het water. Sommigen onder hen kunnen wel een periode van droogte overleven. Dieren infecteren zich door te grazen of te drinken nabij de habitats van de geïnfecteerde slakken (Soulsby, 1965). Deze habitat bestaat uit zones waar zich ondiep stilstaand water bevindt, zoals aan de oevers van een vijver of een rivier, aan de kanten van sloten, moerasgebieden en op plaatsen waar vooral boterbloemen en juncaceae (russenfamilie) de vegetatie uitmaken. Paramphistomose is aldus een aandoening die voorkomt in vochtige gebieden (Chauvin, 2012). Verschillende soorten slakken werden gerapporteerd als tussengastheer (zie tabel 2). In de meeste Europese landen is Galba truncatula (vroeger Lymnaea truncatula) een belangrijke intermediaire gastheer van C. daubneyi (Mage et al., 2002). Deze poelslak vermenigvuldigt zich voornamelijk in de lente maar kan zich ook in de herfst vermeerderen, weliswaar in mindere mate. Ze bevindt zich dan aan de kant van het water of onder een dun waterlaagje. In de winter vertraagt haar levensritme en blijft ze ondergedompeld zitten in een vochtig gebied. In de zomer, wanneer er een periode van droogte aankomt, kan de slak onder planten blijven zitten of verschuilt ze zich in de bodem. Er zijn aldus meestal twee slakkengeneraties per jaar (in de lente en in de herfst). In onze streken kunnen ook Planorbis-soorten als tussengastheer fungeren (Janssens et al., 1989) en volgens Losson et al. (1998) komen ook Bulinus species in aanmerking als tussengastheer. Bowman (1995) vermeldt ook Physa spp. en Pseudosuccinea spp. als mogelijke tussengastheer. De bovenvermelde slakkensoorten zouden allemaal in Europa voorkomen, maar in België zouden enkel 10

18 Planorbis spp. en Physa spp. voorkomen, Bulinus spp. en Pseudosuccinea spp. dus niet (Fauna Europaea, 2013). Jonge slakken zijn gevoeliger voor infectie dan oudere slakken. Bij de jongere slakken is de mantelholte namelijk volledig gevuld met water en staat de ademhalingsporie permanent open zodat er water doorheen kan circuleren via de cilia. Bij oudere slakken is de mantelholte gedeeltelijk of volledig gevuld met lucht en wordt de ademhalingsporie slechts geopend wanneer de slak lucht gaat ademen (Soulsby, 1965). Tabel 2 : Overzicht van de gerapporteerde tussengastheren van Calicophoron daubneyi met referenties Tussengastheer Galba truncatula (L. truncatula) Omphiscola glabra (L. glabra) Planorbis spp. Bulinus spp. Referentie Chauvin, 2012, Rieu et al., 2007, Abrous et al., 1999, Losson et al., 1998 Chauvin, 2012, Alzieu en Dorchies, 2007, Abrous et al., 1999 Losson et al., 1998 Losson et al., Pathogeen belang Wereldwijd werden bij herkauwers zware ziektegevallen en sterftes toegeschreven aan pensbotten. Vooral in tropische en subtropische streken is het pathogeen belang van pensbotten beschreven. Er dient een duidelijk onderscheid te worden gemaakt tussen de symptomen veroorzaakt door enerzijds de immature en anderzijds de volwassen stadia in de levenscyclus. 5.1 Immature stadia De gerapporteerde symptomen die kunnen optreden ten gevolge van de aanwezigheid van immature stadia worden vermeld in tabel 3. Deze immature stadia zijn terug te vinden in het duodenum (Kaufmann, 1996), jejunum (Chauvin, 2012) en volgens Boray (1959, in Soulsby, 1965) zelfs tot in het proximale deel van het ileum. Histologisch onderzoek toonde aan dat immature botten diep in de mucosa ingebed kunnen liggen en tot in de submucosa, bijna reikend tot in de spierlaag van het duodenum en jejunum (Cvetajeva, 1959, in Soulsby, 1965). De darmmucosa is daarbij rood gestuwd (Millar, 2012). Soms gebeurt het dat de parasieten de omliggende spierlaag doorboren en terechtkomen in de buikholte (Boray, 1959 in Soulsby, 1965). De immature stadia kunnen grote proppen intestinale darmwand opnemen en daarbij necrose veroorzaken (zie fig. 7) (Hendrix en Robinson, 2006). Er is pas sprake van ziekte wanneer er een massale infestatie is van immature wormen die in deze darmmucosae vastgehecht worden en daarbij zorgen voor destructie, irritatie en inflammatie (Kaufmann, 1996, Soulsby, 1965). De larvaire stadia kunnen een erge acute enteritis 11

19 veroorzaken, vooral in het duodenum en jejunum (Losson et al., 1998). In 2012 werd in Engeland bij enkele kalveren paramphistomose gediagnosticeerd na autopsie. De waargenomen klinische symptomen waren diarree, dehydratatie, anorexie en slechte conditie (Millar, 2012). De diarree kan waterig (Millar, 2012) of bruingroen gekleurd zijn (Alzieu en Dorchies, 2007, Boch en Supperer, 2006). Bij jonge dieren is mortaliteit mogelijk (Chauvin, 2012, Millar, 2012). Vooral de eerste twee meter van het duodenum zijn aangetast: de bloedvaten aan het peritoneale oppervlak zijn vergroot, de wand is verdikt en aan het grotendeels met bloed gevulde muceuze oppervlak zijn kleine vleesgekleurde immature botten te vinden. In acute gevallen kunnen zelfs meerdere duizenden roze jonge paramphistomen van 2 tot 3 mm terug te vinden zijn (Soulsby, 1965). Cvetajeva (1959, in Soulsby, 1965) neemt aan dat de immature paramphistomen toxische stoffen produceren die buiten het leiden tot degeneratie van de weefsels, ook verantwoordelijk zijn voor het algemeen optredende oedeem. Andere gerapporteerde pathologische bevindingen zijn onder meer hydropericard, hydrothorax, ascites, oedeem (Soulsby, 1965), mesenterische lymfadenopathie en vergroting van submucosale klieren (Millar, 2012). Ook kunnen degeneratieve lesies en destructie van intestinale klieren teruggevonden worden (Soulsby, 1965), alsook fibroplasie (Millar, 2012). De lever zou ook vervetting vertonen en in het bloedbeeld kan anemie met oligocythemie en eosinofilie vaak teruggevonden worden (Soulsby, 1965). Een wijdverspreide sereuze infiltratie is mogelijk in de darmwand, het mediastinum, lymfeknopen en andere weefsels en organen. Het is dus vooral de migratie van de haematofage juveniele pensbotten in de dunne darm die kan leiden tot klinische problemen (Chauvin, 2012). Fig. 7 : Immature pensbot in het duodenale lumen waarbij de orale zuignap vastgehecht is aan de darmmucosae en waarbij opgenomen gastheercellen te zien zijn in de gepaarde caeca (pijltjes) (uit Millar et al., 2012) 5.2 Adulte stadia 250 µm De gerapporteerde symptomen die kunnen ontstaan door de aanwezigheid van volwassen stadia worden vermeld in tabel 4. Wanneer de parasieten volwassen worden, bevinden ze zich in de pens en vormen daar kolonies die bij voorkeur gegroepeerd voorkomen rondom de penspijlers. Hun aantal kan variëren van enkele wormen tot verschillende duizenden. Volgens Losson (1998) is het pathogeen belang van de volwassen trematoden zeer zwak, zelfs bij een sterke infestatie. Volgens Chauvin kunnen er daarentegen wel pensproblemen gezien worden (Chauvin, 2012), zoals recurrente tympanie. Dit is vooral te wijten aan het mechanische effect van de adulte trematoden (Alzieu en Dorchies, 2007). Ruminale pensatrofie kan ook voorkomen. Hierbij worden de beschadigde papillen 12

20 vervangen door een plat niet-secreterend epitheel met weinig subepitheliale lymfatische banen (Soulsby, 1965). In de pens kan er oedeem te zien zijn van de mucosaplooien en kunnen er kleine hemorrhagische ulcers aanwezig zijn (Chauvin, 2012). Er kan ook een voorbijgaande indigestie, eventueel met diarree en dalende eetlust opgemerkt worden (Janssens et al, 1989). Na therapie kan men bij zwaar geïnfecteerde dieren een algemene verbetering van de toestand waarnemen (Chauvin, 2012). Tabel 3 : Symptomen door immature stadia pensbot Symptomen door immature stadia Referentie Diarree (waterig, bruingroen) Millar, 2012, Alzieu en Dorchies, 2007, Boch en Supperer, 2006, Losson et al., 1998 en Janssens et al, 1989, Kaufmann, 1996, Morgan en Hawkins, 1949, Spence et al., 1996, Dorny et al., 2011 Zwakte / slechte conditie / progressieve achteruitgang Millar, 2012, Kaufmann, 1996, Morgan en Hawkins, 1949, Spence et al., 1996 Onregelmatig herkauwen Kaufmann, 1996, Boch en Supperer, 2006 (Voorbijgaande) indigestie Janssens et al, 1989 Anemie Dorny et al., 2011, Morgan en Hawkins, 1949, Spence et al., 1996 Apathie Boch en Supperer, 2006 Lichte koorts Boch en Supperer, 2006 Anorexie / dalende eetlust Spence et al., 1996, Millar, 2012, Janssens et al, 1989 Dehydratatie Millar, 2012 Mortaliteit Kaufmann, 1996 en Chauvin, 2012 Tabel 4 : Symptomen door adulte stadia pensbot Symptomen door adulte stadia Referentie Recurrente penstympanie Alzieu en Dorchies, 2007 Algemene zwakte Alzieu en Dorchies, 2007 Pensatonie Alzieu en Dorchies, 2007 Slappere mest Productiedaling Alzieu en Dorchies, 2007 Anuracpreeda, Immuniteit De meeste parasieten induceren een bepaalde immuniteit bij hun gastheer. Er ontstaat aldus een evenwicht tussen de parasitaire populatie en de gastheer. Volgens Chauvin (2012) gaat dit fenomeen echter niet op in geval van infestatie met trematoden. Elke herinfectie met pensbot leidt tot een accumulatie van het aantal parasieten (Chauvin, 2012). Een studie van 2013 in Spanje toont aan dat oudere koeien vaak met hogere aantallen parasieten geïnfecteerd waren en dat zij een hogere prevalentie van infectie vertoonden en tegelijk een hoger percentage positief waren op coprologie (González-Warleta et al.). Ook Ferreras et al. (2014) suggereert dat herhaalde blootstelling aan 13

21 pensbotten geen bescherming zou bieden tegen herinfectie. Mestvee blijkt gevoeliger te zijn voor een pensbot-infectie dan melkvee (González et al., 2013, Dorchies et al., 1998). Volgens Barringa (1981) wordt echter wel bescherming vermoed na herhaalde infecties en deze zou tot minstens 1 jaar kunnen aanhouden, tenzij de nieuwe infectie van massale omvang is. 7. Diagnose Bij het stellen van de diagnose moet er een onderscheid gemaakt worden tussen ziekte veroorzaakt door adulte of door immature stadia. De voornaamste en meest beschikbare manier van diagnose is mestonderzoek. In de acute fase van een infectie, kan mestonderzoek echter leiden tot vals negatieve resultaten. Het vaststellen van de aanwezigheid van pensboteieren in de mest zonder het aanwezig zijn van klinische symptomen is bovendien geen indicatie voor paramphistomosis (Kaufmann, 1996). Naast mestonderzoek als diagnostische tool gebeurt er ook onderzoek naar serologische en moleculaire technieken, die mogelijk in de toekomst kunnen leiden tot een verbeterde diagnose. 7.1 Mestonderzoek Immature stadia Immature stadia kunnen nog geen eieren uitscheiden, maar bij erg zware infecties kunnen deze immature vormen wel zelf in de faeces terechtkomen (Kaufmann, 1996, Chauvin, 2012). Hun aanwezigheid zal dus enige indicatie kunnen geven over de uitgebreidheid van infectie (Soulsby, 1965). Boray (1959, in Soulsby, 1965) raadt een sedimentatie-overgiet techniek aan. Een grote hoeveelheid faeces (250 g) wordt overgegoten in een diep glazen vat totdat het supernatans doorzichtig is, de immature paramphistomen worden gevonden in het sediment. Deze immature stadia zijn 3 à 4 mm in lengte. Herhaalde mestonderzoeken door de sedimentatietechniek gaven echter lage en niet-consistente tellingen van immature pensbotten. Om de diagnose te bevestigen is daarom een post-mortem onderzoek sterk aangewezen (Soulsby, 1965) Adulte stadia Er kan een onderscheid gemaakt worden tussen kwalitatief en kwantitatief faecesonderzoek. Bij routine onderzoeken is kwalitatief onderzoek meestal voldoende. Hierbij wordt nagegaan of een dier al dan niet besmet is met een bepaalde parasiet. Om een goed beeld te verkrijgen van de infectiegraad kan men beter een kwantitatieve bepaling doen. Hierbij kan onder meer het aantal eieren per gram faeces (= EPG) worden bepaald (Vercruysse, 1992). De aanwezigheid van de eieren van volwassen pensbotten kan worden aangetoond via coproscopie (Janssens et al, 1989) en dit volgens dezelfde technieken als die om leverbot-eieren aan te tonen (Soulsby, 1965). De eieren van Paramphistomum species zijn vrij groot, ze meten 114 tot 176 µm op 73 tot 100 µm (Soulsby, 1965 en Hendrix en Robinson, 2006), ze zijn doorzichtig en voorzien van een operculum (Kaufmann, 1996). Er is een granulaire inhoud te zien (Losson et al., 1998). Het Paramphistomum-ei vertoont gelijkenissen met dat van Fasciola hepatica (leverbot), maar heeft een lichtere kleur en is ook iets groter in afmeting (Soulsby, 1965). Toch kan dit leiden tot verwarring (zie fig. 8) (Mage en Dorchies, 1998). Eieren van 14

22 Paramphistomum species worden wel in hogere mate uitgescheiden dan die van Fasciola hepatica (Mage en Dorchies, 1998). A B Fig. 8 : Doorzichtig ei pensbot (A) en geel ei leverbot (B) (eigen foto) Eén van de kwantitatieve methoden die gebruikt wordt om de EPG te bepalen van verschillende soorten parasieten is de McMastermethode. Deze techniek maakt gebruik van een telkamer (zie fig. 9). Aangezien de eieren van trematoden zwaarder zijn dan de meeste nematoden, cestoden en protozoa, drijven deze slechts op flotatievloeistoffen met een soortelijk gewicht boven 1,35. Verschillende flotatievloeistoffen werden hiervoor beschreven. Vaak wordt gebruik gemaakt van ofwel zinksulfaatoplossing, kalium iodomercuraat of een combinatie van deze twee (Cringoli, 2009). Er kan ook geopteerd worden voor een zinkchlorideoplossing. Het nadeel is echter dat de eieren vervormd zullen raken (Vercruysse, 1992), hierbij moet dan ook rekening worden gehouden bij de interpretatie. Rieu et al. (2007) onderzochten de mate van betrouwbaarheid van coprologisch onderzoek via een gemodificeerde McMastertechniek. Hun coprologische resultaten waren in overeenstemming met de necropsie-onderzoeken (sensitiviteit en specificiteit steeds hoger dan 0,9). Er werd een significante relatie gevonden tussen EPG-tellingen en de ergheid van infectie. Het vinden van meer dan 100 eieren per gram mest gaf een indicatie dat er zich meer dan 100 adulte paramphistomen in de pens of netmaag bevonden. Fig. 9 : Telkamer om de McMaster techniek toe te passen (uit Gibbons et al., 2007) 15

23 7.2 Serologie In Thailand werd via SDS-PAGE en immunoblotting het antigenisch profiel van een somatisch extract van P. cervi geanalyseerd en werd een parasiet-specifiek somatisch eiwit (52 kda) gevonden dat mogelijk als diagnostisch antigen kan dienen bij het testen van serum van geïnfecteerde runderen (Anuracpreeda et al., 2008). Vijf jaar later werd via dezelfde technieken en door dezelfde onderzoeker het antigenisch profiel onderzocht van de excretie-secretie (E.S.) fractie van P. cervi. Via een indirecte ELISA-test en immunoblotting werd de antigeniciteit bevestigd van een specifiek excretie-secretie eiwit van 40 kda. De diagnostische sensitiviteit en specificiteit van dit antigen bij immunoblotting waren 100% respectievelijk 98,9%. Dit vormde alweer een verdere stap in de immunodiagnostiek voor paramphistomosis (Anuracpreeda et al. 2013). In zowel Spanje als Uruguay werd een ELISA ontwikkeld voor het aantonen van een humorale IgG respons tegenover de ES-fractie van adulte C. daubneyi trematoden. De sensitiviteit en specificiteit lagen beiden rond de 80% in vergelijking met de necropsie-onderzoeken. Er werd ook een kruisreactie vastgesteld met sera van dieren die geïnfecteerd waren met Fasciola hepatica (Sanchís et al., 2013). 7.3 Moleculaire technieken Op basis van de morfologie is het moeilijk om het onderscheid te maken tussen verschillende soorten Paramphistomum species (González-Warleta et al., 2013). Via verfijnde moderne technieken zoals DNA-extractie en moleculaire typering is het wel mogelijk om de species te identificeren. Hierbij kan onder meer volgend protocol gevolgd worden: de pensbotten worden individueel ingevroren tot -85 C. Daarna wordt de species geïdentificeerd op basis van moleculaire analyse. DNA-stalen worden hierbij geanalyseerd. De ITS-2 (second internal transcribed spacer) regio van ribosomaal DNA wordt geamplificeerd via PCR (polymerase chain reaction), met primers die specifiek zijn voor C. daubneyi species. De sequentie van de vermeerderingsproducten kan dan vergeleken worden met diegenen die aanwezig zijn in de Genbank voor species-identificatie (Gordon et al., 2013). Deze techniek dient echter rechtstreeks toegepast te worden op de parasiet en kan nog niet gebruikt worden voor onrechtstreekse diagnose via een faeces-staal. 8. Controle 8.1 Behandeling Er is geen enkel geneesmiddel geregistreerd voor de behandeling van pensbot-infecties (Chauvin, 2012). Wel zijn er van sommige leverbotmiddelen beperkte veldgegevens beschikbaar over hun werkzaamheid tegenover pensbotten. Algemeen wordt oxyclozanide als beste geneesmiddel beschouwd voor de behandeling tegen Paramphistomum spp. In België is enkel Zanil beschikbaar met als actief bestanddeel oxyclozanide. Dit mag aan een dosis van 10 mg/kg gegeven worden en met een maximum van 100 ml per dier (BCFI vet, 2013). Om werkzaam te zijn tegen pensbotten is echter een hogere dosis nodig. Een optimaal resultaat wordt bekomen bij 15,3 mg/kg (orale toediening). Aan een dosis van 18.7 mg/kg zal 16

24 het ook werkzaam zijn tegen de immature stadia, maar door deze hoge dosis heeft dit nadelige gevolgen zoals diarree en lusteloosheid (Chauvin, 2012). Ook werden productiedalingen beschreven, deze zouden maximum 48u aanhouden (Spence et al., 1996). Naast oxyclozanide worden nog enkele andere moleculen beschreven voor de behandeling tegen pensbotten. Vroeger werd koolstoftetrachloride als behandeling aangeraden, dit in een dosis van 5 tot 10 ml in gelatine capsules (Morgan en Hawkins, 1949). Hexachlorofeen, toegediend in een dosis van 20 mg per kg lichaamsgewicht gedurende 3 opeenvolgende dagen, zou zeer efficiënt zijn tegen zowel de juveniele als de adulte paramphistomen (Rolfe en Boray, 1987 in Bowmnan, 1985). Volgens Janssens (1989) kan ook bithionol (70 mg/kg) en niclosamide (75 mg/kg) gebruikt worden bij de behandeling. Volgens Swan (1999) hebben niclosamide en ook resorantel een hoge werkzaamheid tegen zowel juveniele als volwassen pensbotten. Rafoxanide en closantel zouden maar weinig effectief zijn (Swan, 1999). Een recentere studie toont echter aan dat closantel wel een gelijkaardige werkzaamheid zou uitoefenen tegen C. daubneyi als oxyclozanide (Arias et al., 2013). Triclabendazole en clorsulon, die gebruikt worden voor de behandeling van leverbot, zouden niet effectief zijn tegen paramphistomen (Mage en Dorchies, 1998). Ook door Foster et al. (2008) werd, na het toedienen van triclabendazole, geen verbetering van mogelijke symptomen van pensbotten gezien, nl. daling in melkproductie noch diarree verbeterden. 8.2 Preventie Profylaxie bestaat uit 2 soorten maatregelen: chemoprofylaxie steunend op de toediening van een actieve stof gedurende bepaalde perioden van het jaar en het vernietigen van de tussengastheer (slakkencontrole) en/of het onbereikbaar maken van de slakkenhabitats voor de eindgastheer (Losson et al., 1998) Chemoprofylaxie In geval van een vermoeden van pensbot-infectie bij runderen, wordt volgens Losson et al. (1998) best preventief een behandeling ingesteld op het einde van de herfst of begin van de winter. Dorchies et al. (1998) vermeldt dat de behandeling best zou moeten gebeuren net voor de dieren terug op de weide komen, aangezien de EPG verhoogt gedurende de winter (Dorchies et al., 1998) Weidebeheer en slakkencontrole Paramphistomose is een seizoensgebonden aandoening (Chauvin, 2012). Aangezien de tussengastheerslak zich in vochtige gebieden bevindt, is het vrij gemakkelijk om risicozones op de weide in kaart te brengen (Chauvin, 2012). Het identificeren ervan is onmisbaar om een goed preventieplan te kunnen opstellen. Op basis van die gegevens is het mogelijk om een haalbaar plan te evalueren en het maakt ook een optimalisering mogelijk van een antiparasitaire behandeling (Chauvin, 2012). Het vinden van tussengastheerslakken kan helpen om risicozones in kaart te brengen. Afhankelijk van het gebied zal dit al dan niet makkelijk zijn (Chauvin, 2012). De risicozones zijn laaggelegen en de infectiekansen kunnen vergroten naarmate langere perioden van droogte zich 17

25 voordoen, aangezien de metacercariën dan meer bereikbaar worden voor de dieren (Janssens et al, 1989). Op de eerste plaats is het noodzakelijk om ervoor te zorgen dat de vochtige zones niet meer toegankelijk zijn voor de runderen. Dit kan onder meer door het omheinen van vochtige zones (Soulsby, 1965) of men kan er ook voor proberen te zorgen dat de dieren rein drinkwater ter beschikking hebben vanuit waterputten of door ervoor te zorgen dat ze vanuit verhoogde, slakkenvrije drinkplaatsen kunnen drinken (Kaufmann, 1996). Drainage van moerasgebieden en zoetwaterplassen is een lange termijn controlebeleid (Soulsby, 1965). Daarnaast kan het verweiden van gevoelige dieren van een natte en geïnfecteerde weide naar een drogere weide in het gepaste seizoen de controle bevorderen (Rolfe et al., 1991). Hierbij brengt men best de prepatente periode in rekening. De tussengastheerslakken vermeerderen zich voornamelijk tijdens de lente. Afhankelijk van de temperatuur zal dan de duur van ontwikkeling van C. daubneyi in het extern milieu en vervolgens in de slak een 3-tal maanden bedragen (Chauvin, 2012). Een deel van metacercariën kan dus al vanaf het midden van de zomer opgenomen worden. Vaak gebeurt het echter pas later, omwille van het feit dat er in de zomer meestal drogere perioden zijn en de slakken in een soort van ruststadium komen. Vanaf de herfst, als het terug vochtiger wordt, worden de meeste cercariën uitgescheiden (Chauvin, 2012). De eindgastheren worden vooral in het begin van de herfst acuut geïnfecteerd en deze infectie wordt chronisch tijdens de winter (Chauvin, 2012). De dieren kunnen echter ook in de lente besmet worden, vooral door de cercariën die op dat moment door de slakken worden uitgescheiden die hun activiteit hernemen na de winter. Deze infecties zijn echter verwaarloosbaar omdat vele slakken sterven gedurende de winter (Chauvin, 2012). 18

26 II. Eigen onderzoek 1. Introductie In West-Europa werd vroeger traditioneel gezien weinig belang gehecht aan infecties met paramphistomen, gezien hun beperktere voorkomen en relatief lage pathogeniciteit. Infestaties van pensbotten bij herkauwers lijken echter de laatste jaren alsmaar meer voor te komen in onze streken. Sinds de jaren 1990 werd een verhoging van Paramphistomum spp. prevalentie in Frankrijk vastgesteld (Mage en Dorchies, 1998). De laatste jaren zien we ook in andere Europese landen een toename van meldingen van pensbot-infecties met mogelijk pathogeen belang. In 2007 werden in Groot-Brittannië en Ierland vaker geïnfecteerde dieren gevonden en ook routine mestonderzoeken gaven een stijging in prevalentie weer (Murphy et al., 2008). Ook in Zuidwest-Europa, nl. in Portugal en Spanje werden vanaf toen meer en meer studies verricht naar het belang van pensbotten en daaruit bleek dat men daar ook kan spreken van een toename in prevalentie (Arias et al., 2011). Volgens Dierengezondheidszorg Vlaanderen en het laboratorium voor parasitologie van de Faculteit Diergeneeskunde te Merelbeke, worden ook hier in België meststalen vaker positief bevonden op de aanwezigheid van eieren van paramphistomen (ongepubliceerde gegevens). Gezien de mogelijke toenemende prevalentie in ons land, de vermoedelijke toename in infectiegraad en de toenemende rapporteringen van klinische gevallen is er absoluut nood aan meer kennis over deze parasiet. Recent werden ook enkele klinische gevallen beschreven: in 2012 werd bij 2 kalveren in Engeland de diagnose acute paramphistomosis gesteld na post-mortemonderzoek (Millar et al.). Er is echter geen gecontroleerde studie over het pathogeen belang in onze streken. Zoals blijkt uit het literatuuroverzicht zijn er tevens weinig gegevens over diagnosemogelijkheden. Eieren kunnen aangetoond worden in de mest. Maar wat is de gevoeligheid van deze methode en is het aantal uitgescheiden eieren wel gecorreleerd met de infectiegraad? Ten slotte is er weinig geweten over behandelingsmogelijkheden. Recent werd closantel als mogelijk geschikt geneesmiddel geopperd (Arias et al., 2013), maar het ging hierbij over een kleinschalige studie en deze gegevens vereisen verder onderzoek. 2. Objectieven Gezien de bovengestelde vragen wilden we via dit onderzoek nieuwe inzichten verwerven in het pathogeen belang, de diagnose en behandeling van pensbot-infecties bij rundvee. Meer specifiek hadden we 3 concrete objectieven: 1) Het onderzoeken van het verband tussen het aantal uitgescheiden eieren en de infectiegraad met adulte pensbotten. 2) Het nagaan van de rol van pensbot-infecties bij najaarsdiarree aan de hand van een case-control studie. 19

27 3) Het evalueren van closantel bij de behandeling van infecties met volwassen pensbotten via de Faecal Egg Count Reduction Test (FECRT). 3. Materialen en methodes 3.1 Verband tussen het aantal uitgescheiden eieren en de infectiegraad met adulte pensbotten Bij deze studie was het de bedoeling om in het slachthuis een score toe te kennen per dier naargelang de infectiegraad van de pens met pensbotten en om daarna meststalen te nemen van elk gescoord dier zodat achteraf in het labo de mate van ei-uitscheiding kon bepaald worden Slachthuisbezoek Op 22 november en op 13 december 2013 werden in het slachthuis te Brugge 60 respectievelijk 65 meststalen genomen van pas geslachte runderen en werd er een visuele score gegeven gerelateerd aan de hoeveelheid aanwezige pensbotten in het rumen en reticulum. De scores werden toegekend aan de hand van volgende gradaties: score 1 gaf aan dat er macroscopisch geen pensbotten zichtbaar waren, score 2 gaf een lichte infectie aan (aantal pensbotten tussen 1 en 50), score 3 gaf een matige infectie aan (aantal pensbotten tussen 51 en 200) en score 4 een zware infectie (aantal pensbotten tussen 201 en 1000). Ten slotte was score 5 voorzien voor dieren die zeer zwaar besmet waren (aantal pensbotten hoger dan 1000). Een mooi voorbeeld van een geïnfecteerde tegenover een niet-geïnfecteerde pens is te zien op fig. 10. Fig. 10 : Duidelijk onderscheid tussen geïnfecteerde en niet-geïnfecteerde pens (eigen foto) 20

28 De meststalen werden zorgvuldig gemerkt zodat ze achteraf gelinkt konden worden aan de pensscore Mestconsistentie In het laboratorium werd per meststaal een graad toegekend in verband met de mestconsistentie. Deze graad bestond ofwel uit normaal, plat of waterig. Zowel de score i.v.m. macroscopisch zichtbare pensbotten (zie 3.1.1) als de graad voor consistentie van de mest werden door dezelfde onderzoeker gegeven Mestonderzoek aan de hand van mini-flotac Mini-Flotac is een recente techniek voor parasitologisch mestonderzoek die het mogelijk maakt om het aantal eieren in de mest gebruiksvriendelijk te kwantificeren met een relatief hoge gevoeligheid. De techniek brengt ook een lage kost met zich mee (Barda et al., 2013). De mini-flotac bestaat uit 3 onderdelen, de basis (base), de afleesschijf (reading disc) en de sleutel (key) (zie fig. 11). Voor de precieze montage wordt verwezen naar bijlage 1. A B Fig. 11 : De 3 onderdelen van de mini-flotac (uit Flotac Unina, 2013) (A) en gemonteerde mini-flotac (eigen foto) (B) Voor het onderzoeken van de meststalen werd eerst de flotatievloeistof gemaakt. Omdat een zinkchloride-oplossing minder toxisch is dan een zinksulfaatoplossing werd voor deze oplossing gekozen. Hiervoor werd 1280 g zinkchloridepoeder opgelost in 610 ml water en in eenzelfde volume verzadigde zoutoplossing (NaCl 133 g/1 l water). Deze substanties werden samen gebracht in een glazen recipiënt onder een trekkast omwille van de irriterende eigenschappen van het zinkchloridepoeder en werden via een magnetische roerder met elkaar vermengd. Wegens de exotherme reactie werd de oplossing eerst afgekoeld voor gebruik. De zinkchloride-oplossing werd vervolgens in een donkere fles bewaard wegens de instabiliteit. Per meststaal werd 5 gram afgewogen in een plastic beker. Bij elk staal werd 45 ml zinkchlorideoplossing toegevoegd. Elk staal werd vervolgens 3 keer gezeefd. Dan werden de stalen grondig gemengd door ze 10 keer over te gieten via een extra beker. Via een Pasteur pipet werd met behulp 21

29 van een rubberen peertje de oplossing opgezogen en meteen werd een flotatiekamer gevuld. De mini- Flotac wordt hierbij best schuin gehouden om te vermijden dat er luchtbellen zouden gevormd worden (zie fig. 12). De mengeling werd daarna nog 10 keer overgegoten en ook de tweede kamer werd gevuld. Volgens de instructies van de fabrikant diende er dan 10 minuten te worden gewacht en daarna werd via de sleutel de bovenste millimeter van de flotatiekamer weggedraaid, zodat deze meteen onderzocht kon worden onder de lichtmicroscoop. Fig. 12 : De rode pijl toont een luchtbel die aanwezig is in de mini-flotac (eigen foto) De meststalen werden onderzocht op de aanwezigheid van zowel pensbot als leverbot. Deze werden uitgedrukt in EPG (eieren per gram mest) Data-analyse Eerst werd een overzicht gemaakt van de resultaten van de pensscores en de mate waarop de dieren positief of negatief testten op de aanwezigheid van adulte pensbotten via mestonderzoek. Daarna werd een tabel gemaakt waarop de minimum, maximum en gemiddelde EPG per score kon teruggevonden worden. Vervolgens werd een kruistabel gemaakt met daarin het overzicht van de dieren die wel of niet geïnfecteerd waren in functie van de resultaten van het mestonderzoek. Hierbij werd de sensitiviteit (proportie terecht positieve uitslagen, dus met een pensscore hoger dan 1, onder de werkelijk geïnfecteerde dieren) en de specificiteit (proportie terecht negatieve uitslagen, dus met pensscore 1, onder de werkelijk niet-geïnfecteerde dieren) berekend. Ook de positief voorspellende waarde (PVW, de kans dat het dier echt besmet is bij het besluiten van een positief mestonderzoek) en de negatief voorspellende waarde (NVW, de kans dat het dier niet besmet is bij het besluiten van een negatief mestonderzoek) werden berekend. Voor elke berekende proportie werd er een 95%- betrouwbaarheidsinterval (BI) (exact binomial betrouwbaarheidsinterval) berekend via het statistisch programma R. Er werd vervolgens een ROC (Receiver Operating Characteristic) -curve aangemaakt om de drempelwaarde te bepalen waarbij het best onderscheid kon gemaakt worden tussen een gemiddelde en zware infectie (score 3 en 4) tegenover geen en lichte infectie (score 1 en 2). Daarna werd opnieuw een kruistabel gemaakt, met de resultaten tegenover de gevonden drempelwaarde, samen met de sensitiviteit, specificiteit, de PVW en de NVW. Om ook een cut-off waarde te kunnen 22

30 bepalen om het onderscheid te kunnen maken tussen enerzijds zware infectie (score 4) en anderzijds geen tot lichte tot gemiddelde infectie (score ) werd opnieuw een ROC-curve gemaakt en werden dezelfde gegevens gegenereerd zoals hierboven beschreven. Het verband tussen de infectiegraad (score 1-5) en de mestconsistentie (graad 1-3) werd onderzocht aan de hand van een Fisher s exact test. Hierbij werd ook een linear by linear association gedaan via SPSS versie 22. De grafiek in verband met de mestconsistentie werd gemaakt via Microsoft Excel versie Rol van pensbot-infecties bij najaarsdiarree aan de hand van een case-control studie Bij deze studie werd aan dierenartsen gevraagd om meststalen door te sturen van een bedrijf waar er een probleem heerste van diarree en daarnaast ook van een controlebedrijf. Opnieuw werd via mini- Flotac de EPG per dier bepaald. Dit keer werd zowel op pensbot als leverbot getest, alsook voor een deel van de bedrijven op strongyliden en Eimeria Studie-opzet Bij een case-control onderzoek wordt een selectie gemaakt van dieren op basis van hun ziektestatus. In eerste instantie worden dieren geïdentificeerd die klinische symptomen vertonen. Daarnaast worden ook controledieren (die dus geen klinische symptomen vertonen) gezocht en hiervan worden er, liefst in eenzelfde hoeveelheid als klinische dieren, in het onderzoek opgenomen. Bij een casecontrol studie moet er op toegezien worden dat er zo weinig mogelijk selectiebias voorkomt. Dit leidt namelijk tot een foutieve uitgangssituatie waarbij de groepen die men vergelijkt eigenlijk niet vergelijkbaar zijn (Dewulf, 2012). Daarom worden de dieren binnen een groep (case vs. controle) ideaal gezien willekeurig geselecteerd. De controledieren vertonen liefst zoveel mogelijk gemeenschappelijke kenmerken als de klinische cases. Deze kenmerken, ook matching variabelen genoemd, gaan vaak over ras, type, leeftijd, bedrijf of geslacht en zijn vaak kenmerken die in eerdere epidemiologische studies als risicofactoren aangeduid werden. Zo wordt voorkomen dat een achteraf gevonden verband eerder een gevolg is van één van de reeds gekende matching variabelen en niet van andere risicofactoren waarin men specifiek in geïnteresseerd is in de studie. Men moet wel voorkomen dat er een overmatching gebeurt: er mogen niet teveel variabelen gelijkend zijn, gezien dit het onderscheidend vermogen van een analyse kan verminderen (Dewulf, 2012). Een case-control studie brengt een aantal voordelen met zich mee: de studie kan vrij snel opgestart worden, is relatief goedkoop en er zijn slechts weinig dieren nodig wanneer de ziekte slechts weinig voorkomt. Er kunnen ook reeds bestaande cases worden gebruikt en de studie houdt geen risico in voor de dieren. Het nadeel is echter dat het vaak moeilijk is om een goede controlegroep te selecteren (Thrusfield, 2005). Op 6 september 2013 werd via Veepeiler Rund, dat een onderdeel vormt van DGZ Vlaanderen, een nieuwsbrief verspreid naar verschillende rundveedierenartsen (zie bijlage 2). Hierbij werden de dierenartsen gevraagd om hun medewerking te verlenen aan dit onderzoeksproject naar de impact van pensbot. Om de motivatie te verhogen werd op 10 september gebeld naar een 40-tal sentineldierenartsenpraktijken met de vraag om mee te helpen met het project. Deze praktijken, 23

31 gespecialiseerd in rundvee, hebben reeds in het verleden vrijwillig toegestemd om hun medewerking te verlenen aan veldproeven die door Veepeiler georganiseerd worden in samenwerking met de Faculteit Diergeneeskunde. Ze fungeren als een soort wachtpost voor gebeurtenissen die zich in het veld afspelen en dragen op die manier bij tot het snel kunnen verzamelen van epidemiologische gegevens (Dierengezondheidszorg Vlaanderen, 2014). Wanneer een dierenarts een case rapporteerde, ontving hij 2 staalnamedozen per case. Deze staalnamedozen waren voorzien van rectale handschoenen en een korte invulfiche (zie bijlage 3). Er werd gevraagd om een 5 à 6-tal meststalen te nemen bij runderen op een bedrijf waar er een probleem heerste van diarree. Ook werd gevraagd om een controlebedrijf in de buurt te bemonsteren van een vergelijkbare diergroep. In dit onderzoek waren de matching variabelen type (melkvee of vleesvee) en leeftijd (jonger dan 6 maand tot ouder dan 24 maanden) (zie invulfiche) Mestonderzoek aan de hand van mini-flotac Voor de eerste 31 bedrijven werd per staal 2 keer 5 gram mest afgewogen. De eerste 5 gram werd gebruikt voor het onderzoek met zinkchloride als flotatievloeistof en de overige 5 gram werd gebruikt voor het onderzoek met verzadigde zoutoplossing (NaCl 133 g/1 l water). De zinkoplossing werd gebruikt voor het nagaan van de aanwezigheid van eieren van pensbot en leverbot. De zoutoplossing werd gebruikt om de EPG te bepalen van strongyliden en om de oöcysten per gram (OPG) te bepalen van Eimeria (coccidiose). Voor de analyse werd dezelfde techniek gebruikt zoals hierboven beschreven (zie 3.1.3). Wegens tijdsgebrek werden voor de andere 27 bedrijven de stalen enkel onderzocht op de aanwezigheid van pensbot en leverbot en niet meer op de aanwezigheid van strongyliden en coccidiose Data-analyse Per parasiet werd een kruistabel gemaakt met een overzicht of de betrokken bedrijven positief of negatief werden bevonden samen met het feit of de bedrijven zich in de klinische of controlegroep bevonden. Het verband tussen aanwezigheid van de parasiet en najaarsdiarree werd onderzocht aan de hand van een χ²-test op een 5%- significantieniveau en het verband werd tevens uitgedrukt aan de hand van een odds ratio met zijn 95% BI via het programma SPSS versie 22. Via hetzelfde programma werd ook de grafiek gemaakt i.f.v. de leeftijd van de dieren en werd ook een Fisher s Exact test uitgevoerd om het verband na te gaan tussen de leeftijd van de dieren en de aanwezigheid van adulte pensbotten. 3.3 Evaluatie van closantel bij de behandeling van infecties met adulte pensbotten Een selectie van eerder bevonden besmette bedrijven werd in deze studie opgenomen. Enkele dieren kregen een behandeling met closantel als actief bestanddeel. De omvang en gewichten van de dieren werden opgevolgd. 24

32 3.3.1 Studie-opzet Op 3 bedrijven die eerder in de case-control studie positief bleken te zijn op de aanwezigheid van eieren van pensbot, werden enkele dieren uitgekozen om een behandelingsproef uit te voeren. Hierbij werd de FECRT bepaald. Bij deze test werden de dieren op 2 tijdstippen bemonsterd, nl. op dag 0 (D0, de dag van de behandeling dus) en dag 21 (D21) en werd de reductie in eitelling voor de parasiet bepaald. Op dag 0 werden meststalen genomen van de at random gekozen dieren en werd hun lichaamsgewicht berekend na het meten van de borstomtrek via de Animeter, een speciaal meetlint voor de gewichtsbepaling van rundvee. De dieren werden dan volgens hun gewicht subcutaan behandeld met closantel (Flukiver 5%, Elanco Animal Health) en dit aan een dosis van 10 mg per kg lichaamsgewicht (of 0,2 ml/kg). Eén uur na de behandeling werd nagegaan of de dieren een lokale of systemische reactie ondervonden van de injectie. Op dag 21 werd dezelfde procedure herhaald bij dezelfde dieren (met uitzondering van het toedienen van de behandeling). Deze behandelingsproef werd in samenwerking met de bedrijfsdierenarts uitgevoerd, na goedkeuring van zowel de Ethische Commissie (EC2013/199), het Federaal Agentschap voor de Veiligheid van de Voedselketen (FAVV) als van de Federale Overheidsdienst Volksgezondheid, mits een wachttijd zou gerespecteerd worden van 180 dagen Behandeling Op het eerste en tweede bedrijf werden op drie maart 10 respectievelijk 7 dieren behandeld. De opvolging gebeurde 3 weken later, nl. op 25 maart. Op het derde bedrijf werden 9 dieren behandeld, dit op 12 maart. Op 2 april werd de opvolging verzekerd. In totaal werden dus 26 dieren behandeld met closantel Data-analyse De mate van reductie van eitellingen tussen de periode voor en na behandeling (faecal egg count reduction) werd berekend aan de hand van de hiertoe ontwikkelde software van de Universiteit van Zurich ( (Torgerson et al., 2014). Dit model integreert de variabiliteit van de staalname en de variatie tussen de dieren via een Bayesiaanse interferentie in de analyse (University of Zürich, 2013). 25

33 4. Resultaten 4.1 Verband tussen het aantal uitgescheiden eieren en de infectiegraad met adulte pensbotten Slachthuisbezoek en mestonderzoek Tabel 5 geeft de resultaten weer van de visuele pensscore, die toegekend werd in het slachthuis en het al dan niet positief testen op pensbot via het coprologisch onderzoek. Tabel 5 : Resultaten van pensscore en coprologische diagnose (EPG) van paramphistomosis bij 125 runderen uit het slachthuis Score 1 (geen) 2 (1-50) 3 (51-200) 4 ( ) 5 (>1000) EPG negatief EPG positief Totaal In totaal werden 35 van de 125 dieren macroscopisch gezien positief bevonden voor de aanwezigheid van paramphistomen (= 28%) en kregen aldus een score hoger dan 1. Bij twee stalen werd een score van 1 gegeven, maar was de EPG 10 respectievelijk 20. Bij dit laatste staal werd echter een nota geschreven waarbij vermeld stond dat er 1 pensbot los op de pens werd gezien, maar werd gedacht dat dit mogelijk te wijten was aan contaminatie. Na het coprologisch onderzoek werd duidelijk dat dit waarschijnlijk geen contaminatie was en dat dit dier best score 2 had gekregen. Bij 2 andere stalen werden macroscopisch gezien wel pensbotten teruggevonden, maar werd een EPG van 0 bepaald. Hierbij ging het over zeer lage aantallen pensbotten (score 2) waarbij bij één van hen een nota werd geschreven dat het slechts over 5 pensbotten ging die zich los op de pens bevonden. Voor de overige stalen kwamen de scores 2-5 overeen met positieve ondervindingen via microscopisch onderzoek. Aan geen enkel dier werd score 5 toegekend (>1000 pensbotten zichtbaar). In onderstaande tabel (tabel 6) kan het aantal dieren teruggevonden worden waaraan een bepaalde score werd toegekend en zijn de minimum, de maximum en de gemiddelde EPG per score terug te vinden. Tabel 6 : Minimum, maximum en gemiddelde EPG per toegekende pensscore bij 125 runderen uit het slachthuis Score Minimum EPG Maximum EPG Gemiddelde EPG 1 (geen) ,3 2 (1-50) ,6 26

34 3 (51-200) ,9 4 ( ) We zien dat zowel de minimum, de maximum als de gemiddelde EPG per score stijgende is. In tabel 7 werden de scores opgesplitst in enerzijds infectie en anderzijds geen infectie (naargelang de pensscores). Tabel 7 : Pensscore opgesplitst in enerzijds infectie (ja - scores ) en anderzijds geen infectie (neen - score 1) in functie van het mestonderzoek naar pensboteieren met positieve en negatieve EPG van 125 runderen uit het slachthuis Mestonderzoek Pensbot-infectie + - Ja 33 2 Neen 2 88 Er werd een sensitiviteit [95%-BI] berekend van 0,94 [0,81 tot 0,99]. De specificiteit bedroeg 0,98. Bij deze tabel is de positief voorspellende waarde gelijk aan de sensitiviteit en is de negatief voorspellende waarde gelijk aan de specificiteit. Om na te gaan welke EPG als cut-off waarde kan gebruikt worden om het onderscheid te maken tussen een gemiddelde en zware infectie (score 3 en 4) tegenover geen en lichte infectie (score 1 en 2), werd een ROC-curve aangemaakt (zie fig. 13). We zagen de grootste som van sensitiviteit en van specificiteit bij een EPG van 10. Dit is dus de cut-off waarde. Fig. 13 : ROC-curve om de cut-off waarde te bepalen om het onderscheid te kunnen maken tussen een gemiddelde tot zware infectie tegenover geen tot lichte infectie 27

35 De resultaten van het coprologisch onderzoek van de dieren uit het slachthuis zijn te vinden in tabel 8, waarbij de cut-off waarde van 10 EPG werd gebruikt. Tabel 8 : Pensscore opgesplitst in enerzijds gemiddeld tot zware infectie (ja - score 3 en 4) en anderzijds geen tot lichte infectie (neen - score 1 + 2) in functie van het mestonderzoek naar pensboteieren met EPG groter of gelijk aan de cut-off waarde 10 en kleiner dan 10 EPG van 125 runderen uit het slachthuis Mestonderzoek Gemiddeld tot zware infectie 10 EPG <10 EPG Ja 24 0 Neen De sensitiviteit [95%-BI] werd berekend en kwam op een waarde van 1 [0,86 tot 1]. De specificiteit bedroeg 0,89 [0,81 tot 0,94]. De positief voorspellende waarde kwam uit op 0,69 [0,51 tot 0,83] en de negatief voorspellende waarde was 1 [0,96 tot 1]. Vervolgens werd een nieuwe ROC-curve gemaakt om de cut-off waarde te bepalen tussen enerzijds zware infectie (score 4) en anderzijds geen tot lichte tot gemiddelde infectie (score ) (zie fig. 14). We zagen de grootste som van sensitiviteit en van specificiteit bij een EPG van 200. Dit is dus de cut-off waarde. Fig. 14 : ROC-curve om de cut-off waarde te bepalen om het onderscheid te kunnen maken tussen enerzijds een zware infectie tegenover geen tot lichte tot gemiddelde infectie De resultaten van het coprologisch onderzoek van de dieren uit het slachthuis zijn te vinden in tabel 9, waarbij de cut-off waarde van 200 EPG werd gebruikt. 28

36 Tabel 9 : Pensscore opgesplitst in enerzijds zware infectie (ja - score 4) en anderzijds geen tot lichte tot gemiddelde infectie (neen - score ) in functie van het mestonderzoek naar pensboteieren met EPG groter of gelijk aan de cut-off waarde 200 en kleiner dan 200 EPG van 125 runderen uit het slachthuis Mestonderzoek Zware infectie 200 EPG <200 EPG Ja 10 0 Neen De sensitiviteit [95%-BI] was in dit geval 1 [0,69 tot 1] en de specificiteit bedroeg 0,96 [0,90 tot 0,99]. De positief voorspellende waarde was 0,67 [0,38 tot 0,88] en de negatief voorspellende waarde 1 [0,97 tot 1] Mestconsistentie In onderstaande tabel (tabel 10) wordt het overzicht gegeven van de pensscores in functie van de mestconsistentie. Tabel 10 : Overzicht pensscores gerelateerd aan de mestconsistentie bij 125 dieren uit het slachthuis Mestconsistentie Score Normaal Plat Waterig 1 (geen) (1-50) (51-200) ( ) Totaal Tachtig (80,3%) procent van de dieren die een normale mestconsistentie hadden, kregen score 1, waarbij dus macroscopisch geen pensbotten opgemerkt werden (45 van de 56). Van de 53 dieren die platte mest hadden, waren er 33 (= 62,3%) die score 1 toegekend kregen. 75 procent van de dieren die een waterige mestconsistentie hadden, hadden macroscopisch gezien geen pensbotten (12 van de 16). Tabel 11 schetst een overzicht van de mestconsistentie gerelateerd aan de pensbot-epg s. 29

37 Tabel 11 : Overzicht van het aantal stalen dat positief testte op pensbot (EPG positief) en negatief testte (EPG negatief) met de bijhorende mestconsistenties Mestconsistentie Normaal Plat Waterig EPG positief EPG negatief Totaal In figuur 15 wordt een onderscheid gemaakt tussen enerzijds normale mestconsistentie en anderzijds platte en waterige mestconsistentie. Wanneer we de gegevens uit figuur 15 analyseren blijkt dat er op basis van de Fisher s Exact test (P = 0,184) geen significant verband is tussen de verschillende categorieën, maar er is wel een lineair verband (P = 0,034) tussen de pensscore en de mestconsistentie. Fig. 15 : Mestconsistentie ingedeeld in enerzijds normaal en anderzijds plat en waterig bij 125 dieren uit het slachthuis met de bijhorende pensscore 30

38 4.2 Rol van pensbot-infecties bij najaarsdiarree aan de hand van een case-control studie Aantal bedrijven en locatie Op 12 september kwamen de eerste 10 stalen binnen (5 van een klinisch bedrijf en 5 van een controlebedrijf). De laatste stalen werden eind januari 2014 in het labo van de vakgroep Parasitologie geleverd. In totaal werden 58 bedrijven bemonsterd (waarvan 35 klinische en 23 controlebedrijven). 13 bedrijven bleken positief te zijn op pensbot na mestonderzoek (= 22,4%). Daarvan kwamen er 7 bedrijven uit de klinische groep en 6 uit de controlegroep. De kaart in fig. 16 geeft de plaatsen aan van bedrijven die werden bemonsterd. De groene cirkels geven bedrijven weer die negatief testten op pensbot, de rode vertegenwoordigen de besmette bedrijven. Fig. 16 : Overzicht bemonsterde bedrijven in België en Nederland (rood = pensbotpositieve bedrijven; groen = pensbotnegatieve bedrijven) Zoals kan worden afgeleid uit bovenstaande figuur, werden ook enkele stalen uit Nederland geanalyseerd. De meeste stalen waren echter afkomstig uit Vlaanderen. 31

39 4.2.2 Verband tussen mestonderzoek en voorkomen van najaarsdiarree In tabel 12 zijn de resultaten te vinden van de pensbotpositieve en pensbotnegatieve bedrijven, gerelateerd aan de bijhorende groep (klinisch of controlegroep). Tabel 12 : Overzicht van het aantal bedrijven positief of negatief voor pensbot bij coproscopie horende bij klinische of controlegroep Klinische groep Controlegroep Eindtotaal Pensbot positief Pensbot negatief Eindtotaal Er werd een χ²-test uitgevoerd (χ² = 0,296, P = 0,587). Hieruit kunnen we concluderen dat er geen significant verband is tussen de aanwezigheid van pensboteieren en najaarsdiarree. De odds ratio [95%-BI] bedroeg 0,71 [0,204 tot 2,462]. Gezien het BI de waarde 1 bevat, kan er dus geen significant verband vastgesteld worden tussen de aanwezigheid van pensbotten en het klinisch symptoom diarree. Ook voor leverbot, strongyliden en Eimeria werden dergelijke analyses gemaakt. Bij de χ²-test die werd uitgevoerd voor leverbot verkregen we volgende resultaten: χ² = 0,299, P = 0,584 (zie tabel 13). Wanneer we de odds ratio berekenden [95%-BI] kwamen we aan 0,625 [0,115-3,404]. Er is dus geen significant verband tussen het aanwezig zijn van leverboteieren en diarree. Zoals reeds vermeld werden wegens tijdsgebrek niet alle 58 bedrijven onderzocht op de aanwezigheid van strongyliden en Eimeria spp. In totaal werd bij 32 bedrijven de aantallen strongyliden onderzocht (uitgedrukt in EPG) en werd bij 31 bedrijven de OPG van Eimeria bepaald. Tabel nummer 14 geeft de resultaten weer voor de strongyliden. Er werd opnieuw een χ²-test uitgevoerd (χ² = 1,576, P = 0,209). De odds ratio [95%-BI] bedroeg in dit geval 3,3 [0,492-20,809]. Hieruit kunnen we besluiten dat er geen significant verband is tussen de aanwezigheid van strongyliden en het klinisch symptoom diarree. Voor de resultaten van Eimeria wordt verwezen naar tabel 15. Er werd ook hier een χ²-test uitgevoerd (χ² = 2,062, P = 0,151). Ook bij het berekenen van deze odds ratio [95%-BI] werd een positief getal bekomen, nl. 5,1 [0,465-55,892]. Er is opnieuw geen significant verband aan te tonen tussen de aanwezigheid Eimeria-oöcysten en het klinisch symptoom diarree. 32

40 Tabel 13 : Overzicht bedrijven positief of negatief voor leverbot bij coproscopie horend bij klinische of controlegroep Klinische groep Controlegroep Eindtotaal Leverbot positief Leverbot negatief Eindtotaal Tabel 14 : Overzicht bedrijven positief of negatief voor Stronglyliden bij coproscopie horend bij klinische of controlegroep Klinische groep Controlegroep Eindtotaal Strongyliden positief Strongyliden negatief Eindtotaal Tabel 15 : Overzicht bedrijven positief of negatief voor Eimeria spp. bij coproscopie horend bij klinische of controlegroep Klinische groep Controlegroep Eindtotaal Eimeria positief Eimeria negatief Eindtotaal Verband tussen periode staalname en leeftijd op de aanwezigheid van pensboteieren In figuur 17 wordt op een grafische manier het verband getoond tussen de periode van staalname en het positief testen van bedrijven op de aanwezigheid van pensboteieren in de mest. 33

41 Fig. 17 : Overzicht % pensbotpositieve bedrijven in functie van de maand van staalname We zien dat vooral in januari het percentage positieve bedrijven het hoogste is. Om het verband na te gaan tussen de leeftijd van de dieren en de aanwezigheid van pensboteieren, werd een Fisher s Exact test uitgevoerd (P = 1). Er kon geen significant verband worden aangetoond tussen dieren jonger en dieren ouder dan 24 maanden en de mate van infectie met pensbotten. Tabel 16 : Overzicht aantal bedrijven waar de staalname gebeurde bij runderen enerzijds jonger dan 24 maanden en anderzijds ouder dan 24 maanden tegenover het feit of ze al dan niet positief testten op pensbot bij coproscopie Leeftijd Pensbot-positief Pensbot-negatief Jonger dan 24 maanden 1 6 Ouder dan 24 maanden Bij de groep dieren die ouder zijn dan 24 maanden, zien we dat 1/3 geïnfecteerd is. Bij de jongere dieren zijn er minder positief bevonden, namelijk 1 dier op 6. 34

42 4.3 Evaluatie van closantel bij de behandeling van infecties met adulte pensbotten In onderstaande tabel (tabel 17) worden de gemiddelden weergegeven van de behandelde dieren per bedrijf voor de omvang van de borstomtrek en het daaraan gekoppelde gewicht (via de Animeter ). Ook de resultaten van het mestonderzoek worden vermeld. Er werden zowel op dag 0 als op dag 21 noch lokale noch systemische reacties waargenomen bij de behandelde dieren. Tabel 17 : Overzicht bedrijfsgemiddelde van de omvang- en gewichtsveranderingen en EPG's van pensbot en leverbot op dag 0 en dag 21 na behandeling met closantel Omvang Gewicht Aantal pensboteieren Aantal leverboteieren (cm) (kg) (EPG) (EPG) D0 D21 D0 D21 D0 D21 D0 D21 Bedrijf 1* Bedrijf 2* Bedrijf Gemiddelde * Deze bedrijven werden op dag 22 opgevolgd i.p.v. dag 21 De gemiddelde EPG van pensbot voor behandeling van de 3 bedrijven samen bedroeg 375. Na behandeling daalde deze tot een EPG van 333. Wanneer we de FECR nagaan voor pensbot, zien we voor de 3 bedrijven een reductie [95%-BI] van 8,3% [-0,06 tot 0,21], 0% [-0,83 tot -0,13] en een reductie van 27,2% [0,17 tot 0,36] respectievelijk. Wanneer we kijken naar de FECR voor leverbot zien we voor het eerste bedrijf een reductie [95%-BI] van 93% [0,60 tot 0,99], voor het tweede bedrijf een reductie van 94,1% [0,61 tot 0,99] en voor het derde bedrijf één van 89,3% [0,36 tot 0,99]. De gemiddelde omvangtoename en gewichtstoename van de dieren per dag waren voor het eerste bedrijf 0,07 cm en 0,81 kg. Voor het tweede bedrijf bedroegen deze -0,01 cm en -0,03 kg. Voor het derde bedrijf waren de uitslagen 0,06 cm respectievelijk 0,63 kg. 35

43 5. Bespreking De prevalentie van pensbot is stijgende in verschillende Europese landen (Mage en Dorchies, 1998, Chauvin, 2012, Foster et al., 2008, Murphy et al., 2008, Arias et al., 2011). Uit onze studie blijkt dat bij het slachthuisonderzoek 28% van de dieren geïnfecteerd was en via de case-control studie werd 22% van de bedrijven positief bevonden op Paramphistomum spp. Hoewel onze studie geen gerandomiseerde steekproef betrof, geeft dit aan dat ook in Vlaanderen deze parasiet zeer regelmatig voorkomt. Mestonderzoek blijkt een uiterst geschikte methode te zijn om de aanwezigheid van volwassen pensbotten vast te stellen. De gebruikte techniek heeft zowel een hoge sensitiviteit (proportie terecht positieve uitslagen, dus met een pensscore hoger dan 1, onder de werkelijk geïnfecteerde dieren) als een hoge specificiteit (proportie terecht negatieve uitslagen, dus met pensscore 1, onder de werkelijk niet-geïnfecteerde dieren) (94% respectievelijk 98%). Dit wil zeggen dat er maar 6% vals negatieve resultaten worden bekomen en slechts 2% vals positieve resultaten. De positief voorspellende waarde (PVW) (de kans dat het dier echt besmet is bij het besluiten van een positief mestonderzoek) was 94%. De negatief voorspellende waarde (NVW) (de kans dat het dier niet besmet is bij het besluiten van een negatief mestonderzoek) was 98%. We kunnen dus besluiten dat het inschatten van de pensscores en het bepalen van de EPG door mestonderzoek zowel een hoge sensitiviteit, specificiteit als een hoge PVW en NVW genereert. We zagen ook dat, naarmate de pensscore hoger lag (en er dus meer pensbotten macroscopisch aanwezig waren), de minimum, de maximum en de gemiddelde EPG eveneens verhoogde (zie tabel 6). Mestonderzoek is bovendien een kwantitatieve methode en er kunnen op die manier bepaalde drempelwaarden vastgesteld worden om bijvoorbeeld zware infecties (score 4, nl. meer dan 201 parasieten aanwezig in de pens) te kunnen onderscheiden van lichtere (score 1, 2 en 3 of minder dan 200 parasieten aanwezig in de pens) (cut-off waarde van 200 EPG). Hierbij waren de sensitiviteit en specificiteit 100% respectievelijk 96%. De PVW en NVW waren 67% en 100%. De nadelen van de gebruikte techniek van mestonderzoek blijven echter bestaan: op deze manier kan enkel de aanwezigheid van volwassen stadia aangetoond worden terwijl de pathogeniciteit voornamelijk door de immature stadia wordt veroorzaakt. We zien dat in januari het percentage bedrijven dat positief testte op pensbot het hoogste is (zie fig. 17). Strikt gezien kunnen we hier echter niet meer spreken over najaarsdiarree, maar gezien een hoog percentage stalen pas dan werd binnengebracht in het labo, konden we deze niet zomaar aan de kant schuiven. De reden waarom januari een hoger percentage positieve bedrijven gaf, heeft waarschijnlijk te maken met de lange prepatente periode die voor pensbotten beschreven is. De meeste dieren infecteren zich namelijk in de herfstperiode, wanneer het natter wordt. Dan duurt het gemiddeld nog een 13-tal weken vooraleer de eieren in de mest kunnen teruggevonden worden. We kunnen veronderstellen dat de meeste dieren zich inderdaad voornamelijk in de herfstperiode hebben geïnfecteerd. Dit heeft waarschijnlijk geleid tot het hoge aantal positieve bedrijven, ongeveer 3 maanden later, in januari. We zien dat, in de groep van dieren ouder dan 24 maanden, de prevalentie met pensbotten dubbel zo hoog is in vergelijking met de jongere dieren. Bij de dieren ouder dan 2 jaar 36

44 is 1 op 3 besmet en bij de jongere slechts 1 op 6). De infectie met deze trematoden is dus cumulatief. Daarom beschouwden we de aanwezigheid van pensboteieren in het seizoen met hoogste besmettingsgevaar (najaar) als een indicator voor contact van de runderen met de immature stadia. Toch konden we geen verband aantonen tussen aanwezigheid van pensboteieren en najaarsdiarree. Dit bevestigt dat volwassen pensbotten niet als oorzaak van diarree moeten gezien worden en suggereert tevens dat de pathogeniciteit van immature pensbotinfecties gering is en vermoedelijk beperkt blijft tot (zeldzame) gevallen van massale blootstelling aan immature stadia. Onze resultaten geven aan dat het zeer moeilijk zal zijn om diarree veroorzaakt door pensbot te onderscheiden van andere meer frequente oorzaken (zoals voederfouten en nematodeninfecties). Anderzijds tonen de resultaten ook aan dat er nood is aan nieuwe diagnostische methoden (bv. serologie of copro-antigen detectie) waarmee de aanwezigheid van immature stadia meer betrouwbaar kan bepaald worden om zo hun exacte belang te onderzoeken. In de slachthuisstudie was er wel een verband tussen de pensscore en de mestconsistentie. Hoe hoger de pensscore, hoe hoger de kans dat het dier platte of waterige mest had. Dit is mogelijks te wijten aan verteringsstoornissen door de grotere mechanische hinder die het voedsel ondervindt bij het passeren van de pens. Voor de behandeling tegen pensbotten is er jammer genoeg maar een beperkt arsenaal aan producten beschikbaar. Behandeling gebeurt momenteel met oxyclozanide (oraal toegediend) met het nadeel dat bijwerkingen kunnen optreden bij de hoge dosis die nodig is om werkzaam te zijn tegen pensbotten. Recent werd closantel (ook oraal toegediend) als alternatief voorgesteld aan een dubbele dosering. Arias et al. (2013) rapporteerden een FECR waarde voor pensbot van 97-99%, maar deze studie ging slechts over een beperkt aantal dieren. In onze veldproef bleek closantel niet werkzaam te zijn tegen pensbot. Een mogelijke verklaring is de toedieningswijze. In de studie van Arias et al. wordt closantel oraal toegediend en komt het product dus rechtstreeks in contact met de pensbotten. In onze studie werd closantel subcutaan toegediend (de enige toedieningsvorm voor rund beschikbaar in België). Dit kan misschien leiden tot lagere concentraties van de molecule in de pensinhoud en de parasiet, die zich waarschijnlijk voornamelijk voedt met de pensinhoud. Er is nood aan extra onderzoek waarbij in de toekomst voornamelijk moet gefocust worden op orale formuleringen. Ook naar de werkzaamheid van closantel is meer onderzoek nodig, gezien er slechts beperkte gegevens voorhanden zijn. Wanneer we kijken naar de FECR voor leverbot zien we voor het eerste tot derde bedrijf een reductie van 93%, 94,1% en 89,3%. Na behandeling met closantel waren alle stalen negatief voor leverbot. Men zou dus in principe een reductie van 100% verwachten. Via de gebruikte software wordt echter een Bayesiaanse analyse gemaakt. Hierbij wordt gebruik gemaakt van reeds bekende kansen, die gebaseerd zijn op onderzoek dat reeds in het verleden heeft plaatsgevonden (Tridata, 2014). Closantel is dus wel werkzaam gebleken tegen leverbot, maar niet tegen pensbot, indien subcutaan toegediend aan een dosis van 10 mg per kg lichaamsgewicht (of 0,2 ml/kg). 37

45 We kunnen besluiten dat een vrij hoog percentage dieren in ons land geïnfecteerd is met pensbotten, maar we kunnen echter niet afleiden of dit een al dan niet toenemende prevalentie is, gezien we geen vergelijkingsbasis hebben. Mestonderzoek is een uiterst geschikte methode om de aanwezigheid van adulte Paramphistomum species aan te tonen en closantel is niet geschikt voor de behandeling tegen pensbot bij subcutane toediening aan een dosis van 10 mg per kg. 38

46 Referentielijst Abrous M., Rondelaud D., Dreyfuss G. Cabaret J. (1999). Infection of Lymnaea truncatula and Lymnaea glabra by Fasciola hepatica and Paramphistomum daubneyi in farms of central France. Vet. Res. 30, p Alzieu J.P., Dorchies P. (2007). Réémergence de la paramphistomose bovine en France: Synthèse des connaissances actuelles épidémiologiques, physiopathologiques et diagnostiques. Bulletin de l Académie Vétérinaire de France, Vol , p Animal Health Ireland (2013). Parasite Control Leaflet Series. Vol. 2, Ver. 4, p. 2. Anuracpreeda P., Wanichanon C., Sobhon P. (2008). Paramphistomum cervi: Antigenic profile of adults as recognized by infected cattle sera. Experimental Parasitology 118, p Anuracpreeda P., Poljaroen J., Chotwiwatthanakun C., Tinikul Y., Sobhon P. (2013). Antigenic components, isolation and partial characterization of excretion-secretion fraction of Paramphistomum cervi. Experimental Parasitology 133, p Arias M., Lomba C., Dacal V., Vázquez L., Pedreira J., Francisco I., Piñeiro P., Cazapal-Monteiro C., Suárez J.L., Díez-Baños P., Morrondo P., Sánchez-Andrade R., Paz-Silva A. (2011). Prevalence of mixed trematode infections in an abattoir receiving cattle from northern Portugal and north-west Spain. Veterinary Record 186, p Arias M.S., Sanchís J., Francisco I., Francisco R., Piñeiro P., Cazapal-Monteiro C., Cortiñas F.J., Suárez J.L., Sánchez-Andrade R., Paz-Silva A. (2013). The efficacy of four anthelmintics against Calicophoron daubneyi in naturally infected dairy cattle. Veterinary Parasitology 197, p Barda B.D., Rinaldi L., Ianniello D., Zepherine H., Salvo F., Sadutshang T., Cringoli G., Clementi M., Albonico M. (2013). Mini-FLOTAC, an Innovative Direct Diagnostic Technique for Intestinal Parasitic Infections: Experience from the Field. PLOS Neglected Tropical Diseases. Volume 7, Issue 8, e2344. Barringa O.O. (1981). The immunology of parasitic infections. A handbook for Physicians, Veterinarians and Biologists. University Park Press. Baltimore. p Bateman G., MacKeith B., Peberby R. (1987). Dieren van de hele wereld. Insecten. Uitgeverij Areopagus, ECI, Vianen, p B.C.F.I. vet: Belgisch centrum voor farmacotherapeutische informatie. (2013). Internetreferentie: (geconsulteerd op 7 april 2014). Boch J., Supperer R. (2006). Veterinärmedizinische Parasitologie Begründet von Josef Boch und Rudolf Supperer, Herausgegeben von Thomas Schnieder. 6 Vollständig überarbeitete und erweiterte Auflage, Parey, p

47 Bowman D.D. (1995). Georgis Parasitology for Veterinarians. 6 th edition. W.B. Saunders Company. Printed in U.S.A. p Chandler A.C. (1949). Introduction to parasitology with special reference to the parasites of man. 8 th editon. London, p Chauvin A. (2012). Trématodoses des ruminants. Le Point Vétérinaire, Parasitologie interne des ruminants, Volume 43, p Cringoli G. (2009). Flotac Manual appendix n 1. Herbivores. Flotation Solutions and Parasitic Elements, p. 6. Dewulf J.(2012). Beginselen van de veterinaire epidemiologie. Cursus Faculteit Diergeneeskunde, Universiteit Gent, p. 49, 50, 60, 67, 68. Dierengezondheidszorg Vlaanderen (2014). Veepeiler Rund Over Veepeiler Rund. Internetreferentie: (geconsulteerd op 17 april 2014). Dorchies P., Bergeaud J.P., Duranton C., Prévot F., Tessier P. (1998). Extension de la paramphistomose bovine en France: resultants d une enquête coproscopique sur 465 bovins dans treize departments. Revue Méd. Vét , p Dorny P., Stoliaroff V., Charlier J., Meas S., Sorn S., Chea B., Holl D., Van Aken D., Vercruysse J. (2011). Infections with gastrointestinal nematodes, Fasciola and Paramphistomum in cattle in Cambodia and their association with morbidity parameters. Veterinary Parasitology 175, p Fauna Europaea (2013). Fauna Europaea project. Last update August, Internetreferentie: (geconsulteerd op 7 april 2014). Ferreras M.C., González-Lanza C., Pérez V., Fuertes M., Benavides J., Mezo M., González-Warleta M., Giráldez J., Martínez-Ibeas A. M., Delgado L., Fernández M., Manga-González M.Y. (2014). Calicophoron daubneyi (Paramphistomidae) in slaughtered cattle in Castilla y Léon (Spain). Veterinary Parasitology 199, p Flotac Unina (2013). Mini-Flotac technique. Internetreferentie: (geconsulteerd op 9 september 2013). Foster A.P., Otter A., O Sullivan T., Millar M.F., Taylor M.A. (2008). Rumen fluke (paramphistomosis) in British cattle. The Veterinary Record 162, p GBIF: Global Biodiversity Information Facility (2013). Internetreferentie: (geconsulteerd op 18 maart 2014). 40

48 Gibbons L.M., Jacobs D.E., Fox M.T., Hansen J. (2007) RVC/FAO Guide to Veterinary Diagnostic Parasitology. Royal Veterinary College, University of London. Internetreferentie: (geconsulteerd op 27 maart 2014). Gordon D.K., Roberts L.C.P., Lean N., Zadoks R.N., Sargison N.D., Skuce P.J. (2013). Identification of the rumen fluke, Calicophoron daubneyi, in GB livestock: possible implications for liver fluke diagnosis. Veterinary Parasitology 195, p González-Warleta M., Lladosa S., Castro-Hermida J.A., Martínez-Ibeas A.M., Conesa D., Muñoz F., López-Quílez A., Manga-González Y., Mezo M. (2013). Bovine paramphistomosis in Galicia (Spain): Prevalence, intensity, aetiology and geospatial distribution of the infection. Veterinary Parasitology 191, p Hendrix C.M., Robinson E. (2006). Diagnostic Parasitology for Veterinary Technicians. 3th edition. Mosby Elsevier, Missouri, p Janssens P.G, Vercruysse J., Jansen J. (1989). Wormen en wormziekten bij mens en huisdieren. Samsom Stafleu, Alphen aan den Rijn/Brussel, p. 38, 161, 162. Kaufmann J. (1996). Parasitic Infections of Domestic Animals, A Diagnostic Manual. Birkhäuser Verlag, Basel, p. 29, p. 30, p. 149, p Losson B., Cassart D., Mignon B. (1998). Infestation par Paramhistomum sp. chez les bovins: description d un premier cas en Belgique. Ann. Méd. Vét. 142, p Mage C., Dorchies P. (1998). Paramphistomose des bovins: étude des relations coproscopiepopulations parasitaires. Revue Méd. Vét. 149, p Mage C., Bourgne H., Toullieu J.M., Rondelaud D., Dreyfuss G. (2002). Fasciola hepatica and Paramphistomum daubneyi: changes in prevalences of natural infections in cattle and in Lymnaea truncatula from central France over the past 12 years. Vet. Res. 33, p Millar M., Colloff A., Scholes S. (2012). Bovine health: Disease associated with immature Paramphistome infection. Veterinary Record, November 17, p Morgan B.B., Hawkins P.A. (1949). Veterinary Helminthology. Burgess Publishing Company. Minneapolis. Printed in U.S.A. p. 75. Murphy T.M., Power E.P., Sanchez-Miguel C., Casey M.J., Toolan D.P., Fagan J.G. (2008). Paramphistomosis in Irish cattle. The Veterinary Record 162, p Poulin R. (2006). Global warming and temperature-mediated increases in cercarial emergence in trematode parasites. Parasitology 132, p

49 Rieu E., Recca A., Bénet J.J., Saana M., Dorchies P., Guillot J. (2007). Reliability of coprological diagnosis of Paramphistomum sp. infection in cows. Veterinary Parasitology 146, p Rinaldi L., Perugini A.G., Capuano F., Fenizia D., Musella V., Veneziano V., Cringoli G. (2005). Characterization of the second internal transcribed spacer of ribosomal DNA of Calicophoron daubneyi from various hosts and locations in southern Italy. Vet. Parasitol. 131, p Rohde K., Lee, F.O. (1967). Life cycle of Catatropis indica Srivastava (Trematoda, Notocotylidae). Zeitschrift für Parasitenkunde 29, p Rojo-Vázquez F.A., Meana A., Valcárcel F., Martínez-Valladares M. (2012). Update on trematode infections in sheep. Veterinary Parasitology 189,p Rolfe P.F., Boray J.C., Nichols P., Collins G.H. (1991). Epidemiology of paramphistomosis in cattle. International Journal for Parasitology, Vol. 21, No. 7, p Sanchís J., Sánchez-Andrade R., Macchi M.I., Piñeiro P., Suárez J.L., Cazapal-Monteiro, Maldini G., Venzal J.M., Paz-Silva A., Arias M.S. (2013). Veterinary Parasitology 191, p Soulsby J.L. (1965). Textbook of Veterinary Clinical Parasitology. Volume 1 - Helminths. Blackwell Scientific Publications Oxford, p , p Soulsby E.J.L. (1982). Helminths, Artropods and Protozoa of Domesticated Animals. 7 th Baillière Tindall-London. Published in U.S.A. by Lea & Febiger, Philadelphia. p edition. Spence S.A., Fraser G.C., Chang S. (1996). Responses in milk production to the control of gastrointestinal nematode and paramphistome parasites in dairy cattle. Austr. Vet. J., Vol. 74, nr. 6, p Swan G.E. (1999). The pharmacology of halogenated salicylanilides and their anthelmintic use in animals. Review article. Journal of the South African Veterinary Association 70-2, p Thrusfield M. (2005). Veterinary Epidemiology, third edition. Blackwell Publishing. p Torgerson P.R., Paul M., Furrer R. (2014). Evaluating faecal egg count reduction using a specifically designed package eggcounts in R and a user friendly web interface. International Journal for Parasitology. Internetreferentie (geconsulteerd op 4 april 2014). Tridata (2014). Instituut voor toegepaste statistiek en data-analyse. Internetreferentie: (geconsulteerd op 18 april 2014). University of Zürich (2013). Faecal egg count modeling. Internetreferentie (geconsulteerd op 5 april 2014). 42

50 Van Dijk J., Sargison N.D., Kenyon F., Skuce P.J. (2010). Climate change and infectious disease: helminthological challenges to farmed ruminants in temperate regions. Animal 4:3 p (doi: /s ) Vercruysse J., (1992). Parasitaire ziekten bij huisdieren. Deel I Algemene Inleiding. Cursus faculteit diergeneeskunde, p

51 Bijlagen Bijlage 1: Montage van de mini-flotac De mini-flotac bestaat uit 3 onderdelen, de basis (base), de afleesschijf (reading disc) en de sleutel (key). De bovenkant van de basis bevat 2 flotatiekamers en een soort sluitgroeve. De onderkant van de afleesschijf bevat 2 gegraveerde roosters die passen op de basis en een knopje dat past op de sluitgroeve van de basis. De montage van de mini-flotac bestaat uit volgende onderdelen: 1. De onderkant van de afleesschijf wordt geplaatst op de bovenzijde van de basis, zodat het knopje van de afleesschijf past op de sluitgroeve van de basis. 2. De afleesschijf wordt kloksgewijs gedraaid tot het knopje van deze schijf weerstand ondervindt door de sluitgroeve van de basis. 3. De sleutel wordt zorgvuldig geplaatst op de afleesschijf zodat de onderste knopjes van de sleutel passen in de daarvoor voorziene uitsparingen op de bovenkant van de afleesschijf. De mini-flotac is nu klaar voor gebruik. Fig. 18 : Onderdelen van de mini-flotac (Flotac Unina, 2013) 44

52 Bijlage 2: Nieuwsbrief DGZ 45

53 Bijlage 3: Invulfiche 46