Genetic adaptation of bacteria to halogenated aliphatic compounds Poelarends, Gerrit

Transcriptie

1 University of Groningen Genetic adaptation of bacteria to halogenated aliphatic compounds Poelarends, Gerrit IMPORTANT NOTE: You are advised to consult the publisher's version (publisher's PDF) if you wish to cite from it. Please check the document version below. Document Version Publisher's PDF, also known as Version of record Publication date: 2001 Link to publication in University of Groningen/UMCG research database Citation for published version (APA): Poelarends, G. J. (2001). Genetic adaptation of bacteria to halogenated aliphatic compounds: The recruitment and distribution of dehalogenase genes [Groningen]: University of Groningen Copyright Other than for strictly personal use, it is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of the author(s) and/or copyright holder(s), unless the work is under an open content license (like Creative Commons). Take-down policy If you believe that this document breaches copyright please contact us providing details, and we will remove access to the work immediately and investigate your claim. Downloaded from the University of Groningen/UMCG research database (Pure): For technical reasons the number of authors shown on this cover page is limited to 10 maximum. Download date:

2 Samenvatting Van verschillende gehalogeneerde alifatische koolwaterstoffen wordt aangenomen dat ze pas in de biosfeer voorkomen sedert ze industrieel gesynthetiseerd worden. Dit verklaart het recalcitrante gedrag van deze verbindingen: er zijn nauwelijks micro-organismen die ze als groeisubstraat kunnen gebruiken. Voor een aantal stoffen, waaronder 1,2-dichloorpropaan en 1,2,3-trichloorpropaan, is het nooit gelukt organismen te vinden die erop groeien. Afbraak is dan uiterst langzaam en afhankelijk van cometabolisme. Oorzaken voor de slechte afbreekbaarheid van gehalogeneerde koolwaterstoffen zijn in het algemeen het ontbreken van microbiële enzymen (dehalogenasen) die deze synthetische milieuvreemde stoffen als substraat kunnen gebruiken en de giftigheid van deze verbindingen of de gevormde tussenproducten na omzetting. Biochemische factoren zijn dus de oorzaak van de slechte afbreekbaarheid, want gehalogeneerde alifatische koolwaterstoffen leveren ruim voldoende energie voor aërobe groei. Voor andere stoffen kunnen organismen die tot afbraak in staat zijn soms wel geïsoleerd worden uit entmateriaal van plaatsen die al langere tijd met dergelijke stoffen zijn gecontamineerd. Deze organismen moeten dus beschikken over enzymen die milieuvreemde structuren (ook wel xenobiotica genoemd) herkennen en omzetten. Over de evolutionaire oorsprong van deze enzymen en de mechanismen van adaptatie is slechts weinig informatie beschikbaar. Het onderzoek heeft zich daarom gericht op het verkrijgen van inzicht in de manier waarop xenobiotica-afbrekende activiteiten zich ontwikkelen en verspreiden. De synthetische chemicaliën 1,3-dichloorpropeen en 1,2-dibroomethaan werden gekozen als model verbindingen voor het bestuderen van microbiële adaptatie. Deze stoffen worden sinds 1950 op grote schaal toegepast als grondontsmettingsmiddelen (nematociden) in de akkerbouw, de boomkwekerij en de bloemen- en plantenteelt. Ze zijn vreemd voor de natuur en worden niet of slecht afgebroken door micro-organismen. Ten gevolge van de slechte biologische afbraak kunnen deze mutagene en kankerverwekkende stoffen accumuleren in het grondwater, waar zij een sterke bedreiging vormen voor de kwaliteit van het drinkwater en de daar aanwezige micro-organismen. De experimentele aanpak betrof dus de isolatie van microorganismen die 1,3-dichloorpropeen of 1,2-dibroomethaan als groeisubstraat konden gebruiken, om vervolgens in detail de genetica en biochemie van de corresponderende afbraakroutes te bestuderen en te vergelijken met katabole routes en genen in andere (xenobiotica-afbrekende) micro-organismen. Het bleek inderdaad mogelijk om twee bacteriële stammen te isoleren die in staat zijn om 1,3-dichloorpropeen of 1,2-dibroomethaan als enige koolstof- en energiebron te gebruiken. De 1,3-dichloorpropeen-afbrekende bacterie Pseudomonas pavonaceae 170 werd geïsoleerd uit entmateriaal verkregen van landbouwgrond die meerdere malen behandeld was met 1,3-dichloorpropeen. Stam 170 zet deze verbinding om via chloorallylalcohol en 153

3 chlooracrylzuur tot acetaldehyde. Dit organisme maakt gebruik van drie dehalogenasen om op beide isomeren van 1,3-dichloorpropeen te kunnen groeien: een haloalkaan dehalogenase, dat beide isomeren van 1,3-dichloorpropeen omzet in de corresponderende chloorallylalcoholen, en twee chlooracrylzuur dehalogenasen, één specifiek voor het trans-isomeer, de ander specifiek voor het cis-isomeer van chlooracrylzuur. Stam 170 beschikt dus over dehalogenerende enzymen die de milieuvreemde en giftige verbindingen cis- en trans-1,3- dichloorpropeen herkennen en omzetten tot onschadelijke producten. Het meest bijzonder zijn de chlooracrylzuur dehalogenasen. Deze enzymen zijn in staat een chloor af te splitsen van een vinylisch koolstofatoom zonder dat eerst activatie tot een coenzym A derivaat nodig is. Er werd daarom besloten om het reactie-mechanisme van deze enzymen nader te bestuderen. Daartoe werden de genen die coderen voor het trans-3- chlooracrylzuur dehalogenase gekloneerd en werd het tot overexpressie gebrachte enzym bestudeerd. Het dehalogenase herkent slechts twee substraten (trans-3-chloor- en trans-3- broomacrylzuur) en is een hexameer bestaande uit opmerkelijk kleine subunits van 7.6 en 8.4 kda. De aminozuur-sequentie van het dehalogenase vertoont significante identiteit met 4- oxaalcrotonaat tautomerases. Deze tautomerases zijn ook hexamere enzymen, echter zij bestaan uit identieke subunits van 62 aminozuren. Van enkele tautomerases is de driedimensionale structuur en het reactie-mechanisme bekend. Op basis van de sequentie homologie met 4-oxaalcrotonaat tautomerases en plaats-specifieke mutatie experimenten zijn de katalytisch belangrijke residuen in trans-3-chlooracrylzuur dehalogenase geïdentificeerd, wat leidt tot een reactie-mechanisme. De amino-terminale proline in de β-subunit fungeert waarschijnlijk als base en activeert een watermolecuul, dat vervolgens een aanval uitvoert op het koolstofatoom waaraan de chloor of broom gebonden is. Dit resulteert in een onstabiel tussenproduct dat uiteenvalt in malonaat semialdehyde en halide. Een arginine residue (Arg- 11 in de α-subunit) is waarschijnlijk belangrijk voor de binding en positionering van het substraat in het actieve centrum. Op basis van de overeenkomsten in structuur en mechanisme, wordt geconcludeerd dat 4-oxaalcrotonaat tautomerases en 3-chlooracrylzuur dehalogenases evolutionair verwant zijn, ze bezitten een gemeenschappelijke voorouder. De 1,2-dibroomethaan-afbrekende bacterie Mycobacterium sp. stam GP1 werd geïsoleerd vanuit een 1,2-dibroomethaan-afbrekende microbiële mengculture door middel van langdurige selectie-experimenten. Deze stam heeft waarschijnlijk zijn afbrekende eigenschappen verkregen tijdens deze adaptatie-periode. Stam GP1 gebruikt een bijzondere katabole route die bestaat uit twee opeenvolgende dehalogenatie stappen om 1,2- dibroomethaan te ontgiftigen tot ethyleen oxide, dat vervolgens als koolstofbron wordt gebruikt. Een haloalkaan dehalogenase zet 1,2-dibroomethaan om in 2-broomethanol, dat vervolgens zeer snel wordt omgezet in ethyleen oxide door een haloalcohol dehalogenase. De snelle omzetting van 2-broomethanol is de belangrijkste stap in de afbraak van 1,2- dibroomethaan, omdat op deze manier de vorming van het giftige tussenproduct broomacetaldehyde wordt voorkomen. Het haloalcohol dehalogenase gen werd recent 154

4 gekloneerd, waardoor het nu mogelijk is om het reactie-mechanisme van het enzym nader te bestuderen. In zowel Pseudomonas pavonaceae 170 als Mycobacterium sp. stam GP1 wordt de afbraak van haloalkanen dus geïnitieerd door een haloalkaan dehalogenase. De sequentie en genetische organisatie van de corresponderende haloalkaan dehalogenase genen werd bepaald en vergeleken met katabole genen in verschillende haloalkaan-afbrekende micro-organismen om inzicht te verkrijgen in de oorsprong van deze genen. Dit vergelijkend onderzoek heeft aangetoond dat stammen 170 en GP1 de haloalkaan dehalogenase genen verkregen hebben via horizontale gen overdracht, waarna de genen vermoedelijk geïnserteerd zijn in het genoom met behulp van DNA integratie-systemen. Beide genen zijn waarschijnlijk afkomstig van een katabole gencluster die aanwezig is in vele haloalkaan-afbrekende Rhodococcus erythropolis stammen geïsoleerd uit gecontamineerde en niet-gecontamineerde grond monsters. Horizontale overdracht van bestaande dehalogenase genen speelt dus een belangrijke rol in de adaptatie aan gehalogeneerde koolwaterstoffen. Het vergelijkend onderzoek heeft bovendien aanwijzigingen gegeven dat deleties en transpositie een belangrijke rol spelen in genetische adaptatie. Samenvattend, de resultaten beschreven in dit proefschrift geven aan dat de katabole routes voor de afbraak van de milieuvreemde stoffen 1,3-dichloorpropeen in Pseudomonas pavonaceae 170 en 1,2-dibroomethaan in Mycobacterium sp. stam GP1 recentelijk (binnen 50 jaar) gevormd zijn door de acquisitie en unieke combinatie van bestaande dehalogenerende enzymen. Deze recentelijk geëvolueerde afbraak routes zijn op genetisch niveau geassocieerd met integrase genen, suggererend dat DNA integrases een belangrijke rol spelen in de acquisitie van katabole genen. Hoogst interessant is het voorkomen van haloalkaan dehalogenase genen in de genoom sequenties van micro-organismen die niet betrokken zijn bij de afbraak van gehalogeneerde xenobiotica. Dit suggereert dat haloalkaan dehalogenasen oude enzymen zijn. De fysiologische rol en natuurlijke substraten van deze enzymen zijn nog onbekend. 155

5 156