Citation for published version (APA): Shirzadian, R. (2008). Molecular genetic regulation of developmental leaf longevity Groningen: s.n.

Transcriptie

1 University of Groningen Molecular genetic regulation of developmental leaf longevity Shirzadian, Reza IMPORTANT NOTE: You are advised to consult the publisher's version (publisher's PDF) if you wish to cite from it. Please check the document version below. Document Version Publisher's PDF, also known as Version of record Publication date: 2008 Link to publication in University of Groningen/UMCG research database Citation for published version (APA): Shirzadian, R. (2008). Molecular genetic regulation of developmental leaf longevity Groningen: s.n. Copyright Other than for strictly personal use, it is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of the author(s) and/or copyright holder(s), unless the work is under an open content license (like Creative Commons). Take-down policy If you believe that this document breaches copyright please contact us providing details, and we will remove access to the work immediately and investigate your claim. Downloaded from the University of Groningen/UMCG research database (Pure): For technical reasons the number of authors shown on this cover page is limited to 10 maximum. Download date:

2 Samenvatting Bladveroudering is een leeftijdsafhankelijk proces dat plaatsvindt door een sterk gereguleerd mechanisme dat leidt tot hergebruik van opgeslagen voedingsbestanddelen vanuit verouderende bladeren naar de zich ontwikkelende organen. Verbinding van dit proces met het aanschakelen van duizenden genen die voor diverse eiwitten coderen welke een rol spelen in verschillende signaal en biochemische wegen laat zien dat bladveroudering een complex genetisch gecontroleerd verschijnsel is. Deze conclusie wordt verder bevestigd door een functionele analyse van verschillende genen die specifieke effecten op bladveroudering hebben. De voorliggende studie concentreert zich op de isolatie en functionele analyse van genen die bladveroudering in Arabidopsis reguleren. De combinatie van de verkregen resultaten geven de mogelijkheid verschillende belangrijke opmerkingen te maken over de regulatie van de levensduur van een blad in Arabidopsis. Door karakterisering van verouderingsmutanten werd aanzienlijke informatie verkregen die betrekking heeft op het mechanisme dat een rol speelt bij het proces van bladveroudering. Ons huidige begrip van goed gekarakteriseerde verouderingsmutanten wordt besproken in het inleidende hoofdstuk 1. Om nieuwe kenmerken van de regulatie van bladveroudering te bestuderen, werd de hormonale controle van bladveroudering gebruikt ten einde een nieuwe screeningsstrategie te ontwikkelen om nieuwe verouderingsmutanten te isoleren (Hoofdstuk 2). Wat dit betreft, werd in ons werk voornamelijk het concept van het verouderingsvenster gebruikt dat gebaseerd is op de interactie van ethyleen signalen en de voorspelling van daarmee gerelateerde veranderingen door leeftijd. Het model stelt dat elk individueel blad door drie ontwikkelingsgecontroleerde stadia gaat. In het eerste stadium kan ethyleen geen bladveroudering induceren in jonge bladeren, dit wordt aangeduid als de fase van nooit veroudering. In de tweede fase is het blad in staat op ethyleen te reageren met de inductie van veroudering. In de laatste fase wordt bladveroudering geïnduceerd onafhankelijk van de aanwezigheid van ethyleen en wordt als de altijd veroudering fase aangeduid (Hoofdstuk 1). Daarom werd de reactie onderzocht van wild-type planten op ethyleen bij verschillende leeftijden. Exogeen toegediend ethyleen versnelde de aanzet van bladveroudering alleen in de zaadlobben van wild-type planten van 25 dagen oud, terwijl 10 gele bladen werden waargenomen in planten van 42 dagen oud.

3 Samenvatting 151 Geen zichtbare bladveroudering werd waargenomen in planten die gedurende 30 dagen in lucht werden gekweekt. De resultaten bevestigen dat ethyleen een sterke inductor is voor bladveroudering en dat dit effect afhangt van de leeftijd van de individuele bladeren. Gebaseerd op deze waarnemingen, bepaalden wij de experimentele condities voor de secundaire screening van late verouderingsmutanten, wat vervolgens de identificatie opleverde van 16 mutanten die groen bleven. Het werkingsmechanisme van ethyleen is volledig functioneel in tien van de geïsoleerde mutanten, en daarom werd verondersteld dat zij een mutatie in genen dragen die het tijdstip van leeftijdsafhankelijke verandering zou kunnen beïnvloeden. Verdere karakterisering van de groen blijvende mutanten toonde aan dat leeftijd-gerelateerde veranderingen in Arabidopsis worden gereguleerd door verschillende onafhankelijke loci (Hoofdstuk 2). Als een algemene waarneming werd gevonden dat leeftijdsafhankelijke bladveroudering is gecorreleerd met bloeminductie bij Arabidopsis. Het proces van bladveroudering/-afsterving wordt verschillend gereguleerd binnen verschillende Arabidopsis variëteiten, zoals gevonden is voor onset of leaf death101(old101) (een mutant genaamd: aanzet tot bladafsterving 101) (Hoofdstukken 3 en 4) en old3-1 mutanten (Hoofdstuk 5). Identificatie van de EMS-geïnduceerde mutatie in old101 planten, door middel van een map-based kloneringsbenadering, veroorzaakte een dilemma. Het verouderingsfenotype van old101 segregeert als een monogeen kenmerk in zijn eigen achtergrond Ler-0, terwijl het niet hetzelfde patroon vertoonde als het gekruist werd met Col-0 (Hoofdstuk 3). De natuurlijke variatie tussen Col-0 en Ler-0 variëteiten, zou mogelijkerwijs de oorzaak kunnen zijn van de veranderde uitsplitsing in het verouderingsfenotype van old101 (Hoofdstuk 3). Bovendien vertoonden de karteringsresultaten twee genoom gebieden voor de old101 mutatie. Door gebruik te maken van verschillende bijna-isogene lijnen, werd een van de locaties betrouwbaar bepaald als de positie van de old101 mutatie. Door het verder in kaart te brengen werd de positie van de old101 mutatie terug gebracht tot een genoom gebied van 150 kb, verdere kartering werd verondersteld te arbeidsintensief te zijn. Om de EMS-geïnduceerde old101 mutatie verder te identificeren werd een uitgebreide parallelle sequencing strategie gebruikt (Hoofdstuk 3). Door middel van verschillende stappen identificeerden wij met succes de old101 mutatie en pasten een nieuwe methode toe om EMS-geïnduceerde mutaties snel en efficiënt te identificeren. Bovendien

4 152 Samenvatting resulteerde de nieuwe strategie in de betrouwbare ontdekking van vele polymorfismen tussen de referentie (Col-0) en de Ler-0 sequentie (Hoofdstuk 3). Deze methode overkomt de moeilijkheden die voortkomen uit genoom interacties en draagt bij aan een map-based klonering van genen waarvoor een referentie sequentie beschikbaar is. Verdere karakterisering van de old101 mutant, gepresenteerd in hoofdstuk 4, omschrijft een nieuw systeem voor de regulatie van de levensduur van een blad en de inductie van bladveroudering door het fosfo-inositol signaleringssysteem. De recessieve Arabidopsis old101 mutatie induceert een functioneel groen-blijvend fenotype. Bovendien vertonen de old101 planten een vertraging in een door de ontwikkeling geïnduceerde bladveroudering in combinatie met een langzamere ontwikkeling en groei van zaailing en plant. Daarom is het fenotype van de old101 mutant consistent met een vertraging in de overgang van de nooit verouderingsfase naar de induceerbare verouderingsfase. Bovendien is de schakeling naar de altijd verouderingsfase waarschijnlijk ook vertraagd in old101 planten (Hoofdstuk 1). Dus de old101 mutatie zou betrokken kunnen zijn bij de integratie van aan veroudering gerelateerde veranderingen en ethyleen afhankelijke signalen. Aangezien OLD101/FRY1 codeert voor een enzym betrokken bij de afbraak van de tweede boodschapper inositol-1,4,5-trifosfaat (IP3) werd verondersteld dat fosfoinositol bevattende signalen leeftijd-gerelateerde veranderingen zouden kunnen reguleren en de ontwikkeling van de blad-levensduur door werking van het IP3 signaal. Het was aangetoond dat OLD101 betrokken is bij stress tolerantie reacties, aangezien old101 planten hogere resistentie vertonen tegen ethyleen stress. Bovendien waren de stomata ontregeld in old101 planten zowel na blootstelling aan ethyleen als in lucht gekweekte planten. Deze gegevens betekenen dat de old101 mutatie niet een verlies van functie maar eerder een gedeeltelijk of geheel verkrijgen van een functie is (Hoofdstuk 4). Samengevat, OLD101 vertoont een uniek regulatie mechanisme voor de ontwikkeling van bladveroudering, groei ontwikkeling, stress tolerantie, en stomatale regulatie door IP3 signalen. Bladveroudering is een soort van geprogrammeerde bladafsterving, en in verband hiermee, wordt in hoofdstuk 5 een negatieve regulator besproken van het proces van bladafsterving, aangeduid met old3-1. De old3-1 mutatie veroorzaakt een enkele aminozuur verandering in het cytosolische enzym OAS-TL, wat resulteert in de onmogelijkheid van old3-1 om in vitro de cysteine biosynthese te katalyseren. De

5 Samenvatting 153 functie-verlies- mutatie old3-1 induceert een temperatuur afhankelijke premature bladafstervings-fenotype in een genoom afhankelijke manier door de interactie met een natuurlijke gen variant, ODD (dat staat voor old3 determinatie). Het old3-1 bladafstervings-fenotype valt samen met een aanzienlijke verhoging van de expressie van markeer-genen voor oxidatieve stress, als ook markeer-genen die vaak geassocieerd zijn met de activatie van het verdedigings-mechanisme van de plant. Het wordt verondersteld dat de constitutieve activering van het verdedigings-mechanisme van de plant in associatie met het old3-1 vroege blad-afstervings-fenotype zou kunnen worden gestimuleerd door de interactie van old3-1 met het ODD gen. De aanwezigheid van een retrotransposon, een mogelijk NB-LRR resistentiegen en het verhoogde aantal SNP's laat de mogelijkheid toe dat het ODD genomisch gebied segregeert als een haplotype allel. Bovendien veroorzaakt de old3-1 mutatie ook veranderingen onafhankelijk van de werking van ODD. Wij hebben een functie vermeld voor het cytosolische OAS-TL bij stress door zware metalen en om het niveau van zwavel en thiolen op peil te houden. Dus OLD3 reguleert zo wel blad levensduur in Arabidopsis en veroorzaakt genoom afhankelijke en onafhankelijke fenotypen (Hoofdstuk 5). De benadering van mutanten analyse die in deze studie gebruikt wordt laat zien dat de interactie tussen ethyleen en leeftijd-gerelateerde veranderingen gebruikt zou kunnen worden als een krachtig instrument om zowel vroege als late verouderingsmutanten te kunnen isoleren. Wat dit betreft, karakterisering van old101 en old3-1 bevestigde verder de effectiviteit van het bestuderen van OLD genen om nieuwe inzichten te krijgen in de regulatie van bladveroudering. Gedurende het laatste decennium werd meer begrip verkregen over het mechanisme dat een rol speelt bij de processen van bladveroudering, door gebruik te maken van nieuwe biologische benaderingen. In de komende jaren zal het kloneren en analyseren van regulatie genen, zoals de OLD genen, in combinatie met totaal genoom analyses, met nog grotere snelheid plaatsvinden, wat zal leiden tot een verdere ontrafeling van het complexe regulatie netwerk van bladveroudering.