Opkomende problematiek: nieuwe GGO en UGM S. Broeders, S. De Keersmaecker, N. Roosens WIV-ISP, Dienst Platform Biotechnologie en Moleculaire Biologie (PBB) Een genetisch gemodificeerd organisme (GGO) is een organisme van niet menselijke oorsprong waarin het genetisch materiaal (DNA) is veranderd op een wijze die niet van nature door voortplanting en/of natuurlijke recombinatie voorkomt (Commissie Richtlijn 2001/18/EG), d.i. door de introductie van een transgeen construct in het genoom van het organisme om een nieuwe eigenschap te bekomen. Tot op heden werden voornamelijk genetisch aangepaste planten op de markt gebracht voor het gebruik in voeding en diervoeder. Deze commercialisering is strikt geregeld in de Europese Unie (EU) via Commissie Verordeningen EG/1829/2003 en EG/1830/2003. De wetgeving legt hierin de noodzaak van traceerbaarheid en etikettering vast om een vrije keuze van de consument, in het eten van GGO-bevattende producten, te garanderen. Deze voorschriften houden in dat de biotech bedrijven die deze GGO hebben ontwikkeld, een dossier voor de vergunning moeten voorleggen inclusief genetisch gemodificeerd (GM) materiaal en een detectie/kwantificering methode voor het geïntroduceerde transgene construct (GM event). De aanbevolen techniek is real-time PCR en de methode moet event-specifiek zijn. Dit houdt in dat de methode ondubbelzinnig het specifieke GGO moet identificeren door zich te richten op de sequentie tussen het transgene construct en het plantgenoom. De volledigheid van het dossier wordt beoordeeld door de Europese Autoriteit voor Voedselveiligheid (EFSA), terwijl het Referentielaboratorium voor Genetisch Gemodificeerde Levensmiddelen en Diervoeders van de Europese Unie (EU-RL GMFF) het materiaal en de doelmatigheid van de ingediende real-time PCR methode controleert. Als aan alle vooropgestelde criteria is voldaan, organiseert het EU-RL een ringtest om de real-time PCR methode te valideren met de steun van de Nationale Referentielaboratoria (NRL) voor GGO detectie. Het finale dossier wordt gepubliceerd op de EU-RL website (http://gmo-crl.jrc.ec.europa.eu/statusofdoss.htm) en dient te worden geïmplementeerd in de GGO detectie laboratoria van de EU-lidstaten. Dit zorgt ervoor dat de verschillende laboratoria gestandaardiseerde en geharmoniseerde methoden voor GGO detectie gebruiken en maakt het behalen van vergelijkbare analyse resultaten tussen de verschillende laboratoria mogelijk. Op dit moment zijn er 23 enkelvoudige GM events en 19 gecombineerde events goedgekeurd op grond van regelgeving EC/1829/2003. Nog eens 10 enkelvoudige events en 4 gecombineerde events vallen onder de nieuwe Low Level Presence (LLP) regelgeving (Verordening EU/619/2011). De meerderheid van deze events vertonen resistentie voor insecten of herbicidentolerantie en gestandaardiseerde methoden voor identificatie en kwantificering zijn beschikbaar. Europese rapporten melden echter dat het aantal en de verscheidenheid aan GGO (met inbegrip van dierlijke GGO) wereldwijd gecommercialiseerd aanzienlijk zal toenemen in de komende 5 jaar (van 25 tot 120 events, van 2 tot 15 soorten genen) (Stein & Rodriguez-Cerezo, 2009). Deze GGO zullen nieuwe genen bevatten om nieuwe eigenschappen te bekomen zoals resistentie tegen pathogenen, gewijzigde gewassamenstelling en abiotische stress tolerantie,... Daarnaast worden ook nieuwe gewassen, zoals bijvoorbeeld aubergine, meloen, papaja, genetisch gemodificeerd. Ten slotte werden de GGO die tot op heden gecommercialiseerd werden in levensmiddelen en diervoeders, ontwikkeld door Amerikaanse en Europese biotech-bedrijven. Deze ontwikkelaars hebben een groot belang bij het aanvragen van toestemming voor de introductie van hun GM events op de Europese markt daar hun producten voor export bedoeld zijn. Echter, in 2015 zal meer dan de helft van de GGO worden ontwikkeld in Azië 18
door onderzoeksinstellingen. Omdat deze GGO alleen bedoeld zijn voor lokaal gebruik (Stein & Rodriguez-Cerezo, 2009), zal geen aanvraag voor een EU-vergunning worden ingediend. Als gevolg hiervan zal geen informatie worden geleverd en zullen dus geen EU-gevalideerde en geharmoniseerde identificatiemethoden beschikbaar zijn voor deze niet-toegelaten GGO (UGM, unauthorised genetically modified organism ). Hierdoor kan de hoeveelheid van UGM op de Europese markt gestaag toenemen als gevolg van hun toevallige aanwezigheid in levensmiddelen en diervoeders die uit Azië in de EU worden ingevoerd. Daarnaast zal de aanwezigheid van deze UGM in levensmiddelen en diervoeders niet geëvalueerd zijn op hun risico voor de volksgezondheid en het milieu en dus kunnen ze worden beschouwd als een mogelijke nieuwe problematiek. Het toenemende aantal geautoriseerde GGO and UGM dat mogelijk aanwezig kan zijn in een staal, zal een invloed hebben op de manier van werken in de GGO detectie laboratoria. Het één voor één identificeren van alle huidige toegelaten GM events is niet meer realistisch omdat het zeer duur en tijdrovend is. In de nabije toekomst zal de toename van het aantal erkende GM events deze werkwijze zelfs onmogelijk maken. Bovendien zijn er geen event-specifieke methoden beschikbaar voor de UGM en dus zullen ze niet gedetecteerd kunnen worden via een dergelijke aanpak. Daarom investeert het WIV-ISP GMOlab (coördinator van het Belgische NRL voor GGO detectie) een groot deel van zijn tijd in de ontwikkeling en validatie van een uitgebreid aantal real-time PCR screening methoden. Deze methoden zijn gericht op het detecteren van taxon-specifieke sequenties (Mbongolo Mbella et al., 2011), generische merkers (Barbau-Piednoir et al., 2010) en GM-specifieke elementen (Barbau-Piednoir et al., 2011). De unieke combinatie van deze screening methoden samen met het gepatenteerde matrix-gebaseerde beslissingssysteem, de zogenaamde CoSYPS (Van den Bulcke et al., 2010.), laat toe om het aantal te identificeren GGO te beperken. Op dit moment worden 17 screeningsmerkers tegelijkertijd gebruikt door het GMOlab voor routine GGO analyse van levensmiddelen en diervoeders onder ISO 17025 accreditatie. Het gebruik van de CoSYPS-gebaseerde analysemethode heeft verschillende voordelen. Ten eerste laat de combinatie van de 17 screeningsmerkers toe om alle GM events die in de EU toegelaten zijn en deze in het kader van de LLP regelgeving te detecteren. Dit maakt het mogelijk om het aantal uit te voeren identificaties drastisch te verminderen. Ten tweede is het een modulair analyse-instrument. Dit impliceert dat er op elk moment nieuwe methoden kunnen worden toegevoegd wanneer nieuwe events (zowel planten als dieren) worden geautoriseerd. Ten derde kan het systeem worden ontwikkeld voor andere doeleinden dan GGO detectie (bijv. ziekteverwekkende bacteriën). Ten laatste maakt deze aanpak het mogelijk om ook te screenen voor niet-toegelaten GGO (UGM) door gebruik te maken van de bestaande merkers en het toevoegen van nieuwe. Het baanbrekende werk van het GMOlab op dit gebied is onlangs erkend op EU-niveau in het bijzonder in het kader van de recent aangenomen wet op de Chinese rijst (Beschikking van de Commissie 2011/884/EU). Dit besluit bepaalt dat er een controle voor GGO moet worden uitgevoerd op rijst en rijst-bevattende monsters uit China en hiervoor werden de analytische screening methoden ontwikkeld door het WIV-ISP voorgesteld. 19
Products in GMO analysis Figuur 1: Producten in GGO analyse Real-time PCR amplification curves: detection of presence of GM element Real-time PCR amplificatie curves: detectie van de aanwezigheid van een GM element Courbes Het is duidelijk d amplification dat de opkomende la problematiek PCR en temps van de réel toenemende : détection hoeveelheid d un élément GGO en UGM in de Europese voedselketen de taken van GGO detectie laboratoria zal intensifiëren. Niet alleen zullen zij meer identificatiemethoden (indien beschikbaar) moeten implementeren, maar ze zullen zich ook moeten richten op het gebruik Real-time van een intensieve PCR dissociation screening procedure. curves: Hiertoe confirmation moeten nieuwe of specific screeningsmerkers amplicon ontwikkeld worden om de detectie van alle geautoriseerde GGO te blijven garanderen, maar ook om een grondige screening voor UGM mogelijk te maken. Het UGMMONITOR project (gefinancierd door de FOD/SPF) zal toelaten om nieuwe methoden te ontwikkelen die zich zowel op plantaardige als dierlijke UGM richten om zo de CoSYPS te actualiseren. Op dit ogenblik is real-time PCR de meest gebruikte methode voor de detectie van GGO. Het GMOlab is echter voortdurend op zoek naar alternatieve analytische technieken om GGO en UGM op te sporen en te identificeren. De oprichting van het BIOTECHlab (behorend tot dezelfde dienst als het GMOlab) vereenvoudigt het onderzoek naar het gebruik van verschillende moleculaire technieken voor de analyse van genetische modificaties. Het WIV- ISP sequeneringsplatform beheerd door het BIOTECHlab, laat toe om de nucleotidesequentie van het fragment geamplificeerd tussen de primers die gebruikt werden voor de screening, te bepalen. Deze extra bron van gegevens kan bijzonder nuttig zijn om de sequentie van een GGO te verifiëren of te bepalen in geval van onduidelijke resultaten. Andere technologieën, zoals DNA walking zullen worden ontwikkeld om onbekende sequenties te lezen vanaf verankerde screening primers (UGMMONITOR project). Bijkomende screeningstechnieken zoals de multiplexing xmap technologie (algemeen gekend als Luminex ), die de gelijktijdige detectie van verschillende GGO (tot 500) (zowel toegelaten als niet-toegelaten in de EU) mogelijk maakt, zullen geëxploreerd worden. 20
Real-time PCR amplification curves: detection of Figuur presence 2a: Real-time of GM element PCR amplificatie curves: detectie van de aanwezigheid van een GM element Real-time PCR amplification curves: detection of presence of GM element Real-time PCR dissociation curves: confirmation of specific amplicon Real-time PCR dissociation curves: confirmation of specific amplicon Figuur 2b: Real-time PCR dissociatie curves: bevestiging van het specifieke amplicon Referenties Richtlijn 2001/18/EG van het Europees Parlement en de Raad van 12 maart 2001 inzake de doelbewuste introductie van genetisch gemodificeerde organismen in het milieu en tot intrekking van Richtlijn 90/220/EEG van de Raad. Official Journal of the European Union, L 106, p 1-38 Verordening (EG) nr. 1829/2003 van het Europees Parlement en de Raad van 22 september 2003 inzake genetisch gemodificeerde levensmiddelen en diervoeders. Official Journal of the European Union, L 268, p 1-23 Products in GMO analysis Verordening (EG) nr. 1830/2003 van het Europees Parlement en de Raad van 22 september 2003 betreffende de traceerbaarheid Real-time PCR en amplification etikettering van genetisch curves: detection gemodificeerde of presence organismen of GM en de element traceerbaarheid van met genetisch Real-time gemodificeerde PCR amplificatie organismen geproduceerde curves: detectie levensmiddelen van de aanwezigheid en diervoeders van en een tot wijziging GM element van Richtlijn 2001/18/EG. Courbes d amplification Official Journal of de the la European PCR en Union, temps L 268, réel p : 24-28 détection d un élément GM Products in GMO analysis Real-time PCR dissociation curves: confirmation of specific amplicon Real-time PCR amplification curves: detection of presence of GM element Real-time PCR amplificatie curves: detectie van de aanwezigheid van een GM element Courbes d amplification de la PCR en temps réel : détection d un élément GM Real-time PCR dissociation curves: confirmation of specific amplicon
Verordening (EU) nr. 619/2011 van de Commissie van 24 juni 2011 tot vaststelling van bemonsterings- en analysemethoden voor de officiële controle van diervoeders wat betreft de aanwezigheid van genetisch gemodificeerd materiaal waarvoor de vergunningsprocedure hangende is of waarvan de vergunning is verstreken. Journal of the European Union, L 166, p 9-15 Stein, A. & Rodriguez-Cerezo, E. (2009). The global pipeline of new GM crops. Implications of asynchroneous approval for international trade. EU23846-EN. Mbongolo Mbella, E. G., Lievens, A., Barbau-Piednoir, E., Sneyers, M., Leunda-Casi, A., Roosens, N. & Van den Bulcke, M. (2011). SYBR Geen qpcr methods for detection of endogenous reference genes in commodity crops: a step ahead in combinatory screening of genetically modified crops in food and feed products. European Food Research Technology, Vol. 232, pp. 485-196 Barbau-Piednoir, E., Lievens, A., Mbongolo-Mbella, G., Roosens, N., Sneyers, M., Leunda-Casi, A. & Van den Bulcke, M. (2010). SYBR Green qpcr screening methods for the presence of 35S promoter and NOS terminator elements in food and feed products. European Food Research Technology, Vol. 230, No. 3, pp. 383-393 Barbau-Piednoir, E., Lievens, A., Vandermassen, E., Mbongolo-Mbella, G., Leunda-Casi, A., Roosens, N., Sneyers, M. & Van den Bulcke, M. (2011). Four new SYBR Green qpcr screening methods for the detection of Roundup Ready, LibertyLink, and CryIAb traits in genetically modified products. European Food Research Technology. Vol. 234, No. 1, pp. 13-23 Van den Bulcke, M., Lievens, A., Barbau-Piednoir, E., Mbongolo Mbella, G., Roosens, N., Sneyers, M. & Leunda Casi, A. (2010). A theoretical introduction to Combinatory SYBR Green qpcr Screening, a matrix-based approach for the detection of materials derived from genetically modified plants. Analytical Bioanalytical Chemistry, Vol. 396, No. 6, pp. 2113-2123 2011/884/EU: Uitvoeringsbesluit van de Commissie van 22 december 2011 inzake noodmaatregelen met betrekking tot niet-toegelaten genetisch gemodificeerde rijst in rijstproducten van oorsprong uit China en tot intrekking van Beschikking 2008/289/EG. Official Journal of the European Union, L 343, p 140-148 Sylvia.Broeders@wiv-isp.be Sigrid.DeKeersmaecker@wiv-isp.be Nancy.Roosens@wiv-isp.be 22