NEDERLANDSE SAMENVATTING Proteomische karakterisatie van perisynaptische astrocyten in synaptische plasticiteit Astrocyten zijn de meest voorkomende cellen in de hersenen en hebben een veelvoud aan functies, waaronder een rol in neurogenese, synaptogenese, ion homeostase, metabole ondersteuning, vorming van de bloed-hersen barrière, opruimen van toxische stoffen en de reactie op hersenbeschadigingen. De astrocyt heeft contact met de synaps via kleine cellulaire uitlopers, genaamd perisynaptische astrocyt projecties (PAPs), met daarop receptor- en transport-eiwitten die synaptische activiteit kunnen detecteren. Tevens bevatten de PAPs gespecialiseerde eiwitten die het mogelijk maken om op synaptische activiteit te reageren met de afgifte van signaalstoffen, genaamd gliotransmitters. Dit vermogen van astrocyten om de synaptische functie te reguleren heeft geleid tot het formeel erkennen van de astrocyt als actief element van de synaps, en daarmee tot de term tripartite synaps, het concept dat de synaps bestaat uit een neuronale pre- and post-synaptische terminal en de PAP. Astrocyten kunnen reageren op verschillende neurotransmitters, waaronder glutamaat, acetylcholine, GABA, en ATP, wat aangeeft dat astrocyten een rol kunnen spelen in meerdere synaptische processen. Daarnaast is gevonden dat de functie van tripartite synapsen veranderd is in verschillende neurologische afwijkingen, zoals epilepsie, depressie, dementie, amyotrofe laterale sclerosis, en schizofrenie, wat het klinische en maatschappelijke belang aangeeft van onderzoek aan de rol van astrocyten bij de synaps. Echter, de vooruitgang in dit onderzoeksveld wordt ernstig vertraagd door het gebrek aan geschikte onderzoeksmethodes om de functie en samenstelling van PAPs te kunnen bestuderen, dit omdat PAPs extreem klein 1
zijn (<1 µm in doorsnede). Het is daarom van groot belang dat nieuwe technieken worden ontwikkeld voor de analyse van PAP functies in verschillende experimentele modellen. In dit proefschrift heb ik verschillende isolatie-methoden onderzocht op hun geschiktheid voor de analyse van PAPs, en heb vervolgens de meest geschikte methode gebruikt voor de analyse van PAP eiwitten in modellen van synaptische plasticiteit. In hoofdstuk 2 hebben we een in vitro methode ontwikkeld, genaamd cold jet, voor de analyse van genen die in astrocyten worden geïnduceerd door de aanwezigheid van neuronen. Deze methode bestaat uit het pipeteren van ijskoude PBS op neuron-astrocyt cokweken, wat resulteert in het loslaten van de neuronen omdat deze andere adhesievermogens hebben dan astrocyten. Met deze methode is het mogelijk om astrocyten te isoleren uit deze co-kweek met 90% zuiverheid. Vervolgens zijn met behulp van microarray-analyse de transcriptionele veranderingen in astrocyten geinduceerd door neuronen bepaalt. Gevonden werd dat met name genen met een metabole functie werden gereguleerd, waaronder de afname van mrnas voor Insig1, Hmgcs, en Dhcr7, die een rol spelen in lipidenmetabolisme. Omdat transcriptionele veranderingen niet strikt correleren met veranderingen op eiwitniveau, en dus biologische functie, heb ik tevens biochemische isolatie-methodes geëvalueerd op hun geschiktheid voor analyse van astrocyt-eiwitten. Gliosomen, geïsoleerd met behulp van een Percoll -gradiënt, zijn verrijkt voor astrocyt-eiwitten, waaronder PAPeiwitten, en daarmee mogelijk een geschikt preparaat voor de identificatie van nieuwe PAPeiwitten en meten van veranderingen in PAP-eiwitniveaus gedurende experimentele veranderingen in synaptische plasticiteit. In hoofdstuk 3 heb ik met behulp van label-vrije TripleTOF massa spectrometrie een meer gedetailleerde analyse gedaan van de eiwitten in 2
gliosomen, en dit vergeleken met Percoll -geïsoleerde synaptosomen. Gevonden werd dat gliosomen verrijkt zijn voor G-eiwit gemedieerde signaaleiwitten, terwijl synaptosomen verrijkt zijn voor vesicle-gemedieerd transporteiwitten. Verrassend was verder de observatie dat niet alleen gliosomen verrijkt zijn in PAP-eiwitten, maar dat synaptosomen zelfs nog meer verrijkt zijn voor PAP-eiwitten. Na een geschikte methode voor analyse van PAP eiwitten te hebben gevonden, ben ik verder gegaan met het bepalen van de bijdrage van astrocyten in synaptische plasticiteit in vivo. Het is bekend dat de supra-optische nucleus (SON) functionele en structurele neuron-glia plasticiteitsveranderingen ondergaat als gevolg van lactatie en hyperosmose. Tijdens deze fysiologische stimuli ondergaat de astrocyt morfologische veranderingen; het trekt zijn uitlopers (PAPs) terug van synapsen op oxytocin magnocellulaire neuronen, waarbij de diffusie en beschikbaarheid van gliotransmitters in de synaps-spleet veranderd. Deze structurele plasticiteit resulteert in een verandering in synaptische plasticiteit die van belang is bij the fysiologische reactie op hyperosmose en lactatie. In hoofdstuk 4 heb ik vervolgens Orbitrap label-vrij massa spectrometrie gebruikt voor kwantitatieve analyse van eiwitexpressie in maagdelijke, lacterende, en hyperosmotische ratten om de eiwitten te identificeren die betrokken zijn bij het moleculaire mechanisme achter deze plasticiteitsveranderingen. Ik heb 985 eiwitten gevonden die gereguleerd werden door plasticiteit, en door het vervolgens filteren van de resultaten heb ik dit aantal teruggebracht tot 86 eiwitten die vermoedelijk in astrocyten een rol spelen bij de plasticiteitsveranderingen. Helaas hebben we deze resultaten met Western blotting voor de meeste eiwitten niet kunnen valideren, al werd voor N-myc down-stream regulated gene 2 (Ndrg2) wel een significante verhoging in eiwitniveaus gevonden bij hyperosmose en lactatie. 3
Ik concludeer dat er waarschijnlijk te veel bronnen van zowel biologische als technische variatie in onze experimentele opzet aanwezig was om de massa spectometrie-data te kunnen valideren, en bediscussieer in hoofdstuk 4 enkele verbeteringen in de methodiek die bij vervolgexperimenten een succesvollere analyse mogelijk maken. Daarnaast hebben we contextuele angst conditionering gebruikt als model voor synaptische plasticiteit, waarbij muizen eerst een conditioneringskamer kunnen onderzoeken voordat ze een voetschok krijgen en daardoor een associatie maken tussen de voetschok en de context (vertraagde schok). Interessant hierbij is dat muizen die een voetschok krijgen voordat ze de conditioneringskamer kunnen onderzoeken (onmiddellijke schok), geen associatie maken tussen de schok en de context, deze muizen kunnen daarmee fungeren als controle voor de stressvolle ervaring van een voetschok, waarmee het effect van synaptische plasticiteit specifiek betrokken bij opslaan van een angstherinnering kan worden bepaald. Daarmee hebben we in hoofdstuk 5 bepaald dat 4 uur na training van de muizen er in de hippocampus 423 eiwitten significant worden gereguleerd, waarvan 164 door een vertraagde schok en 273 door een onmiddellijke schok. Regulatie van meerdere astrocyt-eiwitten werd gevonden, waaronder een verlaging van de glutamaat transport-eiwitten GLAST en GLT-1, en GABA transport-eiwit Scl6a11/GAT3 op 4 uur na een vertraagde schok. Als geheel laat deze analyse zien dat een onmiddellijke schok in staat is om grote veranderingen in eiwitniveaus te veroorzaken, en tevens dat astrocyt-eiwitten gereguleerd worden door zowel een onmiddellijke schok als ook door specifiek het opslaan van angstherinneringen. In hoofdstuk 6 zijn we vervolgens verder gegaan met het onderzoeken van de expressie van een selectie van astrocyt-eiwitten op verschillende momenten in het opslagproces van angstherinneringen. Voor de meeste astrocyt-eiwitten werd een afname in niveaus gevonden 4
na 4 uur. Tezamen laten deze data zien dat astrocyt-eiwitten dynamisch gereguleerd worden tijdens het opslaan van angstherinneringen, en tevens dat astrocyteiwitten vermoedelijk een regulerende rol hebben in het opslaan van herinneringen in het geheugen. Samenvattend, in dit proefschrift heb ik verschillende biochemische preparaten onderzocht op hun geschiktheid voor het bepalen van de rol van astrocyt-eiwitten in synaptische plasticiteit, ik heb een groot aantal astrocyt-eiwitten gevonden die gereguleerd worden door synaptische plasticiteit en die geschikte kandidaat-eiwitten zijn om in vervolgstudies te manipuleren en daarmee moleculaire mechanisme te onderzoeken die ten grondslag liggen aan het functioneren van de tripartite synaps in zowel fysiologische als pathologische omstandigheden. 5
6