146

Bij genetische modificatie door middel van transgenese worden met behulp van biotechnologische technieken erfelijke eigenschappen veranderd of van het ene naar het andere organisme overgebracht. Daarbij kan de natuurlijke barrière tussen soorten overschreden worden. Wanneer de nieuwe genetische informatie terechtkomt in de kiembaan en vervolgens van de ene op de andere generatie wordt doorgegeven, ontstaan transgene dieren. Er zijn verschillende methoden van transgenese. De meest gebruikte methode is de micro-injectie techniek, waarbij een genconstruct met behulp van een micropipet in één van de twee voorkernen van een bevruchte eicel wordt geïnjecteerd. De techniek is redelijk efficiënt, maar de plaats van integratie in het genoom is willekeurig. Een andere veel toegepaste techniek is gene-targeting, waarbij gebruik gemaakt wordt van embryonale stamcellen (ES-cellen). Hierbij worden pluripotente ES-cellen uit een (pre-implantatie) embryo genetisch veranderd. Via homologe recombinatie kan een genconstruct uitgewisseld worden tegen een eigen gen. De plaats van integratie is daarmee bepaald. Deze cellen worden vervolgens weer ingebracht in de blastocoelholte van een (ander) embryo. Er kunnen hierbij ook zogenaamde knock out dieren worden gemaakt, waarbij via homologe recombinatie een gen naar keuze wordt uitgeschakeld. Hierdoor kan meer inzicht verkregen worden in de oorspronkelijke functie van het gen. Transgene dieren spelen een belangrijke rol in het biomedisch onderzoek. De techniek schept de mogelijkheid om diermodellen te maken voor specifiek menselijke genetische ziekten. De meeste transgenese experimenten bij gewervelde dieren worden uitgevoerd met muizen. Het gebruik van de muis als transgeen diermodel neemt nog steeds toe. Door middel van transgenese kunnen zeer specifieke diermodellen gemaakt worden. Dit zou op den duur tot een vermindering en verfijning van het gebruik van (niet-transgene) proefdieren kunnen leiden. In de toekomst wordt echter een toename van het aantal transgene proefdieren verwacht, waardoor het uiteindelijke effect van transgenese op de totale omvang van het proefdiergebruik nog niet goed is te voorspellen. Hoewel het proces van transgenese kan bijdragen aan de verfijning van het proefdiergebruik, kunnen de bij transgenese betrokken biotechnologische procedures ook leiden tot onverwachte, oncontroleerbare en zelfs niet direct zichtbare welzijnseffecten voor de dieren. Het doel van het in dit proefschrift beschreven onderzoek was dan ook om de effecten van de biotechnologische procedures op het welzijn van de nakomelingen nader te bestuderen. Verschillende groepen muizen zijn geproduceerd, die elk verschillende aspecten van ofwel de micro-injectie techniek (Hoofdstuk 2 en 3) ofwel de ES-cel techniek (Hoofdstuk 4 en 5) hebben ondergaan, teneinde vast te stellen of de specifieke manipulaties enig effect hebben op de fysiologische ontwikkeling of het gedrag van de nakomelingen. Op deze manier kunnen de effecten van micro-injectie, electroporatie, embryo-kweek of embryo-transplantatie op de ontwikkeling van (chimere) muizen elk afzonderlijk worden bestudeerd. Alle muizen van de verschillende groepen zijn getest in de periode vóór het spenen (0-3 weken oud) en een periode na het spenen (4-30 weken oud). Vervolgens is er post-mortem onderzoek uitgevoerd. Bovendien is het gebruik van scoringslijsten voor de bewaking van het welzijn van transgene muizen, als onderdeel van de dagelijkse verzorging van de dieren, geëvalueerd. 147

In het eerste deel van de studie zijn de effecten van de biotechnologische procedures welke een rol spelen bij het proces van micro-injectie geïnduceerde transgenese, bestudeerd. Vier verschillende groepen C57BL/6 muizen, die elk verschilden in hun transgenese achtergrond (transgeen na integratie van een functioneel corticotropin-releasing factor (CRF) genconstruct; transgeen na integratie van een niet-functioneel CRF gen construct (construct zonder promotor); niet-transgeen na transgenese procedures; controles) zijn met elkaar vergeleken. De resultaten van de test periode vóór het spenen (Hoofdstuk 2) toonden aan dat de overlevingskans van de pups gedurende de eerste 2-3 dagen na de geboorte door de aanwezigheid van het gemicro-injecteerde DNA-construct wordt beïnvloedt. In beide groepen (zowel met een functioneel als met een niet-functioneel CRF gen construct) was het gemiddelde verlies van pups ongeveer 10%, terwijl in de groepen zonder het DNA construct, geen van de nakomelingen stierf. Hoewel de geboortegewichten niet verschilden tussen de groepen, was de toename in lichaamsgewicht van de niet-transgene pups na transgenese procedures significant hoger dan de controles. Deze muizen bleven zwaarder gedurende de hele testperiode. Geen significante verschillen zijn waargenomen in gedragsontwikkeling tussen de vier groepen dieren gedurende de periode voor het spenen. De CRF expressie gaf de verwachte morfologische ontwikkeling van Cushing s syndroom (o.a. dunner haar en haarverlies) te zien, welke veroorzaakt wordt door toegenomen corticosteron gehaltes in deze dieren. Dezelfde groepen dieren zijn ook bestudeerd in de periode na het spenen (Hoofdstuk 3). Belangrijke verschillen in gedrag, gewichtstoename en morfologie zijn gevonden tussen de transgene CRF muizen en de controle dieren. CRF muizen waren angstiger en minder actief in de verschillende gedragstesten. Bij de andere behandelingsgroepen zijn geen significante verschillen ten opzichte van de controles waargenomen. Bij post-mortem onderzoek zijn geen belangrijke afwijkingen gevonden. Uit de verkregen resultaten kan de voorlopige conclusie getrokken worden dat noch de integratie van een (niet-functioneel) DNA construct, noch de biotechnologische procedures (micro-injectie, in vitro kweek, embryo transfer) belangrijke effecten hebben op de ontwikkeling en het gedrag van muizen die de eerste 2-3 dagen na de geboorte overleven. Echter, voordat algemene conclusies kunnen worden getrokken, dienen meer transgene lijnen op een vergelijkbare manier bestudeerd te worden. Het tweede deel van het proefschrift is gericht op het bestuderen van de effecten van gene targeting op het gedrag en de fysiologische en morfologische ontwikkeling van de resulterende (chimere) muizen. Verschillende groepen muizen, welke elk een specifiek aspect van de biotechnologische procedure hebben ondergaan (electroporatie van ES-cellen, embryo kweek en/of micro-injectie van ES cellen in blastocysten) en een controle groep zijn met elkaar vergeleken. De controle muizen en alle blastocysten die zijn gebruikt waren afkomstig van dezelfde inteeltstam (C57BL/6), terwijl de ES cellen afkomstig waren van de 129/Ola stam. Net als bij de micro-injectie geïnduceerde transgenese werd gevonden dat de biotechnologische procedures de (perinatale) pup sterfte en het lichaamsgewicht verhoogden. Chimere muizen waren minder exploratief, angstiger en langzamer in hun habituatie dan de 148

andere muizen, maar dit zijn karakteristieken van de 129 stam, en zijn dus waarschijnlijk niet een gevolg van de biotechnologische procedures. Bij post-mortem onderzoek bleek dat 8% van de chimere dieren hermafrodiet was. Ook werden enkele andere pathologische verschijnselen geobserveerd. Geconcludeerd werd dat gedurende de productie van gene targeted muizen, ook de gezondheid en het welzijn van de chimere dieren zorgvuldig moet worden gemonitored. Tot slot is een scoringssysteem ontwikkeld, gebaseerd op een beperkt aantal niet-invasieve parameters (Hoofdstuk 6). De toepasbaarheid van dit scoringssysteem is getest. Vastgesteld werd dat de scoringslijsten gebruikt kunnen worden voor de bewaking van het welzijn van transgene muizen, als onderdeel van de dagelijkse verzorgingsroutine. 149