On the elucidation of a tumour suppressor role of 3p in lung cancer ter Elst, Arja IMPORTANT NOTE: You are advised to consult the publisher's version (publisher's PDF) if you wish to cite from it. Please check the document version below. Document Version Publisher's PDF, also known as Version of record Publication date: 2006 Link to publication in University of Groningen/UMCG research database Citation for published version (APA): Elst, A. T. (2006). On the elucidation of a tumour suppressor role of 3p in lung cancer s.n. Copyright Other than for strictly personal use, it is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of the author(s) and/or copyright holder(s), unless the work is under an open content license (like Creative Commons). Take-down policy If you believe that this document breaches copyright please contact us providing details, and we will remove access to the work immediately and investigate your claim. Downloaded from the University of Groningen/UMCG research database (Pure): http://www.rug.nl/research/portal. For technical reasons the number of authors shown on this cover page is limited to 10 maximum. Download date: 23-01-2017
Het ontstaan van kanker Wanneer de cel zich deelt, wordt het DNA, dat alle erfelijke informatie bevat, gekopieerd en vervolgens verdeeld over beide dochtercellen. Bij het kopiëren kunnen er fouten ontstaan, mutaties genoemd. Wanneer deze mutaties in een gen ontstaan, kan de functie van het genproduct veranderen. De chromosomen zijn in tweevoud aanwezig waardoor ook alle genen in tweevoud aanwezig zijn. Als in één van beide kopieën een mutatie ontstaat, is nog één functionerend gen aanwezig, waardoor er meestal nog voldoende genproduct wordt aangemaakt om de cel normaal te laten functioneren. Wanneer echter in beide genen een mutatie optreedt, kan het genproduct niet meer worden gemaakt en kan dit gevolgen hebben voor het functioneren van de cel. Als het desbetreffende genproduct als functie het remmen van de celdeling heeft, kan de celdeling verstoord raken, waardoor ongebreidelde celdeling plaatsvindt. Het gen dat codeert voor een dergelijk genproduct wordt een tumorsuppressor-gen genoemd. Daarnaast komen oncogenen voor die groeibevorderend werken. In tumoren zijn door genomische veranderingen of mutaties ofwel oncogenen geactiveerd, d.w.z. dat een oncogen meer product maakt dan normaal, ofwel zijn beide tumorsuppressor-genen uitgeschakeld. Dit laatste gebeurt vaak doordat één gen is uitgeschakeld door het verlies van een groot stuk chromosoom, een deletie genoemd. Het andere gen wordt dan vaak uitgeschakeld door een mutatie in het gen zelf, maar ook dat kan gebeuren door een deletie. Wanneer op beide chromosomen een groot stuk van hetzelfde gebied weg is, spreekt men van een homozygote deletie. Genen in deze gebieden zijn per definitie compleet uitgeschakeld. Deze homozygote deleties zijn vaak kleiner dan gebieden die op één van beide chromosomen gedeleteerd zijn. In de gebieden die homozygoot gedeleteerd raken wordt vaak verondersteld dat er tumorsuppressorgenen liggen. Het onderzoek Hoewel voor een aantal typen kankers tumorsuppressor-genen bekend zijn, is het tumorsuppressor-gen dat verantwoordelijk is voor het ontstaan van longkanker nog niet ontdekt. Het eerste hoofdstuk beschrijft wat de literatuur hierover vermeldt. Beschreven wordt dat in longkanker tumoren vaak een gedeelte van de korte arm van één van de chromosomen 3 gedeleteerd is. Er worden zeven van dergelijke 137
gebieden beschreven die niet met elkaar overlappen, te weten de 3p22 AP20 regio, de 3p21.3 CER1 en CER2 regio s, de 3p21 D3F15S2 regio, de 3p21.3 LUCA regio, de 3p14 FHIT regio en de 3p12 ROBO1 regio. Voor geen van de genen in al deze gebieden is echter overtuigend bewijs gevonden voor een tumorsuppressor rol in longkanker. In dit onderzoek is met behulp van functionele testen in muizen meer specifiek gekeken naar de rol van de 3p21.3 LUCA regio. Hiervoor is het gebied overdekt met grote, elkaar overlappende fragmenten DNA die in bacteriën worden gekweekt (PACs). In hoofdstuk 2 worden deze PACs ingebracht in een longkankercellijn, GLC45. De PACs blijken vervolgens te integreren in de chromosomen van de cellijn. Klonen van deze cellijn waarin een PAC geïntegreerd is, zijn onderhuids ingespoten in naakte muizen waarin ze tumoren vormen. De tumorgroei van de klonen is vergeleken met de tumorgroei van de ouderlijke cellijn, GLC45. Tumoren die ontstonden uit twee klonen met elk één en dezelfde PAC (PAC 185A4) bleven na inspuiten in naakte muizen significant kleiner dan de tumoren ontstaan uit de ouderlijke cellijn. De genen CYB561D2 en PL6 of regulatoire volgorden op de PAC zouden verantwoordelijk kunnen zijn voor de geremde tumorgroei. Dit biedt echter geen verklaring voor de eveneens gevonden verminderde tumorgroei van één van de klonen waarin alleen de lege PAC-vector geïntegreerd was. In alle klonen werd evenwel na het inbrengen van de PAC in de cel en het integreren van de PAC in het chromosoom een sterke toename van chromosomale veranderingen gezien ten opzichte van de ouderlijke cellijn. Gedeelten van chromosomen bleken in klonen of gedeleteerd of gedupliceerd ten opzichte van de ouderlijke cellijn. Hierdoor kan de verminderde tumorgroei zowel veroorzaakt worden door nieuw ingebrachte genen of regulatoire volgorden als door de opgetreden instabiliteit. In hoofdstuk 3 wordt de consequentie voor mrna productie geëvalueerd na introductie van PAC 185A4 in the longkankercellijn, GLC45. Hiervoor werd een analyse toegepast waarbij in één keer mrnas van ongeveer 21.000 genen gescreend kunnen worden. De hoeveelheid mrna per gen in beide klonen van de longkankercellijn met PAC 185A4 werd vergeleken met de hoeveelheid mrna per gen in de ouderlijke longkankercellijn. Met behulp van een significantie analyse werden die genen opgezocht waarvan ten opzichte van de ouderlijke cellijn significant meer of minder mrna in de afzonderlijke klonen aanwezig was. Maar een klein percentage van de genen kwam voor in beide genen-lijsten. Dit kon verklaard 138
worden door de sterke correlatie die werd gevonden tussen de eerder gevonden deleties en duplicaties op chromosoom niveau en de hogere en lagere mrna hoeveelheden op gen niveau. Waar in de kloon ten opzichte van de ouderlijke cellijn een deletie op chromosoom niveau werd gevonden was de mrna hoeveelheid voor de genen in dat gebied over het algemeen verlaagd. Voor een duplicatie was de mrna hoeveelheid over het algemeen verhoogd. Een opmerkelijke bevinding was het feit dat de mrna hoeveelheid van twee genen, TUSC4 en CACNA2D2, afkomstig uit de gebieden die het gebied in PAC 185A4 flankeren, in de klonen verhoogd was ten opzichte van de ouderlijke cellijn. Het lijkt of deze genen aangestuurd worden door volgorden aanwezig op PAC 185A4. Doordat integratie van PAC 185A4 niet op chromosoom 3, maar op andere chromosomen gebeurde, worden deze genen kennelijk op afstand gereguleerd door volgorden op PAC 185A4. In hoofdstuk 4 wordt een homozygote deletie beschreven in de kleincellige longkanker cellijn GLC20. De homozygote deletie is gevonden in de 3p12 band, dus naast de homozygote deletie die in die cellijn gevonden is in de 3p21.3 LUCA regio. De grootte van de deletie werd met behulp van fiber-fish technieken bepaald op 110 kb -130 kb. Een klein gedeelte van het gen ROBO1 blijkt gedeleteerd. In de nietcoderende volgorden van ROBO1 werden twee nieuwe RNA s gevonden. Deze RNA s die niet voor eiwitten coderen, worden niet-coderende RNA s genoemd. Ze kunnen betrokken zijn bij de uitschakeling van andere genen. In deze RNA s werden mogelijk ook gebieden gevonden waar kleine niet-coderende RNA s (mirna s) aanhechten die de eerst genoemde RNA s remmen of afbreken. Volgorden van een dergelijke kleine niet-coderende RNA werd tevens gevonden in het gebied dat homozygoot gedeleteerd is. Hoewel het tumorsuppressor-gen verantwoordelijk voor het ontstaan van longkanker nog niet gevonden is, verschaffen de resultaten van dit onderzoek aanwijzingen dat het LUCA gebied is ingeperkt naar twee mogelijke tumorsuppressor-genen dan wel regulatoire volgorden in een gebied van ongeveer 100 kb. Doordat de instabiliteit in alle klonen verschillend is, zou met het testen van meer klonen waarin PAC 185A4 is geïntegreerd in naakte muizen en d.m.v. mrna analyses, een duidelijker onderscheid gemaakt kunnen worden tussen wat het effect van het inbrengen van nieuwe DNA volgorden is en wat het gevolg is van toegenomen chromosomale instabiliteit. 139