Multidrug resistance in Lactococcus lactis Bolhuis, Hendrik IMPORTANT NOTE: You are advised to consult the publisher's version (publisher's PDF) if you wish to cite from it. Please check the document version below. Document Version Publisher's PDF, also known as Version of record Publication date: 1996 Link to publication in University of Groningen/UMCG research database Citation for published version (APA): Bolhuis, H. (1996). Multidrug resistance in Lactococcus lactis s.n. Copyright Other than for strictly personal use, it is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of the author(s) and/or copyright holder(s), unless the work is under an open content license (like Creative Commons). Take-down policy If you believe that this document breaches copyright please contact us providing details, and we will remove access to the work immediately and investigate your claim. Downloaded from the University of Groningen/UMCG research database (Pure): http://www.rug.nl/research/portal. For technical reasons the number of authors shown on this cover page is limited to 10 maximum. Download date: 06-01-2017
DRUG RESISTENTIE IN BACTERIËN. SAMENVATTING Steeds vaker wordt door de media in binnen- en buitenland gesproken over de gevaren van resistente micro-organismen, welke niet of nauwelijks kunnen worden bestreden met de ons bekende antibiotica. Resistentie in ziekteverwekkende microorganismen kan dramatische gevolgen hebben, met name in door ondervoeding en slechte hygiëne geteisterde gebieden. Daarnaast lopen vooral personen met een verzwakt afweer systeem gevaar, zoals AIDS patiënten en patiënten die een zware operatieve ingreep hebben ondergaan. In Nederland moest zelfs enige malen worden overgegaan tot het sluiten van ziekenhuisafdelingen waar deze resistente bacteriën waren aangetroffen. Ondanks een groot scala aan recent ontwikkelde antibiotica hebben veel microorganismen verschillende strategieën ontwikkeld om bepaalde typen antibiotica onschadelijk te maken, bijvoorbeeld door afbraak of modificatie van het antibioticum door specifieke enzymen of door veranderingen aan te brengen in die cel-componenten waar het antibioticum op aangrijpt. Een ander resistentie mechanisme, dat pas in het afgelopen decennium aandacht heeft gekregen, wordt veroorzaakt door zogenaamde transporteiwitten die zich in de celmembraan bevinden. De celmembraan is een dun vliesje dat elke levende cel omsluit en waarin onder andere transport eiwitten zijn gelegen. Deze transporteiwitten verwijderen de antibiotica uit de cel voordat deze hun vernietigende werking kunnen uitoefenen. 127
Samenvatting Multidrugresistentie. Door het gebruik van antibiotica in verschillende combinaties en toedienings schema s leek de bestrijding van ziekteverwekkende micro-organismen lange tijd succesvol te verlopen. In de afgelopen jaren zijn er echter meer en meer micro-organismen opgedoken die niet alleen resistent zijn tegen één type antibioticum, maar ook tegen een scala aan andere typen, niet-gerelateerde verbindingen. Het gevolg van dit fenomeen, dat wordt aangeduid als multidrugresistentie (MDR), is dat schadelijke organismen niet of nauwelijks meer kunnen worden bestreden. Verrassend genoeg speelt multidrugresistentie niet alleen een rol bij resistentie van micro-organismen maar ook bij aanpassingen in hogere organismen zoals ongeveer twintig jaar geleden bekend werd bij de behandeling van tumoren in zoogdiercellen. Multidrugresistentie wordt door velen beschouwd als de hoofdoorzaak van falende chemotherapie bij behandeling van kankercellen en is, samen met resistentie van bacteriën en andere organismen zoals de malaria parasiet Plasmodium, verantwoordelijk voor vele duizenden doden per jaar. In veel van deze gevallen bleek de verwijdering van de verschillende toxische stoffen uit de cel door transporteiwitten de hoofdoorzaak te zijn van multidrugresistentie. Begin jaren tachtig werd ontdekt dat slechts één membraangebonden transporteiwit (P-glycoproteine) verantwoordelijk kan zijn voor multidrugresistentie in kankercellen. Dit is verrassend omdat de meeste enzymen, waaronder transporteiwitten, een specifieke interactie aangaan met één of enkele nauwverwante substraten. Daarentegen blijken MDR transporteiwitten in staat te zijn diverse, totaal verschillende substraten te herkennen en over de membraan naar buiten te transporteren. Recentelijk zijn in bacteriën en andere micro-organismen vergelijkbare transporteiwitten aangetoond die multidrugresistentie kunnen veroorzaken en die identieke toxische stoffen (waaronder verscheidene bekende chemotherapeutica) kunnen uitscheiden (zie Hoofdstuk I). Kennis omtrent het werkingsmechanisme van deze MDR transporteiwitten is van belang om nieuwe antibiotica of chemotherapeutica te ontwikkelen of om andere strategieën te volgen in de bestrijding van tumoren of bacteriële en parasitaire infecties. 128
Drug resistentie in bacteriën Multidrugresistentie in Lactococcus lactis. Dit proefschrift beschrijft multidrugresistentie in de melkzuurbacterie Lactococcus lactis, een organisme dat vooral bekend is om zijn wereldwijde toepassing in de melkverwerkende industrie. Dit organisme is niet ziekteverwekkend en vormt op grond van de beschikbare genetische, fysiologische en biochemische kennis een ideaal modelsysteem voor de bestudering van multidrugresistentie. Multidrugresistente mutanten van L. lactis zijn op vrij eenvoudige wijze te isoleren door ze te kweken in aanwezigheid van toenemende concentraties van een toxische stof (zie Hoofdstuk II). Mutanten werden geselecteerd die resistent zijn tegen ethidium bromide, daunomicine en rhodamine 6G. Dit zijn allen positief-geladen substraten die ook door het menselijk MDR transporteiwit P-glycoproteine worden uitgescheiden. De verkregen mutanten bleken naast resistentie tegen de gebruikte toxische verbinding ook resistent te zijn tegen andere, niet gerelateerde toxische verbindingen. Vandaar dat ze geklassificeerd kunnen worden als multidrugresistent. Lactococcus lactis bezit verschillende MDR transporteiwitten. Aan de hand van experimenten, waarbij gekeken is naar transport van toxische verbinding over de membraan, kon worden vastgesteld dat net als in tumorcellen, multidrugresistentie in L. lactis wordt veroorzaakt door specifieke transporteiwitten. Doordat bij dit proces een concentratieverschil wordt aangelegd, met buiten de cel een hogere concentratie van de toxische verbindingen dan binnen de cel, zullen deze verbindingen de neiging hebben om de cel weer binnen te gaan. Om toch een concentratieverschil in stand te kunnen houden moet er energie worden geïnvesteerd. In lactococcen wordt de daarvoor vereiste energie hoofdzakelijk gehaald uit de afbraak van suikers zoals glucose en lactose. In dit omzettingsproces worden andere energie-rijke verbindingen zoals ATP gevormd, wat gebruikt kan worden om verschillende (transport-) processen te drijven. Daarnaast worden er door lactococcen protonen (H + ) uitgescheiden waardoor er een electrochemische gradient van protonen wordt gevormd. Doordat ook deze protonen weer naar binnen willen ontstaat er een potentiële kracht, de protonendrijvende kracht, die door bepaalde transporteiwitten gebruikt kan worden om substraattransport over de membraan te drijven. In hoofdstuk II wordt aangetoond dat beide energievormen drug transport in L. lactis kan drijven, wat er op wijst dat tenminste twee verschillende transporteiwitten verantwoordelijk zijn voor het multidrug-resistentie fenotype. Van bacteriële MDR transporteiwitten, die afhankelijk zijn van de protonendrijvende kracht, zijn meerdere voorbeelden bekend. Het ATP-afhankelijke MDR transportsysteem is daarentegen uniek en nog niet eerder beschreven voor bacteriën. De aanwezigheid van twee verschillende MDR transporteiwitten, LmrP en LmrA genaamd, kon 129
Samenvatting worden bevestigd door analyse van het chromosomale DNA van L. lactis waarop de genetische informatie voor de eiwitten is vastgelegd (Hoofdstuk III en V). LmrP staat voor Lactococcus MultidrugResistentie, waarbij de P verwijst naar de betrokkenheid van de Protonendrijvende kracht als energieleverancier voor de transportreactie. Analoog hieraan werd het ATP-afhankelijke transportsysteem, LmrA genoemd. Vergelijking van de aminozuurvolgorde van deze eiwitten met al bekende MDR transporteiwitten leert ons dat LmrP overeenkomt met een drietal bacteriële MDR transporteiwitten. De aminozuurvolgorde van LmrA daarentegen vertoont een grote overeenkomst met het menselijk MDR transporteiwit P-glycoproteine. Hiermee is LmrA het eerste en tot op heden enige bacteriële MDR transporteiwit dat zowel in structuur als functie vergelijkbaar is met het menselijk MDR systeem. Dit biedt de mogelijkheid om LmrA te gebruiken als modelsysteem voor de bestudering van multidrugresistentie in zowel kankercellen als bacteriën. Het transportmechanisme. Zoals vermeld is de eigenschap van LmrP en LmrA om meerdere, totaal verschillende substraten te kunnen transporteren hoogst ongebruikelijk. De enige gemeenschappelijke eigenschappen van de MDR substraten die konden worden gevonden betreffen een positieve lading en een hydrofoob (waterafstotend) karakter. Dit laatste betekent dat deze verbindingen een watervrijmilieu prefereren boven een waterbevattende omgeving. Het belangrijkste watervrije compartiment in levende cellen is de al eerder genoemde celmembraan. Het gangbare idee omtrent substraattransport over de membraan is dat het substraat wordt gebonden door het transporteiwit in de waterfase en vervolgens over de membraan naar de andere zijde wordt getransporteerd. In de hoofdstukken IV en VI wordt echter aangetoond dat beide lactococcus MDR transporteiwitten de toxische verbindingen niet vanuit de waterfase, maar direct vanuit de binnenste helft van de celmembraan, naar buiten transporteren. Mogelijkerwijs geldt dit mechanisme ook voor andere MDR transporteiwitten waaronder die welke verantwoordelijk zijn voor multidrugresistentie in kankercellen. Dit resultaat geeft aan dat bij de ontwikkeling van nieuwe antibiotica of chemotherapeutica onder andere gelet moet worden op de oplosbaarheid van deze stoffen in de celmembraan. De natuurlijke functie van MDR transporteiwitten. 130
Drug resistentie in bacteriën De belangrijkste functie van de celmembraan is het vormen van een scheiding tussen het interne celcompartiment, het cytoplasma, en het milieu waardoor waardevolle voedingsstoffen in de cel blijven terwijl schadelijke stoffen zoveel mogelijk buiten worden gehouden. Als gevolg hiervan kunnen ook belangrijke biologische parameters zoals zoutconcentraties en de zuurgraad van het cytoplasma constant worden gehouden. Daarnaast vormt de celmembraan een matrix voor specifieke membraaneiwitten die betrokken zijn bij de opname van essentiële voedingsstoffen en bij de uitscheiding van afvalprodukten. Hydrofobe toxische verbindingen komen in de vrije natuur maar ook in het menselijk lichaam veelvuldig en in grote verscheidenheid voor en deze verbindingen kunnen de functie van de celmembraan negatief beïnvloeden. Een belangrijke functie van MDR transporteiwitten lijkt dan ook gelegen in het verwijderen van hydrofobe stoffen uit de membraan, waardoor de biologische functie van de celmembraan optimaal gehandhaafdt blijft. Deze essentiële functie is waarschijnlijk ook één van de belangrijkste redenen dat MDR transporteiwitten in bijna elk levend organisme of celtype worden aangetroffen. Ondanks het feit dat MDR transporteiwitten een nadelig effect kunnen hebben bij de bestrijding van tumoren en bacteriële infecties moet niet worden vergeten dat deze eiwitten essentieel zijn voor de levensvatbaarheid van de betreffende cellen. 131