Voor het volgende onderzoek wordt een vergunning aangevraagd:

Utrecht, 27 februari 2002 ADVIES COMMISSIE BIOTECHNOLOGIE BIJ DIEREN Naar aanleiding van het verzoek om advies van de Minister van Landbouw, Natuurbeheer en Visserij betreffende de vergunningsaanvraag met kenmerk BD 01.363 (E05) van de Universiteit Utrecht te Utrecht omschreven als Het ontwikkelen van immunotherapie via Fc receptoren kan de Commissie biotechnologie bij dieren (verder de Commissie) het volgende mededelen. De Commissie heeft geconstateerd dat de aanvraag betrekking heeft op onderzoek waarbij biotechnologische handelingen bij dieren worden uitgevoerd. Nadat deze aanvraag door de Commissie in behandeling is genomen, heeft zij de aanvrager een aantal vragen gesteld om nadere toelichting te verschaffen. Deze vragen zijn vervolgens door hem beantwoord, waarop de Commissie de aanvraag opnieuw ter advisering in bespreking heeft genomen. Het advies van de Commissie valt uiteen in twee delen; deel I beschrijft het onderzoek waarvoor een aanvraag is ingediend, deel II geeft de overwegingen weer van de Commissie die hebben geleid tot onderstaand advies. Deel I. Voor het volgende onderzoek wordt een vergunning aangevraagd: - het doel van het onderzoek is het ontwikkelen van een immunotherapie via Fc receptoren. Deze Fc receptoren zitten aan de buitenkant van bepaalde cellen van het afweersysteem; - bij dat onderzoek worden biotechnologische handelingen bij dieren toegepast te weten: a. injectie van recombinant embryonale stamcellen waarin een genmutatie is aangebracht in blastocysten, b. het injecteren van DNA in de kern van een bevruchte eicel (zygote); - daarbij wordt gebruik gemaakt van de volgende genconstructen:!" het NOTAM genconstruct dat een rol speelt bij de signalering middels het ITAM domein,!" het CD66a genconstruct;!" tevens zal gebruik gemaakt worden van genconstructen uit het moleculaire 1

standaardinstrumentarium (zie bijlage 1); - als te verwachten effect van het onderzoek wordt door de aanvrager aangegeven dat de meeste gemodificeerde dieren zich normaal zullen ontwikkelen. Het is echter mogelijk dat de voorgestelde genetische modificaties leiden tot bepaalde stoornissen; - bij dit onderzoek zullen de volgende aantallen dieren nodig zijn:!" voor het maken van de transgene en de knock-out muizen zullen per construct gemiddeld 150 dieren nodig zijn. Op jaarbasis zullen maximaal 7 lijnen gegenereerd worden; - de dieren zullen na afloop van het onderzoek worden gedood, behoudens lijnen die waardevol zijn. Deze zullen behouden blijven door middel van cryopreservatie. Dieren zullen onder voorwaarden ter beschikking worden gesteld aan andere onderzoekers; - de biotechnologische handelingen zullen worden uitgevoerd gedurende 5 jaar. Deel II. Bij het onderzoek waarvoor een vergunning is aangevraagd wordt gebruik gemaakt van twee onderscheiden technieken om dieren genetisch te modificeren. Deze twee technieken, injectie van gemodificeerde ES-cellen in blastocysten en micro-injectie van DNA-constructen in bevruchte eicellen, acht de Commissie in moreel opzicht vergelijkbaar. Zowel wat betreft de kans dat de modificatie slaagt, als wat betreft de mogelijke uitwerking op de te genereren dieren, verschillen zij niet van elkaar. Bovendien wordt op het niveau van het DNA in de cel dezelfde handeling gepleegd, namelijk het inbrengen van een genconstruct in het genoom van de dieren. Hoewel deze handelingen verschillende effecten hebben, namelijk enerzijds het uitschakelen van de functie van een bestaand gen en anderzijds het inbrengen van een nieuw gen met een nieuwe functie, acht de Commissie deze handelingen voldoende vergelijkbaar om deze aanvraag als één vergunningaanvraag te behandelen. De gezondheid en het welzijn van de dieren worden door deze technieken potentieel op dezelfde manier beïnvloed, ook al kan de schade daaraan per gegenereerde muizenlijn verschillen. Indien er een goede reden zou zijn om verschillende verwachtingen te hebben omtrent de gezondheids- en welzijnseffecten van de verschillende technieken dan zou dat een reden zijn waarom de technieken niet vergelijkbaar zouden zijn. Die reden is er echter niet, de verwachtingen omtrent genoemde effecten zijn hetzelfde. Daarom kunnen deze handelingen ook in dit geval als een toetsbare eenheid beschouwd worden, temeer daar de ethische aspecten a priori dezelfde lijken te zijn. Bij de beoordeling van de vergunningaanvraag wordt door de Commissie beoordeeld of: 1. de handelingen onaanvaardbare gevolgen hebben voor de gezondheid en het welzijn van dieren, 2. tegen de handelingen ethische bezwaren bestaan (GWWD art. 66 lid 3). De Commissie heeft de volgende overwegingen: 2

1. Met betrekking tot de doelstelling De hoofddoelstelling is het verwerven van kennis omtrent de werking van het afweersysteem van zoogdieren. Het gaat daarbij vooral om de moleculair-genetische processen die daaraan ten grondslag liggen. Het is het afweersysteem dat er onder meer voor moet zorgen dat ziektekiemen als bijvoorbeeld bacteriën en virussen onschadelijk gemaakt en verwijderd worden. Een dergelijk proces wordt in gang gezet nadat herkenning van de ziektekiemen heeft plaatsgevonden. Bij die herkenning spelen FC-receptoren, die aan de buitenkant van bepaalde afweercellen zitten, een belangrijke rol. Een zelfde soort herkenning speelt een rol bij gevormde kankercellen. Het onderzoek richt zich op een manipulatie van de Fc-receptoren zodat deze een verbeterde immuunrespons op gang brengen waardoor een verbeterde afweer tegen bepaalde ziektekiemen dan wel een verbeterde antitumor werking ontstaat. Het onderzoek is wetenschappelijk van belang omdat een beter inzicht kan worden verkregen omtrent een specifiek onderdeel van het ingewikkelde systeem dat de immunologische afweer is. Kennis die met het onderzoek wordt verkregen zou kunnen leiden tot een verbetering van therapieën tegen infectieziekten of kanker. Ook zouden de genetische gemodificeerde muizen gebruikt kunnen worden om nieuwe medicijnen tegen infectieziekten of kanker te testen op hun werkzaamheid. Dat maakt het onderzoek maatschappelijk van belang, omdat infectieziekten en kanker een belangrijke bron van menselijk leed zijn in de wereld. Zo worden door het massaal toepassen van met name antibiotica ter voorkoming of ter behandeling van infectieziekten bepaalde ziektekiemen steeds meer resistent tegen de werking van die antibiotica. Onderzoek naar nieuwe soorten medicijnen blijft derhalve dringend nodig. In dit onderzoek wordt onder andere gebruik gemaakt van zogenaamde knock-out dieren met als hypothese dat dit bepaalde fenotypische veranderingen teweeg zal brengen. Uit eerder onderzoek met knock-out dieren is gebleken dat deze vooral kunnen bijdragen aan de vermeerdering van kennis over de rol van een genproduct, wanneer de dieren nauwkeurig worden onderzocht. Door zorgvuldig vervolgonderzoek ontdekt men namelijk nogal eens fenotypische afwijkingen die men vooraf niet verwacht had. Om de kans dat het onderhavige onderzoek resultaat op kan leveren te optimaliseren, meent de Commissie dat voldaan moet worden aan een aantal zorgvuldigheidseisen. Daaraan is naar de mening van de Commissie voldaan. De aanvrager heeft voor goede onderzoekscondities gezorgd. Binnen het Gemeenschappelijke dierenlaboratorium van de Universiteit Utrecht zijn alle voorzieningen aanwezig om de dieren adequaat te onderzoeken. 2. Met betrekking tot de beschikbaarheid van reële alternatieven Voor een nadere bepaling van de rol van de te bestuderen genproducten in de afweer van het zoogdierlichaam is onderzoek buiten een intact biologisch systeem slechts van beperkte waarde. Onderzoek in cellijnen zal slechts informatie op kunnen leveren over de eigenschappen van moleculen die een rol spelen in de afweer. De processen die bestudeerd worden, zijn echter sterk afhankelijk van de interacties die zich in het gehele immuunsysteem van het lichaam afspelen. Daarvoor is een intact biologisch systeem nodig waarin het resultaat van een mutatie of deletie van een gen geobserveerd kan worden. Muizen waarin het gen gemuteerd of geïnactiveerd is vormen een dergelijk systeem, en het valt te verwachten dat daaruit andere en relevantere informatie naar voren komt. 3

Onderzoek aan minder complexe diersoorten vormt ook geen alternatief omdat in deze diersoorten het afweersysteem op een andere manier is georganiseerd en te weinig vergelijkbaar is met het afweersysteem van de mens. Muizen zijn als diermodel voor dit soort genetisch onderzoek een geschikte kandidaat gebleken 1. Onderzoek bij niet-genetisch gemodificeerde muizen is niet mogelijk, omdat er geen muizenstammen bekend zijn met de gewenste mutaties in de voor dit onderzoek relevante genen. Gelet op de doelstelling van de biotechnologische handelingen zijn er, in het licht van de stand van het wetenschappelijk en technologisch onderzoek, naar de mening van de Commissie op dit moment geen reële alternatieven beschikbaar. De Commissie wenst echter wel op te merken dat de aanvrager nauwlettend in de gaten dient te houden of, op het ogenblik dat de biotechnologische handelingen uitgevoerd gaan worden om een bepaalde muizenlijn te maken, een dergelijke muizenlijn elders al niet aanwezig en beschikbaar is. Indien elders een relevante muizenlijn beschikbaar is, dan is de Commissie van mening dat er een reëel alternatief bestaat en dient de aanvrager de houder van die muizenlijn te verzoeken om daarvan gebruik te mogen maken. Indien de muizenlijn beschikbaar is, mag deze niet meer in het kader van deze aanvraag gegenereerd worden. De Commissie wenst daarmee aan te geven dat doublures in de biotechnologische handelingen bij dieren zoveel mogelijk voorkomen dienen te worden. De aanvrager geeft aan zich van deze bepaling bewust te zijn en heeft een onderzoeksgroep in de Verenigde Staten verzocht een relevante knock-out muizenlijn beschikbaar te stellen. 3. Met betrekking tot de schade aan de gezondheid en het welzijn van de dieren De schade aan de gezondheid en het welzijn van de dieren is niet precies te voorspellen. Sommige lijnen zullen mogelijk gevoeliger blijken voor infecties. Deze lijnen zullen zonodig onder SPF omstandigheden worden gehuisvest. Dat is een vorm van huisvesting waarin het voorkomen van bepaalde ziektekiemen is uitgesloten. De aanvrager verwacht op basis van het fenotype van dieren waarbij vergelijkbare genen waren uitgeschakeld, dat bij de genetische gemodificeerde muizen geen ernstige aantastingen van gezondheid en welzijn zullen optreden. Onvoorspelbaar is echter of er onbedoelde nadelige gevolgen zullen optreden. Naar de mening van de Commissie valt niet geheel uit te sluiten dat toch ernstig ongerief kan ontstaan (met name als het gaat om het genereren van knock-out muizen). De Commissie wenst hierover op te merken dat indien als gevolg van de biotechnologische handelingen, voorzien of onvoorzien, ernstig ongerief optreedt de dieren onverwijld dienen te worden gedood, zodat de schade aan de gezondheid en het welzijn van de dieren van korte duur zal zijn. Om de schade aan de gezondheid en het welzijn, die bij dit onderzoek eventueel optreedt, vast te kunnen stellen, meent de Commissie dat door de onderzoekers een welzijnsdagboek conform het gestelde in de Code of Practice welzijnsbewaking van proefdieren van de Keuringsdienst van Waren dient te worden bijgehouden waarin het verloop van het welzijn alsmede de genomen maatregelen en uitgevoerde ingrepen worden vastgelegd. 1 Mary A. Bedell, Nancy A. Jenkins and Neal G. Copeland, Mouse models of human disease. Part I and Part II, Genes and Development 11, 1997 pag. 1-43. 4

4. Met betrekking tot de mate van aantasting van de integriteit van de dieren In het Nee, tenzij beleid ten aanzien van biotechnologie bij dieren zijn biotechnologische handelingen bij dieren niet alleen problematisch vanwege de mogelijke effecten op de gezondheid en welzijn van de dieren, maar ook omdat door middel van het veranderen van genetisch materiaal de eigenheid van het dier door de mens wordt veranderd. Door het genetisch modificeren van dieren, zoals hier wordt bedoeld, worden hun eigenschappen doelbewust en gericht gewijzigd ten nutte van de mens. Deze genetische modificaties worden omschreven als een aantasting van de genotypische integriteit van het dier. Daarbij gaat het om andere zaken dan die bij de beoordeling van de aantasting van gezondheid en welzijn een rol spelen. In dit onderzoek worden aan het genoom van de muis DNA-constructen toegevoegd. Hierdoor zal de genotypische integriteit van het dier aangetast worden. Om vervolgens de mate van aantasting van de integriteit te beoordelen let de Commissie vooral op de veranderingen in fenotypische kenmerken zoals het gedrag, het uiterlijk, de mate van zelfredzaamheid, de fenotypische identiteit en de (toegenomen) bevattelijkheid voor ziekte(n) van het dier. Als gevolg van de biotechnologische handelingen zal naar verwachting bij een aantal muizen een verhoogde bevattelijkheid voor infectieziekten ontstaan. Deze dieren zullen wellicht onder SPF omstandigheden worden gehuisvest. De Commissie meent dat in een dergelijk geval de integriteit van de muizen is aangetast. Daarnaast kan worden gebruik gemaakt van conditionele genetische modificaties in de muizen waardoor als het ware een in de tijd te manipuleren negatieve eigenschap bij de muis tot expressie kan worden gebracht. Dat betekent dat de zelfredzaamheid van de dieren, waarbij die negatieve eigenschap niet tot expressie is gebracht, niet aangetast zal zijn. Het feit echter dat die kans (op het zich ontwikkelen van een negatieve eigenschap) bij de gemodificeerde muizen is ingebouwd, beschouwt de Commissie als een aantasting van de fenotypische integriteit van de dieren. Bij een aantal muizen zal dus naast de genotypische integriteit ook de fenotypische integriteit aangetast zijn. 5. Met betrekking tot de aanvaardbaarheid van de biotechnologische handelingen Samengevat meent de Commissie dat de aanvraag een onderzoek betreft dat wetenschappelijk van belang is omdat het mogelijk inzicht oplevert in de rol die bepaalde genproducten spelen in de afweer tegen infectieziekten en kanker. Het onderzoek is mogelijk ook maatschappelijk van belang omdat op grond van die inzichten therapieën tegen die infectieziekten dan wel kanker mogelijk ontwikkeld dan wel gevalideerd kunnen worden. Naar de mening van de Commissie is er een substantieel doel gediend met het onderzoek. Verder stelt de Commissie vast dat het onderzoek mede wordt gefinancierd door het Nationaal Reumafonds, de Nederlandse Kankerbestrijding (KWF), het Prinses Beatrixfonds en NWO. Deze organisaties maken bij het toekennen van subsidies en financiering voor onderzoek gebruik van onafhankelijke vakgenoten die het onderzoek beoordelen. Voor de Commissie is dat een reden om aan te nemen dat het onderzoek wetenschappelijk van belang, van goede kwaliteit en haalbaar is. Op grond van al hetgeen hiervoor gesteld is de Commissie van mening dat het hier gaat om onderzoek met een dusdanig substantieel belang dat het verbod op het verrichten van 5

biotechnologische handelingen, zoals dat is omschreven in de Gezondheids- en welzijnswet voor dieren, voor dit specifieke onderzoek kan worden opgeheven. De Commissie heeft vervolgens nagegaan of er reële alternatieven voor dit onderzoek bestaan. Ze heeft geconstateerd dat dat niet het geval is. De werkingsmechanismen van bepaalde genproducten binnen het afweersysteem van het lichaam kan slechts in een geheel (intact) dier bestudeerd worden. De vraag naar het bestaan van eventuele alternatieven maakt onderdeel uit van de ethische toets die de Commissie op grond van de wet dient uit te voeren. Omdat naar de mening van de Commissie zulke alternatieven niet bestaan, kan de opheffing van het verbod gehandhaafd blijven. Er bestaat een kans dat de gemodificeerde dieren schade aan gezondheid en welzijn zullen ondervinden. Die eventuele gevolgen voor gezondheid en welzijn acht de Commissie onvermijdelijk en inherent aan het onderzoek. Ze meent dat deze schade, gelet op het belang van de doelstelling, niet onaanvaardbaar is, mits de onderzoekers de muizen intensief observeren en, in het geval ernstig ongerief optreedt, doden. De Commissie heeft aangegeven dat door de biotechnologische handeling de genotypische integriteit en mogelijk ook de fenotypische integriteit aangetast zal worden. Gelet op het feit dat in de samenleving reële zorgen bestaan omtrent biotechnologische handelingen die bij dieren worden uitgevoerd - zorgen die voor een deel berusten op ethische overwegingen en die hebben geleid tot wettelijke maatregelen op dit punt - constateert de Commissie dat er, in verband met biotechnologische handelingen bij dieren, altijd ethische bezwaren aangevoerd kunnen worden. Waar het naar de mening van de Commissie echter om gaat is of deze ethische bezwaren doorslaggevend zijn, met andere woorden zo zwaarwegend zijn dat ze van groter gewicht zijn dan de positieve resultaten in termen van een verbeterd inzicht in en mogelijkheden voor het behandelen van infectieziekten dan wel verbeterde mogelijkheden voor de ontwikkeling van medicijnen. De Commissie meent dat het criterium genoemd in artikel 66, lid 3 onder b van de Gezondheids- en welzijnswet voor dieren aldus dient te worden uitgelegd. Op grond van het voorgaande komt de Commissie tot de conclusie dat de gezondheid en het welzijn van de dieren kan worden aangetast en dat er in termen van de aantasting van de integriteit van dieren ethische bezwaren naar voren gebracht kunnen worden, maar dat deze beide overwegingen met betrekking tot deze vergunningaanvraag naar haar mening niet doorslaggevend zijn, en samen niet opwegen tegen het belang van het doel van het onderzoek. Dat belang is namelijk hierin gelegen dat de verworven inzichten omtrent de werking van het immuunsysteem van zoogdieren kunnen leiden tot (een begin van) een behandeling van een aantal ernstige aandoeningen van de mens. De Commissie acht derhalve de biotechnologische handelingen waarvoor vergunning is aangevraagd moreel aanvaardbaar. Aanvullend wil de Commissie nog opmerken dat de hiervoor uiteengezette afweging met betrekking tot de aanvaardbaarheid van de biotechnologische handelingen uitsluitend betrekking heeft op het onderzoek waarvoor de aanvraag is ingediend. Ze is zich echter bewust van de mogelijkheid dat de aanvragers de gegenereerde muizenlijnen voor andersoortig onderzoek beschikbaar zullen stellen aan derden. Ze heeft daar in beginsel geen bezwaar tegen, omdat op die manier voorkomen kan worden dat dezelfde muizenlijn door anderen opnieuw gegenereerd wordt. Aangezien dit andersoortige onderzoeksdoel niet door de Commissie getoetst is, acht ze het echter wel van belang om op de hoogte te worden gesteld indien de 6

gegenereerde muizenlijnen aan derden ter beschikking worden gesteld en voor welk doel dit geschiedt. De Commissie meent derhalve dat als voorwaarde in de vergunning opgenomen zou moeten worden, dat indien de gegenereerde muizenlijnen aan derden te beschikking worden gesteld, de vergunninghouder dit dient te melden. 6. Met betrekking tot de te gebruiken diersoorten Hoewel de aanvrager aangeeft voor het onderzoek muizen en ratten te zullen gaan gebruiken, heeft de Commissie in het aanvraagformulier verder geen aanwijzingen gevonden dat de aanvrager daadwerkelijk het voornemen heeft vergunningplichtige biotechnologische handelingen bij ratten te verrichten. Op grond daarvan adviseert de Commissie uitsluitend vergunning te verlenen voor het gebruik van de diersoort muis. 7

Advies van de Commissie biotechnologie bij dieren De Commissie biotechnologie bij dieren adviseert met betrekking tot de vergunningaanvraag met als kenmerk BD 01.363 (E05), zoals samengevat in deel I van dit advies, in het kader van artikel 66, lid 3 Gezondheids- en welzijnswet voor dieren, op grond van de overwegingen zoals verwoord in deel II, een vergunning te verlenen onder de volgende voorwaarden: - de dieren dienen indien ernstig ongerief ontstaat onverwijld te worden gedood; - bij de biotechnologische handelingen mogen uitsluitend genetische gemodificeerde muizen gegenereerd worden; - ten behoeve van het vaststellen van de schade aan de gezondheid en het welzijn van de dieren als gevolg van het onderzoek, dient een welzijnsdagboek conform het gestelde in de Code of Practice welzijnsbewaking proefdieren te worden bijgehouden; - indien blijkt dat er elders een muizenlijn, die de aanvrager wenst te genereren, beschikbaar is, dan mag deze muizenlijn niet meer door de aanvrager gegenereerd worden; - indien de dieren aan derden ter beschikking worden gesteld, dan dient de vergunninghouder dit te melden. De Voorzitter, De Adjunct-Secretaris, Prof. dr. E. Schroten Drs. R. Tramper 1

Bijlage 1 Genconstructen uit het moleculaire standaardinstrumentarium 1. Merkergenen - luciferase - beta-galactosidase - fluorescent proteïnen 2. Selectie-genen - antibiotica-resistentie genen - thymidine kinase - neomycine fosfotransferase - HmB fosfotransferase 3. Reporterconstructen 4. Weefselspecifieke promotoren 5. Cre/LoxP en Flp recombinase systeem 6. Intronsequenties en transcriptieterminatie sequenties zoals het bovine growth hormone (BGH) gen. 2