Samenvatting 125 Samenvatting Fotosynthese is op directe of indirecte manier het belangrijkste proces voor alle levende organismen op aarde. Het wordt uitgevoerd door een heleboel verschillende soorten van organismen die tot zowel prokaryoten als eukaryoten behoren. In al deze bacteriën, algen en planten wordt fotosynthese uitgevoerd door speciale eiwitten waaraan pigmentmoleculen gebonden zijn. Deze eiwitten zijn meestal aan speciale membranen gebonden. In hogere planten en cyanobacteriën omvat het fotosynthese-apparaat twee verschillende typen van eiwitten. Deze twee fotosystemen heten Fotosysteem I (PSI) en Fotosysteem II (PSII). In hogere planten worden de fotosynthesemembranen ook wel thylakoidmembranen genoemd. Deze zijn gelokaliseerd in een speciale organel, de chloroplast. De thylakoidmembranen zijn sterk geplooid. Ze bestaan uit gestapelde granamembranen die verbonden zijn met ongestapelde stroma membranen. Deze membranen zijn continu en omhullen het lumen, een ruimte die zuurder is dan de stroma, de ruimte aan de buitenkant van de membranen. PSI en PSII spelen beide een rol bij de omzetting van zonne-energie in chemisch gefixeerde energie. PSII benut zonne-energie voor een reactie waarbij water wordt gesplitst. PSI gebruikt de energie om een elektron te transporteren van het eiwit plastocyanine aan de binnenkant van de membraan (het lumen) naar het ferredoxine eiwit aan de andere zijde van de membraan, in het stroma. Wat de algemene opbouw betreft lijken de beide fotosystemen wel wat op elkaar. Zowel PSII als PSI bestaan uit twee componenten of domeinen: een kerncomplex en een light-harvesting antenna complex (LHC), dat we vrij kunnen vertalen als licht verzamelende antenne. Beide componenten bevatten subeenheden die chlorofyl (Chl) en caroteen pigmentmoleculen binden. Deze antennepigmenten absorberen zonlicht en dragen de excitatie-energie over aan speciale pigmentmoleculen in het reactiecentrum (RC) van het kerncomplex. Excitatie van deze speciale pigmenten kan ladingsscheiding tot gevolg hebben, wat weer kan leiden tot het vastleggen van energie in een stabielere vorm. LHC eiwitten kunnen zowel aan PSII als PSI binden en deze twee verschillende vormen worden LHCII en LHCI genoemd. De LHCII subeenheden worden gecodeerd door genen in de celkern, genaamd Lhcb1 tot Lhcb6. In de praktijk wordt de naam LHCII echter alleen voor de Lhcb1-3 subeenheden gebruikt. Deze subeenheden vormen gemengde types van trimere complexen. De drie andere subeenheden, Lhcb4 (CP29), Lhcb5 (CP26) en Lhcb6 (CP24) komen onder natuurlijke omstandigheden alleen als monomere eiwitten voor. Deze eiwitten helpen in de aanhechting van LHCII trimeren aan het PSII kerncomplex en in energieoverdracht. De verbindingen van een PSII kerncomplex met een of meer
126 Samenvatting LHCII trimeren worden supercomplexen genoemd. Uit eerder onderzoek aan spinazie bleek dat er verschillende types PSII-LHCII supercomplexen zijn. Ze bestaan allemaal uit een dimeer PSII kerncomplex, dat wordt aangeduid als 'C 2 ' en trimere LHCII complexen. De LHCII complexen kunnen op drie verschillende posities binden. De hoeveelheid gebonden trimeer verschilt per plaats en daarom worden deze posities van LHCII trimeren aangeduid als 'S', 'M' en 'L', waarin deze afkortingen staan voor sterk, middelsterk en los. Het supercomplex dat het meest voorkomt heeft twee gebonden trimeren (het C 2 S 2 supercomplex). In spinazie komen relatief ook veel PSII deeltjes voor die bestaan uit C 2 S 2 M 1 supercomplexen. Verder is gebleken dat twee van dergelijke supercomplexen op verschillende manier aan elkaar kennen hechten. Ze vormen dan megacomplexen. In hogere planten zijn er vier verschillende LHCI antenne eiwitten; dit zijn Lhca1-4. Volgens zeer recent onderzoek binden bij planten alle vier eiwitten in een enkele kopie aan het kerncomplex van PSI. Bovendien binden ze allen aan een en dezelfde kant van het kerncomplex. Groene algen, zoals Chlamydomonas reinhardtii hebben een groter aantal LHCI subeenheden, en daardoor ook grotere PSI deeltjes. Het is heel belangrijk om de structuur van de PSI en PSII kerncomplexen en de antenne-subeenheden nauwkeurig te bepalen, omdat we anders de functie van PSI en PSII niet kunnen begrijpen. Elektronenmicroscopie en losse-deeltjes beeldverwerking zijn in dit proefschrift de belangrijkste technieken geweest om structuren te bepalen. Hoofdstuk 1 geeft een algemene introductie van de structuur en functie van de fotosynthese-eiwitten en hun lokalisatie in de chloroplasten. In dit hoofdstuk worden ook theoretische aspecten van elektronenmicroscopie (EM) behandeld, alsmede hoe EM preparaten worden gemaakt en hoe de beeldverwerking verloopt. Dit hoofdstuk bevat verder een samenvatting van recente ontwikkelingen in de fotosynthese. De hoofdstukken 2, 3, 4 gaan over onderzoek naar de structuur van PSII. Ook wordt beschreven hoe PSII complexen in de thylakoidmembranen gerangschikt zijn. Dit onderzoek is uitgevoerd met chloroplasten geïsoleerd uit de Zandraket, een kleine plant met de wetenschappelijke naam Arabidopsis thaliana. In hoofdstuk 2 wordt de supermoleculaire organisatie van Fotosysteem II en de LHCII antenne uit Arabidopsis thaliana beschreven. PSII-LHCII supercomplexen en natieve membranen werden geïsoleerd en bestudeerd met elektronenmicroscopie en beeldverwerking. De PSII-LHCII supercomplexen uit Arabidopsis vertonen enkele verschillen in vergelijking met die uit spinazie. Zo blijkt dat er in Arabidopsis M-type LHCII complexen kunnen aanhechten zonder dat er S-type trimer aanwezig zijn. Er werden drie nieuwe types PSII-LHCII supercomplexen gevonden, waarin een of twee S trimeren afwezig waren. Deze deeltjes waren van
Samenvatting 127 het type C 2 SM 2, MC 2 S, of C 2 M 2. In het algemeen bleek het aantal PSII-LHCII deeltjes dat een M-type trimeer bevatte in Arabidopsis significant hoger te zijn dan in spinazie. De talrijkste PSII-LHCII supercomplexen waren de C 2 S 2 en C 2 S 2 M supercomplexen en het aantal C 2 S 2 M 2 supercomplexen was significant hoger dan bij spinazie. Dit duidt erop dat er in Arabidopsis in totaal meer antenne-eiwitten in de PSII-LHCII supercomplexen gebonden zijn. Dit werd bevestigd door een analyse van gezuiverde, min of meer natieve membranen met kristallijne domeinen van PSII supercomplexen. In deze membranen bestonden de domeinen uitsluitend uit C 2 S 2 M 2 supercomplexen, dit in tegenstelling tot spinazie waar dergelijke domeinen uit ofwel C 2 S 2 of C 2 S 2 M supercomplexen bestonden. De geïsoleerde kristallijne fragmenten in Arabidopsis waren beter geordend dan in spinazie. Daarom konden de vorm en posities van de LHCII complexen veel beter worden bepaald uit projectiemappen, die door beeldverwerking werden verkregen. Deze kristallen lieten voor de eerste keer zien dat de C 2 S 2 M 2 supercomplexen ook werkelijk in de membraan aanwezig zijn en niet alleen na zuivering. In hoofdstuk 3 worden PSII-LHCII supercomplexen beschreven die werden geïsoleerd uit een Lhcb5 (CP26) mutant. Deze analyse werd met dezelfde loss deeltjes techniek uitgevoerd in hoofdstuk 2 beschreven. De resultaten werden vergeleken met die van wild-type supercomplexen. Uit deze vergelijking was het mogelijk de plaats van het CP26 eiwit af te leiden. De positie was dicht bij het S- type LHCII trimeer. Uit een analyse van kristallijne domeinen in geïsoleerde membraanfragmenten kwam een soortgelijk resultaat. We konden ook aantonen dat bij afwezigheid van het CP26 eiwit de geïsoleerde PSII-LHCII supercomplexen geen M-type trimeren bevatten. Er werden namelijk alleen C 2 S 2 supercomplexen gevonden. In geïsoleerde membranen, die met een lagere hoeveelheid detergens kunnen worden verkregen, kwamen echter wel kleine hoeveelheden C 2 S 2 M 2 deeltjes voor in afwezigheid van het CP26 eiwit. Alle pogingen om PSII-LHCII supercomplexen en membranen te isoleren uit mutante planten zonder het CP29 eiwit zijn mislukt. Hieruit concluderen we dat in afwezigheid van het CP29 eiwit dergelijke supercomplexen niet stabiel genoeg zijn om ze te kunnen isoleren. In hoofdstuk 4 wordt een analyse beschreven van Arabidopsis planten die genetisch niet in staat zijn om de Lhcb1 and Lhcb2 eiwitten te maken, de voornaamste bouwstenen van de LHCII trimeren. De verwachting was dat LHCII trimeren zouden ontbreken vanwege het ontbreken van Lhcb1 en Lhcb2. Het bleek echter dat er desondanks PSII-LHCII supercomplexen konden worden gezuiverd. Elektronenmicroscopie en beeldverwerking lieten zien dat die in vergelijking met wild-type supercomplexen er vrijwel hetzelfde uitzagen. Western blot analyse van deze supercomplexen liet zien dat ze relatief veel CP26 eiwit bevatten. Bovendien kon ook biochemisch worden aangetoond dat CP26
128 Samenvatting trimeren kan vormen. Blijkbaar is CP26 dus in staat om het verlies van Lhcb1 en Lhcb2 te compenseren. De algemene conclusie was dat de trimeren essentieel zijn voor de macrostructuur van PSII in de membraan maar dat Lhcb1 en Lhcb2 niet uniek zijn in het maken van dergelijke trimeren. CP26 is namelijk in staat om de rol van Lhcb1 en Lhcb2 in de trimeren deels over te nemen. In hogere planten speelt de PsbS subeenheid van PSII een cruciale rol in een proces dat wordt aangeduid als non-photochemical quenching, afgekort NPQ. Hierbij wordt een overmaat aan geabsorbeerd licht omgezet en als warmte aan de omgeving afgegeven. Zonder NPQ kunnen door te veel aan licht allerlei schadelijke radicalen worden gevormd en treedt foto-inhibitie op. Omdat het PsbS eiwit foto-inhibitie tegengaat is het is uiteraard belangrijk om te weten waar het gelokaliseerd is. Dit is nog niet duidelijk, maar volgens eerdere studies zou PsbS in de PSII-LHCII supercomplexen aanwezig kunnen zijn. PsbS zou op twee verschillende plaatsen kunnen voorkomen. Ten eerste in de kerncomplexen en ten tweede in de supercomplexen, ergens tussen het kerncomplex en de LHCII trimeren, mogelijk in de buurt van het CP24 eiwit. Als dit klopt zou PsbS in ieder geval in de gestapelde grana membranen moeten zitten omdat daar de PSII-LHCII supercomplexen aanwezig zijn. Om inzicht te krijgen omtrent de plaats van PsbS hebben we met EM gezuiverde PSII megacomplexen en membranen met kristallen geanalyseerd. Deze waren afkomstig uit een Arabidopsis thaliana npq4 mutant, die niet meer in staat is om PsbS eiwitten te produceren. De resultaten staan beschreven in hoofdstuk 5. Er werd slechts één type megacomplex gevonden in de Arabidopsis thaliana npq4 mutant. Dit is opmerkelijk omdat er in spinazie drie verschillende types gevonden zijn. Maar de megacomplexen van de mutant en het wild-type zagen er desondanks hetzelfde uit. Dit geeft aan dat PsbS niet in het kerncomplex en ook niet in de perifere antenne van PSII kan zitten. Een analyse van kristallijne domeinen de npq4 mutant liet zien dat deze domeinen vrijwel identiek waren aan die van wild-type Arabidopsis planten. Uit al deze experimenten blijkt daarom dat het niet mogelijk is dat het PsbS eiwit in de PSII- LHCII supercomplexen aanwezig kan zijn. We denken daarom dat PsbS in delen van grana membranen voorkomen waarin relatief veel vrij losse LHCII complexen aanwezig zijn. De structuur van gezuiverde PSI-LHCI complexen uit de groene alg Chlamydomonas reinhardtii (C. reinhardtii) staan in hoofdstuk 6 beschreven. Uit de biochemische literatuur is bekend dat de C. reinhardtii Lhca subeenheden aminozuurvolgordes hebben die verschillend zijn van die uit hogere planten. Er lijken tenminste 9 verschillende Lhca subeenheden te zijn in C. reinhardti, in tegenstelling tot 4 in hogere planten. Kennelijk is het Lhca antennesysteem van C. reinhardtii Lhca meer variabel. Als we naar de aminozuurvolgorde kijken dan zijn
Samenvatting 129 bijna alle C. reinhardtii Lhca eiwitten voor minder dan 55% identiek aan de Lhca eiwitten uit Arabidopsis. Daarom is het niet mogelijk om de C. reinhardtii Lhca subeenheden met die van hogere planten te correleren op grond van aminozuurvolgordes. Ook uit spectroscopisch onderzoek aan de LHCI antenne van C. reinhardtii bleek dat er geen subcomplexen waren met eigenschappen die sterk lijken op die van hogere planten. Opmerkelijk genoeg bleek uit eerder onderzoek van anderen dat er 30-35 kopieën van LHCI subeenheden per kerncomplex zouden moeten zijn, in tegenstelling tot 4-5 bij hogere planten. Daarom leek het ons interessant om PSI-LHCI complexen uit C. reinhardtii te zuiveren en te analyseren en om ze met die uit spinazie te vergelijken C. reinhardtii PSI-LHCI deeltjes werden geïsoleerd, afgebeeld met EM en geanalyseerd met losse-deeltjes beeldverwerking. De resultaten laten zien dat een monomeer PSI-LHCI complex, omgeven door een laag detergens moleculen, afmetingen heeft van 21,3 bij 18,2 nanometer met in projectie een oppervlak van 299 nm². Dit is duidelijk groter dan de 227 nm 2 van het oppervlak van PSI-LHCI complexen uit spinazie. Als we aannemen dat de kerncomplexen van cyanobacteriën en groene algen dezelfde organisatie hebben en dus dezelfde afmetingen hebben (oppervlak van ca 90 nm 2 ) en dat de detergenslaag ca 30 nm 2 inneemt, blijft er een oppervlak van 170 nm 2 over voor de perifere antenne eiwitten. Als we aannemen dat de opvouwing van de Lhca eiwitten van C. reinhardtii ongeveer hetzelfde is als die van de Lhcb en Lhca subeenheden uit hogere planten moet de LHCI antenne uit ongeveer 10 kopieën van monomere LHCI subeenheden bestaan. Hieruit volgt dat de PSI-LHCI complexen uit C. reinhardtii significant groter zijn dan die uit spinazie maar dat ze minder kopieën bevatten dan oorspronkelijk werd aangenomen.