Moderne Instrumentele Analyse Niels Jonker
Massa Spectrometrie Techniek waarbij de te onderzoeken stof wordt geïoniseerd en waarbij vervolgens van de gevormde (fragment)ionen de massa wordt bepaald. Klopt dit?? Infrarood en Massa Spectrometrie 2
Principe Ionisatie Scheiding van massa Meten van de hoeveelheid ionen van elke specifieke massa/lading verhouding Infrarood en Massa Spectrometrie 3
Massa Spectrometer Infrarood en Massa Spectrometrie 4
Instrumentatie Elke MS bestaat uit: 1. Monster inlet 2. Ionenbron 3. Massa Analyser 4. Detector 5. Data System Infrarood en Massa Spectrometrie 5
Eisen Vacuum systeem Het vacuum zorgt ervoor dat de geproduceerde ionen, zonder botsingen met andere gas-fase ionen. Als het vacuum niet toereikend is zal dit de gevoeligheid en resolutie beïnvloeden nvloeden. Infrarood en Massa Spectrometrie 6
Ionisatie Productie van: Positieve ionen Negatieve ionen (neutrale moleculen) Infrarood en Massa Spectrometrie 7
Ionisatie Gas-fase Electron Impact (EI) Chemical Ionization (CI) Spray Electrospray (ESI) Atmospheric Pressure Chemical Ionization (APCI) Desorptie Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization (MALDI) Fast Atom Bombardment (FAB) Infrarood en Massa Spectrometrie 8
Electrospray Ionisatie Fijne spray van geladen druppels. Door evaporatie van de druppels, zal door coulombische repulsie de druppel exploderen totdat uiteindelijk een ion overblijft. Infrarood en Massa Spectrometrie 9
Electrospray Ionisatie Voordelen Nadelen Parent Ion Hoge Massa range (<200 000Da) 000Da) Makkelijk te gebruiken Interface met HPLC Geen fragmentatie Polair monster Gevoelig voor zouten Ion/signal supressie Hoge gevoeligheid met nano-spray Infrarood en Massa Spectrometrie 10
APCI Infrarood en Massa Spectrometrie 11
Massa Analyzers Massa analyzer is verantwoordelijk voor de scheiding van de ionen op basis van massa/lading verhouding. Typen Magnetische sector Quadrupole Time of flight Ion trap Tandem massa spectrometrie Infrarood en Massa Spectrometrie 12
Magnetische Sector Ionen worden geextraheerd en versneld in de ionen bron met potentiaal V, 0.5 mv 2 = zv. Ionen komen in de vluchtbron en komen in het magnetisch veld H. Alleen ionen met bepaalde massa/lading verhouding hebben een gelijke centrifugale and centripetal kracht en zullen door de vluchtbuis vliegen: mv 2 / r = Hzv m/z = H 2 r 2 /2V Infrarood en Massa Spectrometrie 13
Magnetische Sector Infrarood en Massa Spectrometrie 14
Quadrupole Overstaande poles hebben gelijke polariteit.. De naastliggende poles hebben tegengestelde polariteit. Infrarood en Massa Spectrometrie 15
Quadrupole Over elke pole staat een RF en een DC-voltage. Infrarood en Massa Spectrometrie 16
Quadrupole Alleen ionen met een bepaalde mass-to to-charge ratio zal het juiste oscillerende pathway bezitten door de analyzer. Infrarood en Massa Spectrometrie 17
Quadrupole Voordelen Nadelen Goedkoop Makkelijk te koppelen met verschillende ionisatie- technieken Lage accuracy (>100ppm) MS/MS meerdere quads nodig Relatief lage Massa Range (<4000Da) Trage scanning Infrarood en Massa Spectrometrie 18
Time of Flight Infrarood en Massa Spectrometrie 19
Time of flight Infrarood en Massa Spectrometrie 20
Time of flight Voordelen Nadelen Extreem Hoge Massa Range (>1 MDa) Snelle scanner Lage Resolutie Lage nauwkeurigheid (>200ppm) Infrarood en Massa Spectrometrie 21
Ion-Trap Infrarood en Massa Spectrometrie 22
Tandem massa spectrometrie (MS-MS) MS) Fragmentatie De geselecteerde ion botst met een botsingsgas (argon of helium) wat resulteert in fragmentatie. Infrarood en Massa Spectrometrie 23
Tandem massa spectrometrie (MS-MS) MS) Infrarood en Massa Spectrometrie 24
MS MS/MS MS/MS/MS MS: Voornamelijk intacte masses zoals eiwitten en peptides. MS/MS: Intacte component fragmenteert in de mass spectrometer massa s van de fragmenten (daughter ions) MS n : Continue isolatie van massa s en fragmenten. Infrarood en Massa Spectrometrie 25
Daughter scan Infrarood en Massa Spectrometrie 26
Parent scan Infrarood en Massa Spectrometrie 27
Neutral loss Infrarood en Massa Spectrometrie 28
LC-MS Infrarood en Massa Spectrometrie 29
Waarom de koppeling tussen LC en MS? De analyse van mengsel is moeilijk. Als de stoffen gescheiden zijn via LC (of een andere herhaalbaarheid beter scheidingstechniek) ) is de Er kan signaal of ion suppressie plaatsvinden (ESI) Analieten mogelijk niet die in lage niet gedetecteerd worden. concentratie aanwezig zijn, kunnen Infrarood en Massa Spectrometrie 30
Restrictions Niet vluchtige zouten moeten worden aangezien deze ion suppressie veroorzaken. vermeden, Sterke ion-pairing agents zoals TFA moeten in sommige gevallen vermeden worden. Over het algemeen is ESI het best compatibel met polaire oplosmiddelen. Additieven moet compatibel zijn met het ESI-proces proces.. (bv( bv. DMSO veroorzaakt problemen) Infrarood en Massa Spectrometrie 31
Welke LC kan gekoppeld worden met MS Voornamelijk met reversed phase (i.e. C18, C8, C4) Ion exchange (ion-wisseling wisseling) Affiniteits chromatografie 2D chromatography (ion exchange gevolgd door reversed phase) Infrarood en Massa Spectrometrie 32
ESI condities Flow rate: Over het algemeen is het ESI proces optimaal bij lage flow rates (2-200 µl/min) ph van de loopvloeistoffen moeten laag genoeg zijn om de analieten te ioniseren.. (Dit( aangezien ESI een in-vloeistof ionisatie techniek is) Matrix effecten: hoge concentraties van zouten kunnen ion suppressie veroorzaken. Buffers: Vluchtige buffer hebben de voorkeur. Infrarood en Massa Spectrometrie 33
Off-line LC-MS LC may also be coupled with MS by fraction collection (ion exchange, size exclusion chromatography) Fractions may be analyzed by any compatible MS technique Off-line automation Infrarood en Massa Spectrometrie 34
LC-MS Groot scheidend vermogen waardoor complexe mengels kunnen worden geanalyseerd. MS heeft een hoge nauwkeurigheid en gevoeligheid. MS biedt additionele molecuulmassa en structuurformule informatie over Infrarood en Massa Spectrometrie 35
Folium zuur en metabolieten in plasma Infrarood en Massa Spectrometrie 36
Eiwit analyse Infrarood en Massa Spectrometrie 37
Eiwit analyse Infrarood en Massa Spectrometrie 38
Eiwit analyse 2 pieken, beide eiwit pieken met verschillende ladingen (n en (n+1)) (m/z) n = 1211.8 (m/z) n+1 = 1131.1 We weten dat: de piek n lading op het eiwit geeft dus we weten dat: (m/z) n = [M+Hn]/n en dat (m/z) n+1 = [M+H(n+1)]/(n+1) Infrarood en Massa Spectrometrie 39
Eiwit analyse (m/z) n = [M+Hn]/n en dat (m/z) n+1 = [M+H(n+1)]/(n+1) Mbv deze twee formules kunnen we n berekenen, nl; n = [(m/z) n+1 - H(1) ]/[( m/z) n - (m/z) n+1 ] Dus invullend, zien we dat; n = (1131.1 1)/1211.8-1131.1 = 14 (ladingen) en nu kunnen we de massa van het eiwit bepalen: M w = n(m/z) n nh = 14 * 1211.8 14*1 = 16951 Da Infrarood en Massa Spectrometrie 40
Eiwit analyse Infrarood en Massa Spectrometrie 41
Help!!! Graag een methode! Infrarood en Massa Spectrometrie 42