Samenvatting voor de geïnteresseerde leek

Samenvatting voor de geïnteresseerde leek INLEIDING Energiesubstraten voor de hersenen en hersenanatomie Energiesubstraten voor de hersenen De hersenen gebruiken veel energie. De hersenen van een volwassen persoon wegen ongeveer 2-3% van het totale lichaamsgewicht, maar verbruiken tot 25% van de totale energievoorraad. Glucose is de belangrijkste energieleverancier voor de hersenen. Glucose wordt normaliter met behulp van zuurstof omgezet in koolstofdioxide en water, waarbij energie geproduceerd wordt (aëroob metabolisme). Glucose kan ook zonder zuurstof omgezet worden in lactaat (anaëroob metabolisme); hierbij ontstaat echter veel minder energie dan tijdens aëroob metabolisme. Door de lagere productiviteit van anaëroob metabolisme, dacht men van oudsher dat lactaat alleen vanuit glucose gevormd werd tijdens zuurstofgebrek. Immers, als zuurstof aanwezig is kan veel meer energie geproduceerd worden via de aërobe omzetting van glucose naar koolstofdioxide en water. Tegenwoordig weet men echter dat lactaat ook gevormd wordt vanuit glucose tijdens de normale hersenactiviteit, zonder enige vorm van zuurstoftekort. Het belangrijkste energiesubstraat voor de hersenen is glucose, maar er zijn ook andere stoffen die als energiesubstraat kunnen dienen, waaronder lactaat en keton lichamen. Keton lichamen worden alleen door de hersenen gebruikt in jonge individuen, tijdens vasten, en als de glucosegehaltes in het bloed te laag zijn (hypoglycemie). Lactaat kan als energiesubstraat gebruikt worden in zowel normale als hypoglycemische situaties. Lactaat heeft dus een dubbele rol: het wordt gevormd tijdens zuurstoftekort (anaëroob metabolisme), maar het kan ook gebruikt worden als energiesubstraat in de aanwezigheid van zuurstof. Cellulaire hersenanatomie De hersenen bestaan uit diverse typen cellen. De zenuwcellen (neuronen) zijn algemeen bekend; neuronen verzorgen onder andere de centrale aansturing van het lichaam, en verzorgen de informatie-opslag (geheugen) en overdracht. Daarnaast zijn er een aantal celtypen die een meer ondersteunende rol hebben. Eén van deze cel typen is de astrocyt, genoemd naar zijn stervormige uiterlijk (astro = ster). Astrocyten vormen een cellaag tussen de neuronen en de bloedvaten, waarbij uitstulpingen van de astrocyt, zogenaamde eindvoetjes, het bloedvat en de neuron omhullen. Hierdoor hebben zenuwcellen en bloedvaten vrijwel geen direct contact met elkaar. Omdat de voorraad energie in de hersenen, in de vorm van glycogeen, erg laag is, is de bloedtoevoer naar de hersenen erg belangrijk. Vrijwel alle energie voor de hersenen wordt vanuit het bloed gehaald. Door de merkwaardige anatomische plaatsing van de astrocyten tussen de bloedvaten en de neuronen wordt gedacht dat zij een rol kunnen spelen in de levering van energie aan de neuronen. Hierbij wordt glucose vanuit het bloed eerst door de astrocyt opgenomen, die het

-als glucose of als een ander product- doorgeeft aan de neuronen. Omdat huidige technieken nog niet ver genoeg ontwikkeld zijn om op cellulair niveau in de hersenen te kijken, worden andere technieken aangewend (zoals in vitro metingen) om te bestuderen hoe de samenwerking tussen astrocyten en neuronen zou kunnen werken. Door diverse experimenten bleek al snel dat na opname van glucose door de astrocyten, lactaat weer vrijgegeven wordt. Dit vormde de basis voor de astrocyt-neuron-lactaat-shuttle theorie, waarin lactaat, vrijgegeven door de astrocyten, de belangrijkste energiesubstraat van de neuronen is. Glutamaat (een signaalmolecuul of neurotransmitter) speelt een belangrijke rol in deze theorie; glutamaat wordt vrijgegeven door neuronen tijdens activiteit, de opname van dit glutamaat door astrocyten is gekoppeld met de lactaat afgifte. Verscheidende studies vonden bewijs voor de astrocyt-neuron-lactaat-shuttle theorie, hoewel er ook resultaten tegenstrijdig met de theorie zijn. Aanhangers van de conventionele theorie denken dat glucose het belangrijkste energiesubstraat van alle hersencellen is, en dat lactaat wel verbruikt kan worden, maar alleen als glucose niet voorhanden is. Vandaag de dag wordt er veel gediscussieerd over verscheidene onderdelen van de twee theorieën, waaronder het gebruik van lactaat door neuronen in plaats van glucose, en de respons van astrocyten naar de neuronale vraag om energie. Hersenschade Het analyseren van hersenmetabolisme is ook erg belangrijk voor het onderzoeken van mogelijke therapeutische interventies voor hersenschade. Het analyseren van de hoeveelheid schade in de hersenen, en de verbetering van voorspellen van het herstel zijn belangrijke onderzoeksgebieden, waarbij het gebruik van biologische markers wordt onderzocht. Het monitoren van de hersenen kan belangrijk zijn in elke situatie waar de conditie van de hersenen in gevaar is, bijvoorbeeld na een herseninfarct, hersentrauma of vergiftiging. Hypoxie (zuurstoftekort) of ischemie (zuurstof en voedingtekort) ontstaat wanneer de hersenen niet voldoende zuurstof en glucose uit het bloed kunnen halen doordat de bloeddoorstroming is gestopt (door bijvoorbeeld een hartaanval of een bloedprop in de hersenen). Door het tekort aan zuurstof kan glucose alleen nog maar anaëroob omgezet worden, waardoor er hoge concentraties lactaat ontstaan. Het tekort aan energie veroorzaakt uiteindelijk hersenoedeem en celdood. Specifieke markers voor hersenschade, die buiten de hersenen (in het bloed) gemeten kunnen worden, zouden wellicht kunnen helpen om de grootte van de hersenschade en het eventuele herstel in kaart te brengen. Omdat de concentraties van glucose en lactaat veranderen tijdens hersenschade, zijn zij potentiële kandidaten om als markers voor hersenschade te dienen. Methoden om metabolisme te meten In vitro versus in vivo Metabolisme kan op verschillende manieren gemeten worden. Twee zeer verschillende meetmethoden zijn de in vitro en in vivo methode. In vitro metingen (bijvoorbeeld aan celcultures) hebben als voordeel dat de condities tijdens het meten constant gehouden en gecontroleerd kunnen worden. Een in vitro situatie is echter een model voor de in vivo realiteit. Monitoren in het lichaam (in vivo) levert een preciezer beeld van de werkelijke 2

situatie, maar is moeilijker te interpreteren omdat metingen in vivo moeilijk constant gehouden kunnen worden, en er oncontroleerbare invloeden kunnen zijn. Celcultures worden veel gebruikt om hersenmetabolisme te bestuderen. Een groot deel van de astrocyt-neuron-lactaat-shuttle theorie is gebaseerd op in vitro bevindingen. De hersenen worden beschermd door de schedel, wat de benadering van de hersenen voor in vivo monitoren bemoeilijkt. Verscheidene oplossingen zijn bedacht om toch de hersenen te kunnen meten: beeldvormende technieken (PET, MRI), intracerebrale (= in de hersenen) meettechnieken, en het meten van arterio-veneuze verschillen. Bij arterio-veneuze metingen wordt het energieverbruik van de hersenen berekend door in het ingaande en uitgaande bloed de concentratieverschillen van glucose en lactaat te meten, en die te vermenigvuldigen met de snelheid van de cerebrale doorbloeding. In dit proefschrift zijn arterio-veneuze verschillen gemeten in de aorta en de vena jugularis (halsader). Batch-wise versus on-line Een ander onderscheid dat gemaakt kan worden in het meten van metabolisme, is batchwise versus on-line. Batch-wise metingen worden het meest gebruikt. Hierbij wordt een meting bewaard totdat een groep metingen in één keer geanalyseerd kan worden. Deze aanpak levert relatief weinig meetpunten. Veel metingen, of een continue meting, kan verzorgd worden door een on-line meting. Hierbij is de analyse apparatuur direct gekoppeld aan de experimentele set-up, waardoor metingen direct en frequent geanalyseerd kunnen worden. De on-line methode is moeilijker uit te voeren dan batch-wise analyse, omdat gespecialiseerde apparatuur nodig is. On-line monitoren is relatief jong, en wordt daardoor nog niet veel toegepast. In dit proefschrift hebben we met een on-line methode gewerkt, waarin Flow Injectie Analyse (FIA) werd gecombineerd met biosensoren voor glucose en lactaat. Biosensoren zijn meeteenheden die een biologisch substraat gebruiken om een stof te meten. In ons onderzoek zijn de enzymen glucose oxidase en lactaat oxidase gebruikt om de concentratie glucose en lactaat te bepalen. Dit FIA systeem meet semi-continu; op gezette tijden (bijvoorbeeld elke minuut) wordt een meting geanalyseerd. Het FIA systeem heeft als voordelen dat het makkelijk aangepast kan worden per experiment, en omdat er kleine volumina gemeten worden, is de meting snel en secuur. Bovendien zorgen de biosensoren voor hoge specificiteit. Omdat het lichaam stoffen bevat die het FIA systeem contamineren, dienen in vivo metingen gefiltreerd te worden. Als toevoeging op het FIA systeem hebben we daarom in de in vivo experimenten ultrafiltratie gebruikt als prefiltratie methode. DIT PROEFSCHRIFT Noch metabolisme in vivo, noch het energieverbruik van cellen in vitro, is eerder met het on-line FIA systeem gemeten. In dit proefschrift hebben wij glucose en lactaat metabolisme gemeten, zowel in vitro als in vivo. We hebben onze aanpassingen aan het on-line systeem onderzocht op toepassing voor in vitro en in vivo bepalingen, en hebben de tegenwoordige theorieën over cellulair en cerebraal metabolisme bestudeerd. De uitdagingen in dit onderzoek lagen onder andere in het inzetten van de on-line techniek voor het meten van glucose en lactaat metabolisme in vitro en in vivo, en in de interpretatie van de data in relatie tot het huidige debat over energieverbruik van de hersenen. Dit proefschrift is verdeeld in twee onderdelen. Het eerste deel is gericht op de in vitro metingen van 3

cellulaire glucose en lactaat metabolisme, het tweede deel richt zich op de in vivo metingen van glucose en lactaat gebruik van de hersenen. In vitro experimenten In hoofdstuk 2 staat het aangepaste on-line systeem voor het in vitro monitoren beschreven, waarmee het metabolisme in diverse cel cultures gemeten is, waaronder neuronen, astrocyten, en gistcellen. Om cel metabolisme te meten, hebben we een celkamer ontwikkeld, die in het on-line systeem ingepast kan worden. Glucose consumptie en lactaat uitscheiding (efflux) zijn in diverse celtypen gemeten. Omdat de zuurstof (essentieel voor aëroob metabolisme) via de vloeistofstroom bij de cellen terechtkomt, is de aangeboden zuurstof afhankelijk van de doorstromingssnelheid. De aërobe ratio (een maat voor het percentage aëroob energieverbruik, waarbij de gemeten vorming van lactaat van glucose voor anaëroob metabolisme staat), zoals gemeten in onze experimenten, was gemiddeld tot hoog (60-90%) vergeleken met aërobe ratio s zoals berekend vanuit de literatuur (50-70%). Omdat onze experimenten suggereerden dat lactaat (gedeeltelijk) van glycogeen gemaakt zou kunnen worden in plaats van glucose, zou de werkelijke aërobe ratio hoger kunnen zijn dan onze berekende aërobe ratio. Een innovatief voordeel van ons on-line systeem is, dat het energieverbruik per cel per minuut berekend kan worden. Zoals berekend in dit hoofdstuk, blijken neuronen en astrocyten ongeveer gelijke hoeveelheden glucose te verbruiken, gist cellen gebruiken daarentegen ongeveer honderd maal minder energie per cel. In hoofdstuk 3 zijn organotypische hippocampale slice cultures gemeten in ons on-line systeem. Organotypische hippocampale slice cultures zijn in vitro gekweekte embryonale plakjes hippocampusweefsel (de hippocampus is een onderdeel van de hersenen). De minimale verstoring van de onderlinge verbindingen tussen de cellen, en de stabiliteit van de plakjes zijn voordelen van de organotypische hippocampale slice cultures. Glucose metabolisme en lactaat productie waren nog nooit eerder bestudeerd in slice cultures. Voor dit doel werd een iets andere celkamer ontworpen, waarin de zuurstoftoevoer onafhankelijk was van de doorstroming. In dit hoofdstuk werd glucose en lactaat metabolisme gemeten tijdens verscheidene manipulaties van het celmetabolisme. In deze experimenten werd ongeveer 50% van de opgenomen glucose omgezet in lactaat, en ook lactaat werd door de plakjes opgenomen (hoewel in mindere mate dan de glucose opname). Ook in deze experimenten waren er aanwijzingen voor lactaatvorming vanuit glycogeen. In hoofdstuk 4 hebben we het energieverbruik in astrocyt cultures gemeten. Omdat in de hersenen de astrocyten zich tussen de bloedvaten en de neuronen bevinden, worden er gedacht dat astrocyten een rol spelen in de energievoorziening van de neuronen. In het onderzoek in hoofdstuk 4 zijn het glucose en lactaat metabolisme gemeten terwijl de astrocyten glucose, lactaat, of een combinatie van beiden aangeboden kregen. De berekeningen aan het energieverbruik per cel werd uitgebreid in deze metingen, waarin we zowel glucose verbruik als lactaat verbruik hebben berekend per cel per minuut. De cellen prefereren glucose boven lactaat, met een glucose verbruik van 1 miljard glucose moleculen per cel per minuut. We vonden aanwijzingen voor glycogeen afbraak vanuit grote glycogeen voorraden, wat voornamelijk in lactaat werd omgezet. De grootte van de glycogeen voorraden en de lactaat efflux bleek af te hangen van de incubatiecondities tijdens de kweek van de cellen. Het glucose verbruik veranderde niet wanneer lactaat als extra substraat werd gegeven. Dit gegeven bracht ons tot de theorie dat er een 4

onafhankelijke pool van lactaat is, omdat het glucose verbruik lager zou zijn als lactaat glucose als energiesubstraat zou vervangen. Berekeningen wijzen erop dat het in vivo energie substraat verbruik en de voorraad per cel veel lager is dan die van de huidige in vitro preparaten. Deze observatie kan grote implicaties hebben wanneer in vitro resultaten gebruikt worden om in vivo observaties en theorieën te begrijpen. In vivo experimenten Het tweede deel van dit proefschrift richt zich op de in vivo metingen van hersenmetabolisme, en begint met een overzicht van het gebruik van biosensoren voor in vivo metingen (hoofdstuk 5). In dit hoofdstuk wordt de werking van de biosensoren die ontwikkeld zijn in ons laboratorium uitgelegd, en de applicatie van deze biosensoren in klinisch monitoren en experimenteel onderzoek uiteengezet aan de hand van diverse resultaten bereikt met deze biosensoren. Dit overzicht illustreert dat biosensoren gebruikt kunnen worden in diverse gebieden van het experimentele en klinische onderzoek, waaronder hersentrauma s, hartinfarcten, en onderzoek aan diabetes. De biosensoren zoals ontwikkeld in ons laboratorium zijn relatief goedkoop, en zijn een lange periode werkzaam: zowel de glucose als lactaat biosensor zijn actief voor tenminste 6 weken en 10.000 metingen. Het biosensor-overzicht in hoofdstuk 5 geeft aan dat biosensoren, gecombineerd met ultrafiltratie of microdialyse, heel bruikbaar zijn in het monitoren van glucose gehaltes en pathologische gebeurtenissen, zowel onderhuids (subcutaan) als in de bloedbaan (intraveneus). In hoofdstuk 6 wordt een overzicht gegeven over het gebruik van ultrafiltratie als een selectiemethode voor in vivo metingen. Ultrafiltratie-probes worden hierbij subcutaan of intraveneus geplaatst. Door milde zuiging worden kleine moleculen naar het meetsysteem gezogen, grote moleculen en cellen kunnen de filtratie-probe niet passeren. Door deze selectiemethode worden kleine moleculen van grote moleculen gescheiden, wat contaminatie van het on-line FIA systeem voorkomt. Bovendien wordt door ultrafiltratie slechts minieme hoeveelheden vloeistof afgenomen. Dit overzicht bespreekt de potentie van in vivo ultrafiltratie als een continue meettechniek in klinische onderzoeksgebieden, en in een aantal biomedische applicaties zoals glucose en lactaat metingen en kinetiek studies. Subcutaan of intraveneuze ultrafiltratie-probes zijn gebruikt voor off-line en on-line analyses, in diverse diersoorten, waaronder honden, ratten, varkens, en mensen. Ultrafiltratie lijkt veel op microdialyse, maar er zijn belangrijke verschillen. De voor- en nadelen van beide technieken zijn besproken in dit hoofdstuk. Dit overzicht laat zien dat ultrafiltratie een goed alternatief kan zijn voor microdialyse. De experimentele sectie van deel 2 begint met een onderzoek naar het in vivo glucose en lactaat verbruik na hersentrauma in geanestheseerde ratten (hoofdstuk 7). In de in vivo experimenten hebben wij twee ultrafiltratie-probes in één rat aangebracht voor het tegelijkertijd meten van arteriële en veneuze glucose en lactaat waarden. Dit was nog niet eerder uitgevoerd. Vóór het hersentrauma werd gegeven, werd er glucose opname en lactaat efflux gemeten tijdens lage lactaatconcentraties in het bloed. Na de hersentrauma werd er een verlaging in de glucoseopname en een iets lagere lactaat efflux gevonden, wat suggereert dat arterio-veneuze metingen gebruikt kunnen worden om hersenschade te meten. Uit de resultaten bleek dat de lactaatflux in en uit de hersenen niet alleen afhangt van de lactaatconcentratie in de hersenen, maar ook van de bloedlactaat-waarden. In tegenstelling tot bevindingen uit de literatuur vinden wij in dit onderzoek dat lactaat blijkbaar vrij gemakkelijk de bloed-hersen barrière kan passeren. 5

In hoofdstuk 8 hebben we de concentratie-afhankelijkheid van de lactaat-flux beter bestudeerd door lactaat influx en efflux te meten tijdens en na een lactaat infuus. Ook hebben we bestudeerd of lactaat, opgenomen vanuit het bloed, door de hersenen gebruikt kan worden als energiesubstraat, ter vervanging van glucose. De verandering in lactaat en glucose flux tijdens en na een lactaat infuus werd bestudeerd door het meten van arterioveneuze verschillen over de hersenen. De lactaat flux bleek (net als het vorige hoofdstuk) concentratie afhankelijk, met een lactaat influx tijdens het lactaat infuus, en een efflux van lactaat meteen na het infuus. De resultaten suggereren dat het grootste deel van het lactaat dat de hersenen ingaat tijdens het infuus, na het infuus de hersenen weer verlaat. Dit betekent dat het grootste deel van de lactaat niet gebruikt wordt als energiesubstraat, en dat lactaat glucose niet vervangt als energiesubstraat. De theorie werd geopperd dat er een lactaat pool in de hersenen is, die gevuld en geleegd kan worden naar gelang de bloed lactaat concentratie, maar die niet gebruikt wordt als energiebron. In het laatste experimentele hoofdstuk (hoofdstuk 9), hebben we de lactaat-infuus data gebruikt om lactaat kinetiek te beschrijven. Hiervoor hebben we het lactaat metabolisme in het lichaam theoretische gemodelleerd, en werden zowel de arteriële als veneuze data gebruikt om de lactaat systemen in het lichaam mathematisch te benaderen. Dankzij de hoge temporele resolutie tijdens onze metingen, konden arterio-veneuze lactaat kinetiek gemodelleerd worden in individuele experimenten. Met ons mathematische model konden we de verlate efflux vanuit het hoofd benaderen, en vonden dat het distributievolume van lactaat in het hoofd toeneemt met de infuustijd. Berekeningen suggereren dat lactaat verdeeld kan worden in ongeveer 24% van het hersenvolume. ALGEMENE DISCUSSIE: METHODE In dit proefschrift is de bruikbaarheid van het kwantitatief monitoren van zowel cellulair als cerebraal glucose en lactaat metabolisme aangetoond. Het on-line FIA-systeem zoals gebruikt in dit proefschrift kenmerkt zich door het gebruik van kleine volumina, met slechts korte vertraagtijden en een hoge temporele resolutie. Door miniaturisatie van zowel het online systeem als de biosensoren, kan de temporele resolutie en de vertraagtijd verder geoptimaliseerd worden. Het FIA-meetsysteem kan makkelijk gemodificeerd worden. In dit proefschrift zijn twee verschillende opstellingen gebruikt; in feite kunnen alle onderdelen naar wens aangepast worden. De biosensoren kunnen bijvoorbeeld gemakkelijk veranderd worden voor de meting van andere stoffen, door andere enzymen in de biosensoren te plaatsen. Door het innovatieve concept van celkamers waren wij in staat om verscheidene cel typen en cultures on-line te meten. De relatieve hoge aërobe ratio, zoals berekenend met beide typen celkamers, suggereert een goede cellulaire conditie, wat essentieel is voor een accurate meting van energiemetabolisme. Omdat in vitro monitoren van de cellulaire conditie een relevante en veilige manier is om effecten van stoffen en stimuli te meten, is het toekomstperspectief van on-line in vitro monitoren zeer gunstig. Metabolisme kan in de (nabije) toekomst bijvoorbeeld gemeten worden in geïsoleerde celtypen, die normaliter samenwerken met ander celtypen (vergelijk neuronen en astrocyten), de weerstand tegen ischemie (zuurstoftekort) kan bestudeerd worden in verscheidene celtypen (bijvoorbeeld hartcellen) voor de ontwikkeling van medicijnen (voor bijvoorbeeld een hartaanval), en (menselijk) weefsel kan bestudeerd worden voor onderzoek naar het optimale 6

chemotherapeutisch medicijn bij tumoren. Bovendien kan in vitro monitoren uiteindelijk het aantal proefdieren in wetenschappelijk onderzoek verminderen. Een extra voordeel van on-line in vitro monitoren met een hoge temporele resolutie, is de mogelijkheid om energieverbruik per cel te berekenen, en bovendien is een hoge temporele resolutie een voordeel bij het analyseren van lactaat kinetiek per individueel experiment. Een ander nieuw concept in dit proefschrift, naast de mogelijkheid om metabolisme in vitro te meten, is de introductie van twee monitoreenheden voor het meten van arterio-veneuze verschillen in vivo. De arterio-veneuze techniek bleek erg geschikt in het meten van de opname en afgifte van glucose en lactaat door de hersenen na hersentrauma en na lactaat infuus, hoewel we ook extracerebraal weefsel gemeten hebben tijdens de lactaat-infuus experimenten. Om lactaat kinetiek te meten, is het belangrijk de infuustijd zo kort mogelijk te houden. De lactaat efflux dient wellicht in een ander bloedvat gemeten te worden dat dichter bij de hersenen ligt (bijvoorbeeld de sinus). De arterio-veneuze monitor techniek kan toegepast worden om opname en afgifte van stoffen te meten in allerlei organen in het lichaam. Tijdens de in vivo experimenten werd ultrafiltratie geïntroduceerd als prefiltratie methode. Ultrafiltratie is een geschikte methode in een verscheidenheid aan in vivo experimenten in plaats van, of complementair aan microdialyse. In conclusie: de mogelijkheden van biosensortechnologie voor kwantitatieve metabole studies staat nog in zijn kinderschoenen. Dit proefschrift moge een bijdrage zijn om de potentie van deze technologie aan te tonen. ALGEMENE DISCUSSIE: METABOLISME In dit proefschrift zijn het glucose en lactaat metabolisme bestudeerd in vitro en in vivo, waarin wij onder andere gevonden hebben dat glucose geprefereerd wordt als energiesubstraat. De helft van het opgenomen glucose wordt weer afgegeven als lactaat, zowel in vitro als in vivo, wat onder meer heeft aangegeven dat lactaat gemakkelijk de bloed-hersen barrière kan passeren. Alhoewel de vorming van lactaat uit glucose in overeenstemming is met de astrocyt-neuron-lactaat-shuttle theorie, past de lactaatflux over de bloed-hersen barrière niet in de theorie, omdat de vorming en het verbruik van lactaat alleen in de hersenen zelf zou plaatsvinden. Wellicht belangrijker dan voorgaande is de notie dat metingen aan glucose opname zonder inachtneming van lactaat efflux een behoorlijke overschatting geeft van glucose metabolisme. Dit is bijvoorbeeld van belang in metingen aan glucose verbruik met behulp van deoxyglucose (DG). De DG methode is gebaseerd op het feit dat DG wel door cellen opgenomen, maar niet gemetaboliseerd kan worden. Waar DG opgenomen wordt, wordt het vastgehouden, waardoor aangetoond kan worden waar en hoeveel glucose opname heeft plaatsgevonden. In de literatuur wordt DG opname gelijkgesteld aan glucose metabolisme, omdat aangenomen werd dat lactaat de bloed-hersen barrière niet kon passeren. Daarom wordt er in de DG methode geen rekening gehouden met lactaat efflux vanuit de hersenen. Echter, in dit proefschrift werd een behoorlijke bi-directionele lactaat flux over de bloed-hersen barrière gevonden, wat zou kunnen beteken dat de opname van glucose, zoals gemeten met de DG methode, een overschatting geeft van het aërobe glucose metabolisme. In de in vitro experimenten werden aanwijzingen gevonden voor grote glycogeen voorraden, die afhankelijk zijn van de incubatiecondities en voornamelijk afgebroken en uitgescheiden worden als lactaat. De invloed van de incubatiecondities op de glycogeenhoeveelheid, en daarbij de lactaat efflux, en het hogere energieverbruik in vitro 7

vergeleken met in vivo, betekent dat extrapolatie van conclusies over het energiemetabolisme vanuit in vitro experimenten naar de in vivo situatie niet rechtstreeks gedaan mag worden. Dit kan behoorlijke gevolgen hebben voor de astrocyt-neuron-lactaatshuttle theorie, omdat een groot deel van de conclusies die aan de basis liggen van de theorie, gebaseerd zijn op in vitro experimenten. In dit proefschrift vonden we lactaat consumptie in vitro in neuronen, astrocyten, en hippocampale slices. Alhoewel neuronaal lactaat metabolisme de astrocyt-neuron-lactaatshuttle theorie ondersteunt, spreekt het lactaatverbruik in astrocyten de theorie tegen. In tegenstelling met het lactaatverbruik zoals gevonden in vitro, is er geen lactaat metabolisme gevonden in de in vivo experimenten. Het gebrek aan netto lactaat metabolisme door de hersenen in vivo, betekent niet dat lactaat helemaal niet door de hersenen gebruikt kan worden als energiesubstraat. Lactaatmetabolisme door de hersenen in vivo staat in de literatuur beschreven, en ook de verlaagde lactaat efflux na hersentrauma (dit proefschrift) kan wellicht wijzen op een (toegenomen) lactaat verbruik. Uit onze arterio-veneuze experimenten blijkt echter dat een eventueel lactaat metabolisme geen rol speelt in het netto energie verbruik van de hersenen. De flux van lactaat in en uit een pool die niet gemetaboliseerd wordt (met een poolgrootte van 24% van het hersenvolume), is blijkbaar (gedeeltelijk) onafhankelijk van de glucose pool, en is gebaseerd op een concentratieverschil over de bloed-hersen barrière, en niet op de actieve opname van lactaat om gebruikt te worden als metabool substraat. Samenvattend, wijzend op de ongelijkheid in in vitro en in vivo substraat verbruik en glycogeen hoeveelheid, moeten de in vitro resultaten voor of tegen de astrocyt-neuronlactaat-shuttle theorie met grote voorzichtigheid geanalyseerd worden. Het is bijvoorbeeld mogelijk dat de hoge glycogeen concentratie en de lactaat efflux, zoals gevonden in vitro, artefacten zijn veroorzaakt door de incubatiecondities tijdens het kweken van de cellen. Omdat de astrocyt-neuron-lactaat-shuttle theorie voornamelijk gebaseerd is op in vitro resultaten, geeft dit proefschrift aanwijzingen die de basis van de astrocyt-neuron-lactaatshuttle theorie ondermijnen. Dus, hoewel vele resultaten, vanuit dit proefschrift en vanuit de literatuur, uitgelegd kunnen worden vóór of tegen de astrocyt-neuron-lactaat-shuttle theorie, zijn veel resultaten geëxtrapoleerd vanuit in vitro resultaten en daarom slechts indirect bewijs. Maar, met het indirecte bewijs van de in vitro experimenten kan wel getheoretiseerd worden over hersenmetabolisme. Omdat uit onze experimenten bleek dat glucose geprefereerd wordt boven lactaat in zowel neuronen als astrocyten, en lactaat gemetaboliseerd kan worden door beide celtypen (in mindere mate dan glucose), wijst de data in dit proefschrift niet naar de astrocyt-neuron-lactaat-shuttle theorie, maar in richting van de conventionele hypothese van hersenmetabolisme. Maar, zoals hierboven vermeld, moet niet vergeten worden dat in vitro data, bestemd voor in vivo-theorieën, tot misinterpretaties kunnen leiden. Direct bewijs vóór of tegen de theorieën kan alleen gevonden worden wanneer er technieken voorhanden komen die op cellulaire schaal het in vivo hersenmetabolisme kunnen meten. 8