Ledenvergadering 2013 Stand van zaken wetenschappelijk onderzoek Em. prof. dr. J. J. Cassiman Ik wil eerst wat achtergrond geven over de ontwikkelingen in mijn domein, de genetica. Dat is belangrijk om meer inzicht te krijgen in de complexiteit van een ziekte zoals de ziekte van Huntington. De technologie en de kennis zijn in de laatste vijf à tien jaar erg geëvolueerd. Er is heel wat kennis bijgekomen. We kunnen echt spreken van een revolutie in het domein, omdat het zo spectaculair is. Het is belangrijk dat we de basissamenstelling van het DNA van de mens kennen. We weten al meer dan 50 jaar dat DNA is opgebouwd uit vier bouwstenen, maar de precieze volgorde van die vier bouwstenen over de 2,40 m DNA die in elke cel van ons lichaam zit, die was niet gekend. Daarom werd een menselijk genoomproject ontwikkeld. Verschillende laboratoria, verspreid over gans de wereld, hebben meer dan tien jaar gewerkt aan het ontrafelen van het menselijk DNA. In 2003 is dat project tot een goed einde gekomen. De resultaten van het onderzoek zijn vrij beschikbaar op het internet geplaatst. Je kan dit vergelijken met een bibliotheek. In elke cel van ons lichaam zitten als het ware 130 boeken met elk 43000 letters. Dit is dus een enorme hoeveelheid informatie die vandaag door wetenschappers kan gelezen worden. Het onderzoek wordt vandaag ook veel betaalbaarder door de ontwikkeling van toestellen waarmee je op enkele weken tijd het DNA van iemand kan lezen. Dit opent mogelijkheden. Vooral in China wordt hier in snel tempo aan gewerkt. Zij kunnen momenteel hier veel meer in investeren en leveren op dit domein goed werk. We krijgen op deze wijze meer en meer informatie over het menselijk DNA. Het is niet alleen op het niveau van het DNA dat er dankzij het menselijk genoomproject heel wat is gebeurd, maar ook op het niveau van de eiwitten. Het DNA bevat heel wat informatie, maar is op zichzelf niet actief. De informatie die het DNA bevat, moet afgeschreven en vertaald worden in eiwitten die het werk verrichten. Het is dus belangrijk om te begrijpen wat de eiwitten, die afgeschreven worden van het DNA, juist doen. Momenteel is er juist hiernaar volop onderzoek bezig. We hebben honderden, duizenden van die eiwitten en trachten nu te begrijpen wat elk van die eiwitten juist doen. Het blijkt dat die eiwitten niet op zich actief zijn, maar dat ze samenwerken in netwerken. Je ziet dat verschillende eiwitten in één netwerk aan één functie in de cel werken. Je ziet ook dat er verschillende netwerken zijn die elkaar overlappen en dat er eiwitten zijn die in verschillende netwerken actief zijn. Het is dan ook begrijpelijk dat, als er iets misloopt met een eiwit dat in verschillende netwerken actief is, er storingen ontstaan in al die netwerken. Hieruit kan je afleiden dat, wanneer er omwille van de genetische afwijking bij de ziekte van Huntington iets misloopt met het eiwit dat door het gen gevormd wordt, dat niet alleen een impact heeft op de functie van dat eiwit, maar ook op een heleboel andere eiwitten. Het begrijpen van de ziekte is dus een heel complexe zaak. 1
Momenteel worden die netwerken door wetenschappelijk onderzoek progressief ontrafeld. Ook al is er nog heel wat werk aan de winkel, men begint toch beter en beter te begrijpen wat die verschillende eiwitten doen. De recente wetenschappelijke ontwikkelingen laten niet alleen toe om het ganse DNA van iemand in kaart te brengen. Daarna kan men gaan kijken in de verschillende weefsels naar de verschillende bloedcellen. Men kan dan nagaan welke eiwitten in de verschillende cellen actief zijn en hoe die activiteit verandert. Men kan immers op verschillende tijdstippen die eiwitten onderzoeken. Het DNA blijft gedurende gans het leven hetzelfde, maar de eiwitten variëren in functie van de tijd. Men heeft gedurende 14 maanden regelmatig stalen genomen bij dezelfde persoon. Uit de resultaten van de analyses kan men een aantal gegevens afleiden. Zo kan men bijvoorbeeld zien wanneer die persoon een virale infectie heeft gehad en welke invloed dit gehad heeft op het niveau van de eiwitten. Het feit dat er een infectie was, heeft een verstoring gegeven in de activiteit van een heleboel genen. Dit is wat er in de toekomst zal gebeuren bij een heleboel ziekten. Men zal trachten een idee te krijgen wat er nu precies gebeurt. Bovendien zal men kunnen nagaan wat het effect is op het niveau van de eiwitten van een behandeling. Momenteel is zo een onderzoek nog veel te complex en te duur om uit te voeren, maar je mag in de toekomst verwachten dat dit de manier is waarop men mensen zal onderzoeken en de evolutie van een ziekte zal opvolgen. Wanneer je de DNA-analyses bekijkt die nu meer en meer ter beschikking komen, dan zie je dat de verschillen in de samenstelling van het DNA tussen de verschillende individuen veel groter is dan dat we aanvankelijk dachten. Het gaat blijkbaar om 1% van de bouwstenen die kunnen verschillen. Een bouwsteen op de honderd van de meer dan 3 miljard bouwstenen die er in de 2,40 m DNA per cel zitten, kan verschillen tussen twee personen. En die enorm grote verschillen die er binnen de wereldbevolking zijn, zijn blijkbaar het gevolg van de snelle aangroei van de bevolking in de jongste 5 à 10 000 jaar. Er was, relatief gezien, te weinig tijd om van een heleboel defecten die in het DNA zijn verschenen, af te geraken. Elk van ons heeft minstens 100 à 200 stukjes DNA waar ernstige fouten in zitten. Als je twee kopieën van dergelijke fouten hebt, één van vader en één van moeder, dan heb je een ernstige erfelijke ziekte gekregen. Op termijn, na vele generaties, zullen een heleboel van die fouten verdwijnen, maar er zullen er altijd overblijven en nieuwe bijkomen. De diversiteit tussen individuen is dus enorm groot. Wetenschappelijk onderzoek heeft uitgewezen dat we veel minder genen hebben dan we aanvankelijk dachten. Omdat er zoveel eiwitten actief zijn en de genen verantwoordelijk zijn voor de aanmaak van de eiwitten, werd er verondersteld dat de mens 100 à 150 000 genen zou hebben. Nu blijkt dat we slechts 20 000 genen hebben. Wat nu van belang is, is dat die 20 000 genen, die verantwoordelijk zijn voor de aanmaak van alle eiwitten, slechts 2 à 3 % uitmaken van het DNA, van die 2,40 m. Dus 97 à 98% van heel het DNA dient niet voor de aanmaak van de eiwitten. De vraag is dan waarvoor het wel dient. Nu blijkt dat die 97-98 % ook in belangrijke mate wordt afgeschreven. Deze afschriften hebben een effect op de manier waarop de genen functioneren. Er komt geen eiwit van, maar ze gaan een rol spelen in het controleren van de genen. Het gaat hier om RNA s of mirna s. De controles zorgen ervoor dat er een verschil is in de activiteit van de genen tussen het moment waarop je pas geboren wordt en volwassen bent. Dat er een verschil is in activiteit tussen hersencellen en levercellen, dat zit in die 97-98 % DNA. We krijgen daar steeds meer inzicht in, maar we beseffen meteen ook dat het enorm complex is en dat we er nog veel te weinig van weten. We kunnen het wel onderzoeken en binnen een aantal jaren zullen we er dus beter zicht op hebben. Sommigen hadden, en hebben misschien nog, de hoop dat we met DNA ooit alles zouden kunnen verklaren: fysische kenmerken, gedragingen, ziekten, enz. Het is duidelijk dat dat nooit zal kunnen. DNA is belangrijk en je mag stellen dat ongeveer de helft van de ziekten bepaald wordt door de samenstelling van het DNA. De rest wordt door de omgeving bepaald. De functie van het DNA wordt niet alleen gecontroleerd door de 97-98 %, de zgn. mirna s, maar de functie wordt ook meebepaald door de omgeving waarin het DNA terechtkomt. Dat begint van bij de ontwikkeling van het embryo. Die negen maanden dat het embryo in de baarmoeder zit, ondergaat het DNA invloeden van wat de moeder eet, de ziektes die ze doormaakt, de stress die ze heeft. Die conditionering van het DNA gaat ook na de geboorte door en ze neemt toe naarmate de leeftijd stijgt. Dit speelt een rol in de voorbeschiktheid en het uiteindelijk tot uiting komen van bepaalde ziektes en de variaties die er kunnen bestaan in de symptomen die je hebt van een bepaalde ziekte. De symptomen variëren van individu tot individu, omdat het meebepaald wordt door hun DNA en de conditionering. Het merkwaardige is dat de conditionering zelfs doorgegeven kan worden tussen verschillende generaties. Een voorbeeld. Tijdens de Tweede Wereldoorlog heerste er in Nederland een enorme hongersnood. De vrouwen die toen zwanger werden, brachten kinderen ter wereld met een lager geboortegewicht, kinderen die als volwassenen meer onderhevig waren aan depressies en hart- en vaatziekten. Dit fenomeen is al jaren bekend. Er is ondertussen ook vastgesteld dat, in sommige gevallen, de kleinkinderen van die vrouwen dezelfde problemen konden hebben. Daar is dus nu een verklaring voor. Het DNA van die kinderen onderging tijdens de zwangerschap een invloed, een conditio- 2
nering, van de hongersnood. De eicellen van alle meisjes beginnen te rijpen terwijl ze nog in de baarmoeder zitten. Het DNA van die eicellen werd dus ook geconditioneerd, zodanig dat de kinderen van die vrouwen ook diezelfde problemen kunnen hebben. Hoeveel generaties dit doorgegeven wordt, dat weten we niet. Bij sommige diermodellen is dit meer dan twee generaties, bij de mens is er nog veel meer onderzoek nodig. Een toepassing die in toekomst voor families waar de ziekte van Huntington in voorkomt niet onbelangrijk is, is het feit dat er nu duidelijke evidentie is dat in het bloed van elke zwangere vrouw vanaf 7 à 8 weken zwangerschap vrij DNA van het kind zit. Dit DNA verdwijnt bij de geboorte van het kind. Je kan dus het DNA van het kind onderzoeken via het bloed van de moeder. Je zal in de toekomst via een test op het bloed van de moeder grote chromosoomafwijkingen bij het kind kunnen opsporen. Dit verlaagt het risico van een prenatale diagnose. Er moet immers geen punctie, die toch risico s voor de foetus en de moeder meebrengt, meer gebeuren. Ook afwijkingen in het DNA, zoals de ziekte van Huntington, zal men in de toekomst op deze wijze kunnen vaststellen. Op termijn zal het mogelijk zijn om risico s te bepalen voor het ontwikkelen van alle mogelijke ziektes op basis van de analyse van het DNA, maar het zullen enkel risico s zijn. Risico s in de gezondheid begrijpen is extreem moeilijk. Wat betekent het om 2, 3, 4 of 5 keer meer risico te hebben dan het gemiddelde op bv. hartproblemen? Voor sommige aandoeningen kan je preventief maatregelen nemen, voor andere veel minder. Het is niet altijd eenvoudig om met deze kennis te leven. Dit roept op termijn zeker een aantal ethische vragen op. Hoe ver wil je gaan in het kennen van het DNA van het ongeboren kind of zelfs het pasgeboren kind en wat doe je met die informatie? Het recht op niet te weten wordt in deze context nog veel belangrijker. Het bovenstaande is ook belangrijk voor de ziekte van Huntington. De variaties in de symptomen die zich voordoen tussen verschillende patiënten is niet enkel te wijten aan de lengte van de CAG-repeat. Er zijn een heleboel andere aspecten die hier een rol in spelen en het moet ons dus niet verwonderen dat het tijd vraagt om al die netwerken te ontrafelen, de precieze functies te ontrafelen. Het onderzoek dat momenteel bezig is - en dat is niet om morgen in het ziekenhuis toe te passen - geeft informatie en misschien nieuwe benaderingen voor de behandeling die op termijn voor de ziekte van Huntington mogelijk is. Een paar basisprincipes. Een stuk DNA wordt afgeschreven en dit afschrift wordt uiteindelijk vertaald in een eiwit. Het eiwit doet het werk. Het DNA wordt beschermd zolang het in de celkern zit en kan dus niet afgebroken worden. De afschriften van het DNA, het RNA, moet vertaald worden, anders breekt het gewoon af, omdat het niet stabiel is. Dit is belangrijk omdat we in het onderzoek gaan trachten tussen te komen in de verschillende stappen van dit proces. Een voorbeeld uit een andere ziekte. Op het X-chromosoom ligt een stuk DNA dat informatie aandraagt voor de aanmaak van een eiwit. Dit eiwit is belangrijk in de functie van spieren. Het is een eiwit dat problemen vertoont in de ziekte van Duchenne, waarbij mannelijke patiënten als ze 15-16 jaar zijn niet meer kunnen staan, in een rolstoel komen en binnen afzienbare tijd overlijden, omdat het eiwit niet normaal functioneert. In normale omstandigheden kennen we het gen. Het wordt afgeschreven en dit afschrift wordt vertaald in een eiwit dat die functie heeft in de spiercellen. Voor de ziekte van Huntington weet je dat in het normale huntington- of huntingtine-gen een reeks CAGherhalingen zitten. Die CAG-herhalingen worden vertaald in glutamines op het niveau van het eiwit. In het afwijkende gen zijn de CAG s veel langer geworden dan normaal. Dat is verantwoordelijk voor het feit dat het afwijkende eiwit dingen begint te doen die het niet verondersteld wordt te doen en dat het ook in stukken wordt afgebroken. Die afgebroken stukken slaan neer en beïnvloeden een heleboel andere eiwitten, waardoor ze niet meer normaal functioneren. Dit maakt het complex. Verschillende netwerken worden verstoord, niet enkel door het afwijkende eiwit, maar door de stukken van dat eiwit dat in de cellen terechtkomt. De vraag die men wil beantwoorden in het onderzoek is: hoe kunnen we beletten dat het afwijkend eiwit in de cellen terechtkomt of kan functioneren? Zo kan je proberen om het afschrijven van het abnormale gen te verhinderen. Het afschrijven van het normale gen mag echter niet verhinderd worden, want als men dat ook verhindert, dan sterft de cel af. Je moet er dus voor zorgen dat het normale gen kan functioneren, maar het functioneren van het afwijkende gen moet belet worden. Je moet dus proberen om het afschrift van het afwijkend gen te verminderen. Men heeft al genen, en dus eiwitten, gevonden die, als ze verminderd worden in activiteit, minder van dat afwijkend eiwit produceren. Men stelt dat vast bij diermodellen, maar het is niet zo simpel om dat te doen bij de mens. 3
Een andere mogelijkheid is om het DNA van dat afwijkend gen, meer specifiek het stuk waar de CAG s in zitten, af te breken, zodat het niet meer afgeschreven kan worden. Het is niet simpel om dit stuk proberen te beletten om in het eiwit terecht te komen. Men kan op dezelfde wijze proberen om te beletten dat het afwijkend eiwit in stukken wordt afgebroken, om zo te voorkomen dat er nog grotere problemen in de cel ontstaan. Ten slotte kan men ook proberen te beletten dat het afschrift van het DNA, het RNA, zou vertaald worden. In het DNA zitten een reeks bouwstenen die toelaten dat een gen afgeschreven wordt. Er zijn dan een heleboel eiwitten die door andere genen worden aangemaakt. Ze zorgen ervoor dat het correct gebeurt. Als je nu sommige van die eiwitten zou kunnen verminderen, dan wordt er minder afschrift, RNA, en ook minder eiwit van het afwijkend gen geproduceerd. Zo zijn er genen gekend die men kan beïnvloeden, zodanig dat er minder afwijkend afschrift, en dus minder afwijkend eiwit geproduceerd wordt. Dit onderzoek is bezig. Men begint dus meer en meer genen te vinden die een invloed hebben, die controleren hoe het huntington-gen wordt afgeschreven. Beletten dat het DNA functioneert, het bij wijze van spreken kapotmaken, ook daar zijn een reeks voorstellen. Een fantastische ontdekking die de jongste jaren is gedaan, is dat er eiwitten zijn die specifiek de volgorde van bouwstenen in het DNA kunnen identificeren. We weten dat de twee helften van het DNA complementair zijn aan elkaar, de A staat tegenover T, de C staat tegenover een G, Het is een mooie complementariteit waardoor de dubbele helix aan elkaar blijft hangen. Men heeft nu gevonden dat er letters in het DNA herkend worden door aminozuren, bouwstenen van eiwitten. Men kan dus nu eiwitten maken waarbij een ganse reeks bouwstenen van eiwitten aan elkaar gehecht worden, wetende welke volgorde in het DNA ze gaan herkennen. Er kunnen dus eiwitten gemaakt worden die specifiek zijn voor een bepaald gen of een bepaald stuk van een gen. Men noemt die eiwitten talens. Deze talens worden in het onderzoek enorm veel gebruikt, omdat men daarmee specifiek delen van het DNA kan aanvallen en kan knippen. Als het DNA kan geknipt worden, dan kan het niet afgeschreven worden en krijg je geen afwijkend eiwit. Men kan dus nu eiwitten maken en die specifiek gaan binden aan het DNA van het huntington-gen zodat die het kunnen knippen. Dit is een zeer mooi onderzoeksdomein en een mooi instrument om in het laboratorium op cellen die gekweekt worden, toe te passen. Maar het is niet evident om ze in de hersenen te krijgen. Het zijn relatief grote eiwitten, die moeten gedragen worden door virussen. Er bestaat een tweede mogelijkheid en dat zijn eiwitten die men ook specifiek kan aanmaken. Deze hebben bepaalde regio s in de bouwstenen die men zinkvingers noemt, omdat ze gelijk vingers in het DNA gaan haken en die precies zoals die talens kunnen binden aan bepaalde regio s en het DNA daar gaan klieven. Ook dit kan men relatief gemakkelijk produceren. De enige reden waarom men naar een alternatief gezocht heeft, nl. de talens, is omdat dit soort eiwitten onder patent zit. Maar het onderzoek met de talens is dus vrij beschikbaar. Het is dus mogelijk om met eiwitten specifieke regio s in het DNA aan te vallen en af te breken of te beletten dat het afgeschreven wordt of er stukken uit te knippen. Dit geeft een enorme toename van de mogelijkheden in het onderzoek. Er zijn nog andere mogelijkheden. In het DNA zitten regio s. Die worden afgeschreven maar sommige stukken worden er door de cellen uitgeknipt. De cellen weten precies hoe ze dit moeten doen en wat ze nodig hebben. Ze knippen bepaalde stukken bij het overschrijven weg en dit RNA wordt dan vertaald in een ander eiwit, dan wanneer het stuk niet zou weggeknipt zijn. Zo kan je dus met 20 000 genen toch 100 000 verschillende eiwitten maken. Dat principe kan je manipuleren om het resultaat te beïnvloeden. Dit idee komt opnieuw vanuit de behandeling van de ziekte van Duchenne. Men kan dus het knip- en plakwerk van de cel beïnvloeden. Men kan dus zeggen: ik wil een bepaald stuk van het DNA niet afschrijven, omdat er een probleem mee is. Je moet hierbij wel strikt de volgorde van de bouwstenen respecteren. Bij de ziekte van Duchenne zijn er bouwstenen weggevallen. Men wil nu de resterende stukken aan elkaar doen aansluiten, zodanig dat het eiwit korter wordt, maar nog wel functioneert. Ook voor de ziekte van Huntington wil men proberen om bepaalde stukken die worden uitgeknipt, niet af te schrijven of te vertalen, zodat er minder CAG s inzitten of dat de plaatsen waar dat lange eiwit wordt afgebroken, eruitgehaald worden, zodat het eiwit niet kan afgebroken worden. Dit noemt men exon skipping. Een laatste mogelijkheid. Het DNA wordt afgeschreven in RNA en vertaald naar een eiwit. Men weet nu dat van de 98-97 % van het DNA waar de controles zitten, ook afschriften worden gemaakt. Men kan deze nabootsen. Men kan zelf iets maken dat gelijkt op zo een controler en dat kan interageren met het afschrift van het DNA, het RNA, omdat de samenstelling daarvan perfect complementair is. Je ziet dan dat het gaat binden aan het RNA waardoor het RNA niet wordt vertaald maar afgebroken. Als men dit specfiek kan maken voor het lange huntingtine, dan wordt dit niet vertaald en verschijnt het gewoon niet. Dan heb je alleen nog het normale huntingtine dat verschijnt. Het RNA dat je gemaakt hebt en dat je in je cellen brengt aan de hand van virussen, 4
en dit is een van de technische problemen, gaat binden aan het eiwit. Binnen het eiwit komen de normale afschriften van het gen terecht. Als het afwijkende afschrift herkend wordt door het ingebracht RNA, dan stopt dit RNA de vertaling van het foutieve afschrift en komt het gewoon niet tevoorschijn. Het principe is ontwikkeld, maar er moeten virussen gebruikt worden om het in die cellen te brengen. Deze jongste ontwikkeling is tamelijk spectaculair. Dit werkt bij muizen gedurende een aantal weken. Waarschijnlijk moet het dus regelmatig herhaald worden. Er zijn dus verschillende methoden ontwikkeld om te bekomen dat, tenminste in het laboratorium en bij diermodellen, er minder van het afwijkend eiwit wordt geproduceerd. Dit wil natuurlijk niet zeggen dat al de vragen opgelost zijn. Het gebruik van virussen om het in de cellen te krijgen, is zeker een nog op te lossen probleem. Je kan dubbelstrengig sirna maken om het mrna af te breken, maar dit moet met virussen in de cellen worden gebracht. Nu heeft men een methode op punt gesteld om licht gewijzigd enkelstrengig ss-si RNA aan te maken dat vlot door de cellen wordt opgenomen. Men kan het aangemaakte RNA in de ventrikels in de hersenen, die gevuld zijn met vocht, inbrengen en ze geraken in de hersencellen waar ze die functie kunnen uitoefenen. Dit lijkt bij diermodellen te werken en het lijkt relatief eenvoudig. Het effect van de behandeling bij de muizen houdt ongeveer 16 weken stand. Dit geeft aan dat er tot nog toe geen technieken ontwikkeld werden die het probleem definitief oplossen. Wat nog moet bewezen worden, is dat deze technieken veilig zijn en geen nevenwerkingen veroorzaken. Er moet nog verder uitgezocht worden dat de constructies die aangemaakt worden om het aangepast eiwit in de cellen te brengen, niet terechtkomen in andere cellen waar ze een negatief effect hebben. Het is zeker zo dat er, dankzij de verbetering van de technologie en het toenemen van de kennis in de genetica, belangrijke stappen in het onderzoek gezet worden.. Verslag: Rita Muyldermans In dit boekje geeft em. prof. Cassiman inzicht in de jongste ontwikkelingen in het domein van de genetica. Het boekje werd uitgegeven bij de uitgeverij Luster, Antwerpen en is verkrijgbaar in de boekhandel tegen de prijs van 14,95 euro 5