Salmonella bij varkens: contaminatiecycli in het slachthuis en de differentiatie van Salmonella enterica stammen op basis van de mnth genexpressie

Salmonella bij varkens: contaminatiecycli in het slachthuis en de differentiatie van Salmonella enterica stammen op basis van de mnth genexpressie Botteldoorn Nadine 18 januari 2006

varkensbedrijf varkenstransport varkensslachthuis virulentie varkensvleesverwerking en distributie interactie met het varken consument Data omtrent de Salmonella besmetting van varkens Bedrijfs-en en slachthuisniveau Contaminatiecycli in het slachthuis Verdere differentiatie van Salmonella enterica stammen met het oog op een gerichtere bestrijding van een sub- populatie van meer varkens-geadapteerde stammen

Inleiding Salmonella Enterobacteriaceae Gram staafje Beweeglijk Facultatief anaëroob H 2 S Lysine en ornithine gedecarboxyleerd Lactose Zoönotische pathogeen

Taxonomie Salmonella 3 species enterica 6 subspecies enterica 2400 serotypes bongori subterranea salamae arizonae diarizonae houtenae indica Nomenclatuur : Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Afgekort : Salmonella Typhimurium en niet S.. Typhimurium

Typering van Salmonella Differentiatie van types, stammen of klonen in een bacterieel species Doel het achterhalen van de oorsprong van een infectie of een contaminatie Fenotypisch Serotypering : volgens volgens Kauffmann-White schema Somatische O-antigenen Flagellaire H-antigenen Kapsel Vi-antigenen Typhimurium, Enteritidis, Derby,.. Faagtypering : voor voor de belangrijkste serotypes DT104, DT193, PT4, PT21 Antibiotica resistentie profiel (ARP)

Typering van Salmonella Genotypisch Niet-PCR gebaseerd PFGE stamniveau PCR gebaseerd Rep-typering REP, BOX, ERIC, GTG 5 serotype AFLP RAPD stamniveau stamniveau Bacteriële suspensie Agarose plug Lyse en wassen Restrictie van DNA Elektroforese Analyse

Salmonellose Virulentie van Salmonella en de gevoeligheid aan externe factoren Fysiologische en immunologische toestand van de gastheer Misselijkheid, diarree, koorts, braken, buikkrampen, hoofdpijn 5% complicaties septicemie 200 doden EU/jaar Infectiedosis: 25-100 KVE s YOPI (young( young, old,, pregnant, immunodeficiënt nt)

Salmonellose in België 15774 gerapporteerde gevallen (1999) 9543 in 2004 10% van de Europese gevallen 60-65% Salmonella Enteritidis en 25% Salmonella Typhimurium

Belangrijkste besmettingsbronnen Eieren en ei-bereidingen bereidingen: : 55-65% Gevogelte: 15-20% Varkensvlees: 15-25% 25% Rundsvlees: : 2% melkpoeder Vis en schelpdieren

Salmonella bij varkens Sub-klinisch Lichte diarree Asymptomatisch Uitscheiden Drager volksgezondheid

Prevalentie van Salmonella bij varkens op hoeveniveau België 27% (CODA, 1998) 14.4% (FAVV,( 2004) Nederland 23% Denemarken 11.4% Ierland 50.8%

Prevalentie van Salmonella in het varkensslachthuis op karkasniveau België 12.6% (FAVV, 2004) 27% (Korsak et al. 1998) Nederland 1.4% Duitsland Denemarken UK 4.7% 9.6% 5.3%

Probleemstelling Voedselveiligheid van belang voor de consument Vrij van chemische contaminanten Vrij van pathogene kiemen Europese richtlijnen safe food van riek tot vork Integrale ketenbewaking voor zoönose Vanaf 2008: afwezigheid van Salmonella bij varkens (Europese Verordening 2160/2003/EG) Microbiologische criteria voor levensmiddelen (Europese Verordening 2073/2005/EG): afwezigheid van Salmonella op varkenskarkassen

Doelstellingen Aanwezigheid van Salmonella bepalen op slachthuisniveau Contaminatiecycli in het slachthuis Detectiemethode voor Salmonella op dierniveau Differentiatie van Salmonella enterica stammen op basis van verschillen in de mnth genexpressie

Experimenteel deel

Doelstellingen Aanwezigheid van Salmonella bepalen op slachthuisniveau Contaminatiecycli in het slachthuis Detectiemethode van Salmonella op dierniveau Differentiatie van Salmonella enterica stammen op basis van verschillen in de mnth genexpressie

Salmonella t.h.v. het slachthuis 5 5 verschillende slachthuizen (A, B, C, D, E) A, C en D twee bemonsteringen (vb A1, A2) A2 en D1 : bemonstering gedurende de volledige slachtdag (28 en 38 bedrijven) andere bemonsteringen: beslag afkomstig van één bedrijf Salmonella-status van de hoeve gekend

Wachthokken * Doden Broeibak Onreine zone Polijsten * Rectaal pistool Reine zone Evisceratie * * Splitten Dikke darm en MLN * Diafragma Veterinaire inspectie * * Ontharen Branden SKG-II klassificatie op basis van de karkaskwaliteit Verdere handelingen op karkassen * Karkasswabs * kar. swabs * Staalnames Snelle koeling (- 25 C) Frigo(4 C) *

Bacteriologisch onderzoek Serologisch onderzoek Omgevingsstalen Overschoenen Slachtgereedschap Individuele dieren Dikke darm Darmlymfeknopen Karkasswabs

Bacteriologisch onderzoek Serologisch onderzoek Omgevingsstalen Overschoenen Slachtgereedschap Individuele dieren Dikke darm Darmlymfeknopen Karkasswabs Individuele dieren Diafragma

Isolatie en identificatie van Salmonella Niet-selectieve aanrijking (BPW) 37 C 24h omgevingsswabs overschoenen 5 g feces 10 g mesenteriale lymfeknopen Rappaport Vassidialis (10 ml) 42 C 24h en 48h Rappaport Vassidialis (2 ml) 42 C 24h en 48h Semi-solid medium Diassalm 42 C 24h XLD 37 C 24h XLD 37 C 24h XLD 37 C 24h Identificatie via Salmonella specifieke PCR

Staal Totaal medium Nr. stalen Gevoeligheid % 100 Diassalm+RV10 ml 100 + RV2 ml Diassalm 1337 95.3 RV 10 ml 1337 84.3 Diassalm+RV10 ml 100 RV 2 ml 240 68.8 Feces Diassalm 345 89.2 RV 10 ml 345 73.8 RV 2 ml 57 45.8

De prevalentie van Salmonella in de omgeving (5) Staal type +/geanalyseerde stalen % positief Wachthokken 11/11 100 Onreine zone 34/37 92 Broeibakwater 0/3 0 Rectaal pistool 1/5 20 Messen 11/41 27 Karkassplitter 3/11 27 Overschoen voor 2/8 25 Overschoen tijdens 55/64 86 Overschoen frigo 4/10 40

De prevalentie van Salmonella bij de varkens (5) Staal type +/geanalyseerde stalen % positief Karkas 138/370 37 Karkas frigo 12/75 16 Feces 65/345 19 M-lymfeknopen 73/346 21 Feces en/of MLK 98/346 28

De Salmonella contaminatie in de verschillende slachthuizen Contamination frequencies 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 A1 A2 B C1 C2 D1 E karkas dikke darm MLK Slachthuis

Salmonella serotypes REP-PCR PCR 25% 8% Omgeving Feces 39.6% Infantis Brandenburg Livingstone Typhimurium Derby London Ohio Anatum Andere 8% 11% Karkas 68% M-Lymfeknopen 38.8% 25%

Karkascontaminatie (5) slachthuizen Omgeving Karkas (138 +) 30 % 70 % Feces (65+) M-Lymfeknopen (73 +)

Salmonella contaminatie in twee commerciële slachthuizen gedurende een volledige slachtdag % positive Positief e Feces /MLK Karkas 40 35 30 25 20 15 10 5 0 A2 X 10% Positief positive 0 1000 2000 3000 geslachte varkens 8 7 6 5 4 3 2 1 0 D1 0 1000 2000 3000 4000 geslachte varkens 25 % van de karkassen besmet 70 % van de karkassen besmet

Verdere differentiatie van de Salmonella isolaten Pulsed field gelelektroforese (PFGE) Antibiotica resistentie profiel (ARP) ampicilline, tetracycline, streptomycine, nalidixine zuur, chloramfenicol en sulfadiazine Salmonella Typhimurium Salmonella Derby Salmonella Ohio % homology PFGE-XbaI PFGE-BlnI XbaI+ BlnI 70 80 90 100 T11/T11a T11/T11 T8/T12 T2/T2a T2/T2 T8/T8 T9 T10 T4/T4 T4/T4a T5 T6 T1 T3

S. London S. Rissen S. Goldcoast Slachthuis A2 16 14 12 10 8 6 4 2 0 25% het corresponderend dier 47% eerder geslachte varkens 28% slachtomgeving Omgeving Karkas Dier S. Ohio S. Livingstone S. Typhimurium T1 S. Typhimurium T3 S. Typhimurium T4 S. Typhimurium T5 S. Typhimurium T6 S. Typhimurium T8 S. Typhimurium T9 S. Typhimurium T11 S. Brandenburg S. Derby D1 S. Derby D2 S. Derby D3 S. Derby D4 S. Infantis S. Virchow nr. of isolates Aantal isolaten

Slachthuis D1 60 50 40 30 20 10 0 4% het corresponderend dier Continue contaminatiebron Aërosol vorming Omgeving Karkas Dier S. 47:Z4Z13:- nr. Aantal of isolates isolaten S. Typhimurium T2 S. Typhimurium T8 S. Typhimurium T10 S. Typhimurium (ND) S. Derby D2 S. Derby D1/D5 S. Derby ND S. Infantis S. Anatum S. Agona S. Panama S. Livingstone

De belangrijkste bronnen voor karkascontaminatie Aanvoer van Salmonella besmette dieren Het varken zelf dat drager is van Salmonella, in combinatie met de evisceratie Besmette dieren die eerder tijdens de dag werden geslacht Besmette slachtomgeving

Serologisch Vleesnat Mixed-ELISA: Salmotype -ELISA Antilichamen detectie (verschillende O antigenen: 1, 4, 5, 6, 7 en 12) 90% van de Salmonella serotypes worden gedetecteerd Lineair verband tussen antilichaamconcentratie en O.D. O.D. 450nm

Cut-off waarden 1,5 y = 0,0231x + 0,1374 OD 450nm 1 0,5 0 * 0 20 40 60 antilichaamconc. % In de kit voorstel om cut-off waarde O.D.% 40 te gebruiken In literatuur wordt ook O.D. % 10 en 20 gebruikt

Level Bacteriologisch Status (aantal varkens) Cut-off<10 Cut-off 10 Cut-off<40 Cut-off 40 varken - (226) 117 109 198 28 + (97) (30%) 25 72 46 51 Totaal 323 142 181 (56%) 244 79 (24.4%) Bacteriologisch status van het individuele dier bepaald op de aanwezigheid van Salmonella in de darm of MLK 24.4% (cut-off 40) 56% (cut-off 10) 17.6% serologisch negatief maar bacteriologisch positief Beste correlatie met het bacteriologisch status wanneer cut-off 40

Besluiten Hoge karkascontaminatie (37%) 28% van de varkens bacteriologisch positief Complexe contaminatiecycli Dier Eerder geslachte dieren Omgeving Tussen de slachthuizen grote variaties Serologisch 24.4% van de individuele dieren positief (cut( cut-off 40) Serologische screening alleen laat niet toe om recent besmette varkens te detecteren (17.6%)

Besluiten Salmonella Typhimurium en Derby meest geïsoleerde soleerde serotypes Salmonella Typhimurium en Derby zijn genotypisch heel divers PFGE ARP 51% van de stammen resistent t.o.v. ten minste 1 antibioticum Salmonella Typhimurium DT104 13.3% (penta-resistent)

Karkascontaminatie reduceren Hygiëne en desinfectie in het slachthuis Uitscheiding van Salmonella doen dalen Bestrijding van de infectie t.h.v. het varkensbedrijf

Binnen serotype Salmonella Typhimurium bestaat er een sterke genetische diversiteit Een specifieke kloon geassocieerd met varkens kon niet worden geïdentificeerd Persisterende stammen : van varkensbedrijf tot in het slachthuis BELANG BELANG VOOR KARKASCONTAMINATIE Niet-persisterende stammen (omgeving van het varkensbedrijf maar niet in het dier)

Doelstellingen Prevalentie van Salmonella op hoeve en slachthuisniveau Contaminatiecyli in het slachthuis Differentiatie van Salmonella enterica stammen op basis van verschillen in de mnth genexpressie

Pathogenese van Salmonella Na opname verschillende barrières res Zure ph Galzouten Adhesie fimbriae Invasie van het darmepitheel en kolonisatie van de darm (Intestinale fase, SPI-1) Overleving van Salmonella in de macrofaag en kolonisatie van de organen (Systemische fase)

Systemische fase Lumen Epitheel Lamina propria Chemotactische factoren Macrofaag Verspreiding naar de organen

Interactie van Salmonella met de macrofaag Salmonella containing vacuole (SCV) Overleving en vermenigvuldiging van Salmonella in de macrofaag Afdoding van Salmonella in de macrofaag De genen van pathogeniciteitseiland 2 spelen hierbij een belangrijke rol

Gastheer Respiratory Burst Zuurstofradicalen Superoxide, waterstofperoxide Fusie Fusie met lysosomen Salmonella Verdedigingsmechanisme SPI-2 Andere genen zoals het mnth (H + -afhankelijk divalent transport eiwit) Enzymen (Mn( Mn-Superoxidedismutase)

De rol van mnth MntH X 2+ X 2+ SOD CAT X 2+ X 2+ X 2+ NRAMP1 Cytoplasm mnth = H + - afhankelijke divalent transporter eiwit bacterieel homoloog van Nramp1 26-29% homologie met Nramp1 Rol in de virulentie bij muizen SCV

Genexpressie van mnth Transcriptie Translatie DNA niveau gen aanwezig bij alle S. enterica stammen mrna niveau? Eiwit niveau

Kwantificatie van de genexpressie Staal RNA cdna PCR set -up Staalname RNA isolatie RT-reverse transcriptase Real time PCR amplificatie Stabiliteit RNA Lyse van de bacteriën Totaal RNA Bewaring DNase behandeling Twee staps reactie Random hexameren Primer design cdna mrna aanwezig Optimalisatie en standaardisatie van de verschillende stappen noodzakelijk

Real-time PCR Meten van de hoeveelheid amplificatieproduct in iedere cyclus van de PCR reactie Standaardcurve 1/2 verdunning van een bepaald cdna Lineair verband tussen Ct waarde en [log 10 concentratie] y=ax ax+b a: een maat voor de reactie-effici efficiëntie (-( 3.2) Ongekend staal: [conc] Ct waarde

Normalisatie De expressie van het gen van interesse wordt uitgedrukt t.o.v. een endogene controle controlegen of huishoudgen Compenseert voor de verschillende hoeveelheden RNA gebruikt in de reactie Constitutief tot expressie tijdens experimentele condities 16S rrna, rpod en het gmk Via genorm wordt de genstabiliteit en de normalisatiefactor berekend

Keuze van de Salmonella stammen Fenotypisch als genotypisch divers Oorsprong Serotype PFGE type Persisterende vs. niet-persisterende stammen

De mnth genexpressie is groeiafhankelijk ng (rescaled) 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 555 min. 585 min. 615 min. 645 min. 675 min. 705 min. 735 min. 765 min. 795 min. 1,00E+10 1,00E+09 1,00E+08 1,00E+07 1,00E+06 cfu/m l groei mnth rpod 16S rrna Time (min)

Invloed van fagosoom vergelijkbare condities op de mnth genexpressie Inducer BHI n=18 Sauton (5µM Fe 2+ ) Monocytes n=14 a n= 11 NI T=0 min 0.053 (±0.021) c 0.157 (±0.069) α 0.086 (± 0.016) b H 2 O 2 0.532 (±0.323)* 5.950 (±4.794)*,δ 0.160 (± 0.053)*,c NI T=45 min 0.062 (±0.027) ND EDTA 0.323 (±0.202)* ND Inductie van de mnth genexpressie H 2 O 2 en EDTA Minimale groeicondities Intracellulair

De mnth genexpressie bij verschillende Salmonella enterica stammen 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 MB 1170 MB 1689 MB 2108 MB 2109 MB 2115 MB 2126 MB 2136 MB 2150 MB 2156 MB 2208 MB 2216 MB 2223 MB 2233 MB 2484 MB 2486 MB 2491 MB 2495 MB 2497 MB 1170 MB 1689 MB 2108 MB 2109 MB 2115 MB 2126 MB 2136 MB 2150 MB 2156 MB 2208 MB 2216 MB 2223 MB 2233 MB 2484 MB 2486 MB 2491 MB 2495 MB 2497 α * α * waterstofperoxide EDTA zonder inductie na inductie Variatie tussen de stammen Geen verband met fenotypische of genotypische eigenschappen van de onderzochte stammen Genormaliseerde mnth expressie

Besluiten mnth genexpressie is groeiafhankelijk Condities die de fagosoom nabootsen induceren de mnth genexpressie Er kon geen sub-populatie populatie van Salmonella persisterende stammen worden geïdentificeerd aan de hand van verschillen in de mnth genexpressie

Algemeen besluit Karkassen sterk besmet met Salmonella Voornamelijk afkomstig van het dier Na verdere differentiatie van de stammen complexere contaminatiecycli Slachthuis identiteit van belang Geen sub-populatie van Salmonella persisterende stammen kon worden geïdentificeerd aan de hand van verschillen in de mnth genexpressie

Bedankt voor uw aandacht