Nederlands Instituut voor Visserij Onderzoek (RIVO) BV Postbus 68 Postbus 77 1970 AB IJmuiden 4400 AB Yerseke Tel.: 0255 564646 Tel.: 0113 572781 Fax.: 0255 564644 Fax.: 0113 573477 Internet:postkamer@rivo.dlo.nl RIVO Rapport Nummer: C048/02 Vergelijking van extractie- en zuiveringsmethoden voor sediment voor analyse met de DR-Calux assay P.E.G. Leonards 1, I. van der Veen 1, M. Lohman 1, E. Felzel 2 en S. Man 2 1 Nederlands Instituut voor Visserij Onderzoek (RIVO) 2 Biodetection Systems b.v. (BDS) Opdrachtgever: Rijksinstituut voor Kust en Zee (RIKZ) Jacobaweg 2 4493 MX Kamperland Project nummer: 76008-29 Contract nummer: 02.074 Akkoord: dr. J. de Boer Afdelingshoofd Milieu en Voedselveiligheid Handtekening: Datum: 30 september 2002 In verband met de verzelfstandiging van de Stichting DLO, waartoe tevens RIVO behoort, maken wij sinds 1 juni 1999 geen deel meer uit van het Ministerie van Landbouw, Natuurbeheer en Visserij. Wij zijn geregistreerd in het Handelsregister Amsterdam nr. 34135929 BTW nr. NL 808932184B09. Aantal exemplaren: 15 Aantal pagina's: 11 Aantal tabellen: 2 Aantal figuren: 2 Aantal bijlagen: 2 De Directie van het RIVO Is niet aansprakelijk voor gevolgschade, alsmede voor schade welke voortvloeit uit toepassingen van de resultaten van werkzaamheden of andere gegevens verkregen van het RIVO; opdrachtgever vrijwaart het RIVO van aanspraken van derden in verband met deze toepassing. Dit rapport is vervaardigd op verzoek van de opdrachtgever hierboven aangegeven en is zijn eigendom. Niets van dit rapport mag weergegeven en/of gepubliceerd worden, gefotokopieerd of op enige andere manier zonder schriftelijke toestemming van de opdrachtgever.
pagina 2 van 11 RIVO rapport C048/02 Inhoudsopgave: Inhoudsopgave:... 2 Voorwoord...3 Samenvatting... 3 1. Inleiding...4 2. Doelstelling... 4 3. Werkwijze... 4 4. Resultaten... 6 4.1 Soxhlet-multilayer vs. ASE-silica... 6 4.2 Soxhlet-multilayer vs. ASE-multilayer... 6 4.3 ASE-silica vs. ASE-multilayer... 78 5. Discussie... 9 6. Conclusies... 10 7. Referenties... 10
RIVO rapport C048/02 pagina 3 van 11 Voorwoord In deze studie worden extractie- en zuiveringsmethoden voor sediment die gebruikt worden voor de DR-Calux vergeleken om eventuele verschillen in de DR-Calux respons te achterhalen. Het onderzoek werd in opdracht van het Rijksinstituut voor Kust en Zee (RIKZ) door het RIVO en door Biodetection Systems (BDS) uitgevoerd. Het project werd vanuit het RIKZ begeleid door C. Schipper, J. Jorritsma en H. Klamer, en bij het RIVO door P. Leonards. In dit rapport worden de resultaten van een laag, midden en hoog met dioxine verontreinigde baggerspecie gepresenteerd. Dank is verschuldigd aan H. Besselink (BDS) voor review van het rapport en S. van der Linden (BDS) voor de werkzaamheden met betrekking tot de DR-Calux. Samenvatting In dit rapport worden de resultaten gepresenteerd van een onderzoek dat tot doel had het in kaart brengen van eventuele verschillen in de DR-Calux respons tussen verschillende extractieen zuiveringsmethoden van sediment. Drie met dioxine vervuilde baggerspeciemonsters (laag, midden en hoog gecontamineerd) werden in vijfvoud volgens het RIKZ SPECIE-protocol met een Soxhlet apparaat geëxtraheerd en gezuiverd met een multilayer silica gel kolom (Soxhletmultilayer). Ter vergelijking werden in vijfvoud de sedimenten geëxtraheerd met Accelerated Solvent Extraction (ASE) en gezuiverd met de multilayer silica kolom (ASE-multilayer). Daarnaast werden de sedimenten volgens het standaard protocol van BDS, bestaande uit een ASEextractie, zwavelverwijdering met TBA-reagens en een zuivering met zure silica, in vijfvoud opgewerkt (ASE-Silica). Alle extracten werden gemeten met de DR-Calux en de resultaten statistisch verwerkt. De midden gecontamineerde sedimentgroep bevatte een TEQ-gehalte overeenkomstig de voorgestelde CTT norm van 50 pg TEQ/g sediment. Geconcludeerd wordt dat de gemiddelde gehalten in sediment met de ASE methoden maximaal 20% lager tot 15% hoger liggen dan in sediment opgewerkt met het SPECIE protocol. Voor de middengroep (CTT-norm) was de gemiddelde DR-Calux respons significant lager (20%) met de ASE-silica methode dan met de Soxhlet-multilayer methode (SPECIE protocol). Daarnaast is gebleken dat de spreiding in de resultaten voor de ASE-methoden (V.C. 9%-30%) groter zijn dan de spreiding van de resultaten voor de Soxhlet-multilayer silica methode (V.C. 6%-10%). De verhoogde spreiding voor de ASE is mogelijk een gevolg van niet optimale extractieomstandigheden voor dioxinen en PCBs uit sediment en het gebruik van een extra zuiveringstrap (TBA-reagens) om zwavel te verwijderen. Geadviseerd wordt om de ASE
pagina 4 van 11 RIVO rapport C048/02 procedure verder te optimaliseren en de zure silica zuivering/tba reagens stap te vervangen door de multilayer silica kolom. 1. Inleiding Sinds enkele jaren wordt naast de chemische beoordeling van baggerspecie een effectgerichte beoordeling met bioassays uitgevoerd (Stronkhorst et al., 2001). Voor dioxineachtige effecten wordt de DR-Calux gebruikt waarbij de voorgestelde CTT norm 50 ng TEQ/kg sediment zal worden. Voordat een DR-Calux meting uitgevoerd kan worden moeten dioxineachtige verbindingen uit het sediment geëxtraheerd en het extract gezuiverd worden. Verschillende extractie- en zuiveringsmethoden komen hiervoor in aanmerking. In het huidige onderzoek wordt nagegaan of er eventuele verschillen in de DR-Calux respons van sediment geëxtraheerd volgens het RIKZ SPECIE protocol met Soxhlet (Schipper en Stronkhorst, 1999) en protocollen waarbij Accelerated Solvent Extraction (ASE) worden gebruikt bestaan. Het sedimentextract werd voor beide protocollen gezuiverd met een multilayer silica gel kolom volgens het SPECIE protocol en ter vergelijking werden ASE-extracten ook gezuiverd met TBA reagens en een zure silica gel kolom. Alle extracten werden gemeten met de DR-Calux. De resultaten werden statistisch verwerkt. 2. Doelstelling Doel van het onderzoek is het in kaart brengen van eventuele verschillen in de DR-Calux respons van sediment dat geëxtraheerd wordt met een Soxhlet dan wel met Accelerated Solvent Extraction (ASE). Het tweede doel van het onderzoek is het vaststellen van eventuele verschillen in de DR-Calux respons als gevolg van de gebruikte zuiveringsmethoden voor sedimentextracten (multilayer silica en zure silica gel). 3. Werkwijze Voor het onderzoek werd gebruik gemaakt van gevriesdroogde baggerspeciemonsters die werden aangeleverd door BDS. Het RIVO heeft drie groepen sediment gemaakt met een laag, midden en hoog dioxinegehalte door individuele monsters samen te voegen en te homogeniseren in een schudapparaat. Het TE-gehalte in de middengroep werd rond de CTTnorm gekozen. In bijlage 1 worden de codes van de afzonderlijke sedimenten per groep weergegeven. Elke groep werd in 15 gelijke porties verdeeld.
RIVO rapport C048/02 pagina 5 van 11 Soxhlet ASE Vijf monsters per groep werden door het RIVO geëxtraheerd met een Soxhlet methode volgens het SPECIE protocol (Peters en Leonards, 2001), en tien monsters werden door BDS geëxtraheerd met een Accelerated Solvent Extraction (ASE) methode volgens BDS-protocol Pe- BDS-013 (Felzel en Chan, 2001). Voor de ASE-methode wordt één extractiecyclus gebruikt. Per groep werden vijf Soxhlet-extracten en vijf ASE-extracten door het RIVO gezuiverd met de multilayer silica kolom volgens het SPECIE protocol. De overige vijf ASE extracten werden door BDS met TBA-reagens behandeld om zwavel te verwijderen volgens BDS protocol Pe-BDS-014c en vervolgens gezuiverd met zure silica volgens BDS-protocol Pe-BDS-005f (Felzel et al., 2001). Alle extracten werden door BDS gemeten met de DR-Calux volgens BDS protocol Pe-BDS-004e (Besselink et al., 2001) en de resultaten werden uitgedrukt in pg TEQ/g droge stof. Schematisch wordt het extractie- en zuiveringsschema voor de afzonderlijke sedimentgroepen weergegeven in figuur 1. TBAreagens Multilayer silica Multilayer silica Zure silica DR-Calux DR-Calux DR-Calux Figuur 1: Extractie- en zuiveringschema voor de sedimentgroepen. De resultaten werden statistisch geanalyseerd met een T-Test (5% significantie niveau). Getest werd of eventuele verschillen in de gemiddelde gehalten toegeschreven kunnen worden aan de verschillende extractie- dan wel zuiveringsmethoden. De nul-hypothese is dat er geen verhoogde of verlaagde gemiddelde gehalten aanwezig zijn tussen de verschillende methoden op het 5% significatieniveau (eenzijdige test). Een Tukey test werd gebruikt om na te gaan welke groepen significant van elkaar verschilde.
pagina 6 van 11 RIVO rapport C048/02 4. Resultaten In tabel 1 worden de DR-Calux responsen voor de verschillende sedimentgroepen per extractieen zuiveringsmethode gepresenteerd. Grafisch worden de gemiddelden en standaard deviaties van de responsen per groep weergegeven in figuur 2. Statistische verschillen tussen de groepen worden weergegeven in tabel 2. In de volgende paragrafen worden de gemiddelde gehalten tussen de verschillende opwerkingsmethoden vergeleken. 4.1 Soxhlet-multilayer vs. ASE-silica Er werden statistisch significante verschillen in de gemiddelde DR-Calux respons gevonden tussen de Soxhlet-multilayer en de ASE-silica methode voor de laag en de midden gecontamineerde sedimentgroepen (tabel 2). Voor de lage sedimentgroep was het gemiddelde gehalte met ASE-silica 15% hoger en voor de middengroep 20% lager dan de gemiddelde gehalten voor de Soxhlet-multilayer. Er werden geen significante verschillen aangetroffen tussen beide methoden voor de hoge sedimentgroep. De Soxhlet-multilayer methode (SPECIE) heeft voor alle sedimentgroepen de laagste spreiding in de gehalten (V.C. 6-10%). De ASE-silica methode (BDS methode) heeft een spreiding van 9-30% in de DR-Calux respons. Opgemerkt moet worden dat één van de monsters van de hoge sedimentgroep een veel hoger gehalte (160 pg TEQ/g) heeft dan de overige vier monsters uit deze groep; een verklaring voor dit feit kan niet worden geven. Indien een DR-Calux respons in sediment rond de CTT norm wordt aangetroffen dient de spreiding van de methode in de beoordeling van het sediment meegenomen te worden. Geconcludeerd wordt dat er significante verschillen tussen de ASEsilica en Soxhlet-multilayer bestaan maar dat de verschillen zowel hoger dan lager kunnen zijn (maximaal 15% hoger en 20% lager). 4.2 Soxhlet-multilayer vs. ASE-multilayer Vergelijking van de resultaten van de Soxhlet-multilayer met de resultaten van de ASE-multilayer geeft informatie over eventuele verschillen in extractie-efficiënties. Een duidelijke trend is waarneembaar in de DR-Calux respons tussen de Soxhlet-multilayer en de ASE-multilayer methoden. Voor alle drie de sedimentgroepen is de gemiddelde DR-Calux respons voor de ASEmultilayer lager dan de gemiddelde DR-Calux respons voor de Soxhlet-multilayer; het verschil van 4% tot 11% tussen de methoden is echter statistisch niet significant. De spreiding van de resultaten voor de ASE-multilayer methode (V.C. 15%-18%) is groter dan voor de Soxhletmultilayer methode (V.C. 6%-10%) maar kleiner dan bij de hierboven besproken ASE-Silica
RIVO rapport C048/02 pagina 7 van 11 methode. Geconcludeerd wordt dat extractie van sediment met de ASE resulteert in een lagere DR-Calux respons dan wanneer sediment geëxtraheerd wordt met de Soxhlet methode. Geadviseerd wordt om de ASE methode te optimaliseren voor de extractie van dioxinen en PCB s uit sediment. 4.3 ASE-silica vs. ASE-multilayer Vergelijking van de resultaten van de ASE-silica en ASE-multilayer methoden verschaft informatie over eventuele verschillen in de DR-Calux respons tussen de zuiveringsmethoden (TBA-zure silica en multilayer silica). Voor het laag gecontamineerde sediment werd een significant lager gemiddelde DR-Calux respons voor de multilayer silica dan voor de zure silica zuivering gevonden. Voor het midden en het hoog gecontamineerde sediment werden geen significante verschillen in de gemiddelde DR-Calux respons tussen de multilayer en zure silica aangetoond. De spreiding in de resultaten voor de ASE-silica (V.C. 9%-30%) is groter dan de spreiding in de resultaten van de ASE-multilayer kolom (V.C. 15%-18%). Geconcludeerd wordt dat het gebruik van de zure silica/tba-reagens zuiveringsmethode een verhoging van spreiding in de resultaten ten opzichte van de multilayer kolom veroorzaakt. Geadviseerd wordt om de zure silica/tba methode te vervangen door de multilayer kolom methode.
pagina 8 van 11 RIVO rapport C048/02 Tabel 1: TEQ-gehalten (pg TEQ/g ds.) voor de drie sedimentgroepen die geëxtraheerd werden met Soxhlet of ASE en gezuiverd met een multilayer silica of een zure silica kolom. Metingen werden uitgevoerd met de DR-Calux. Weergegeven zijn de individuele gehalten, het gemiddelde, de standaarddeviatie (SD) en de variatie coëfficiënt (v.c.). Extractiemethode Soxhlet ASE ASE Zuiveringsmethode Multilayer zure silica Multilayer pg TEQ/g ds pg TEQ/g ds pg TEQ/g ds Laag 5.60 8.44 4.78 7.15 7.55 5.21 7.02 7.17 6.60 7.12 6.94 5.84 6.64 8.43 7.45 Gem. 6.70 7.71 5.98 SD 0.65 0.70 1.07 V.C. 9.7 9.1 18.0 Midden 50.8 43.2 56.8 55.9 44.8 43.5 47.2 39.9 47.4 49.9 23.2 38.1 51.4 52.5 49.4 Gem. 51.0 40.8 47.0 SD 3.1 10.8 7.0 V.C. 6.1 26.6 14.8 Hoog 102 84 76 105 79 109 108 160 104 97 119 105 114 112 112 Gem. 105 111 101 SD 6.3 32.7 14.7 V.C. 6.0 29.5 14.5 Tabel 2: T- en Tukey-test (significantieniveaus) voor gelijkheid van gemiddelden per sedimentgroep tussen de verschillende opwerkingsmethoden. Statistisch significante verschillen (p<0.05) tussen de methoden zijn met een * weergegeven. Laag Soxhlet-multilayer (SPECIE) ASE-Silica (BDS) ASE-multilayer Soxhlet-multilayer (SPECIE) - 0.02* 0.12 ASE-Silica (BDS) 0.02* - 0.01* ASE-multilayer 0.12 0.01* - Midden Soxhlet-multilayer (SPECIE) - 0.04* 0.14 ASE-Silica (BDS) 0.04* - 0.15 ASE-multilayer 0.14 0.15 - Hoog Soxhlet-multilayer (SPECIE) - 0,36 0.29 ASE-Silica (BDS) 0.36-0.28 ASE-multilayer 0.29 0.28 -
RIVO rapport C048/02 pagina 9 van 11 160 140 Soxhlet-Multilayer ASE-zure silica ASE-Multilayer 120 pg TEQ/g sediment 100 80 60 40 20 0 Laag Midden Hoog Figuur 2: Gemiddelde en standaard deviaties van TEQ-gehalten in de drie sedimentgroepen die werden geëxtraheerd met Soxhlet of ASE en gezuiverd met een multilayer silica of zure silica kolom. 5. Discussie De gevonden resultaten komen overeen met recent uitgevoerd onderzoek naar mogelijke verschillen tussen Soxhlet en ASE extracties van gespiked sediment (Leonards en van der Veen, 2001). Uit dit onderzoek bleek dat de extractie-efficiënties van de ASE voor een aantal dioxinen en furanen significant lager waren dan voor de Soxhlet. Het betreft de stoffen OCDD, 1,2,3,4,7,8-H6CDF en 1,2,3,4,6,7,8-H7CDF. Om inzicht te krijgen in de effecten van de lagere extractie-efficiënties van de ASE op het TEQ-gehalte van sediment werd de volgende berekening uitgevoerd. Recent zijn een twintigtal baggerspeciemonsters volgens het SPECIE protocol met Soxhlet opgewerkt en geanalyseerd met GC-MS (Stronkhorst et al., submitted). Voor de twintig sedimenten werd het TEQ-gehalte geschat indien gebruik zou zijn gemaakt van een ASE extractie op basis van de extractie-efficiënties van de dioxinen/furanen voor de ASE, zie bijlage 2. Het geschatte TEQ-gehalte voor de ASE-multilayer is 0,1% tot 8% (gemiddelde 4%) lager dan voor de Soxhlet-multilayer methode, waarbij de grootste bijdrage in het verschil wordt veroorzaakt door 1,2,3,4,7,8-H6CDF. Deze gegevens zijn consistent met de resultaten van het onderhavige onderzoek waarbij voor alle drie de sedimentgroepen een lager TEQ-gehalten (4-11%) voor de ASE-multilayer dan voor de Soxhlet-multilayer werd gevonden.
pagina 10 van 11 RIVO rapport C048/02 6. Conclusies Geconcludeerd wordt dat de gemiddelde gehalten in sediment met de ASE methoden maximaal 20% lager tot 15% hoger liggen dan in sediment opgewerkt met het SPECIE protocol. Voor de laag gecontamineerde sedimentgroep waren de gehalten significant verschillend tussen de methoden. Voor de middengroep (CTT-norm) was de gemiddelde DR-Calux respons significant lager (20%) met de ASE-silica methode dan met de Soxhlet-multilayer methode (SPECIE protocol). Tevens is gebleken dat extractie met de ASE een verhoging van de spreiding in de resultaten tot gevolg heeft, mogelijk veroorzaakt door niet optimale extractieomstandigheden voor dioxinen en PCBs uit sediment en het gebruik van een extra zuiveringstap (TBA-reagens) om zwavel te verwijderen. Geadviseerd wordt om de extractieomstandigheden van de ASE te optimaliseren en de TBAzure silica methode te vervangen door de multilayer silica kolom. 7. Referenties Besselink, H., E. Felzel, A. Jonas, S. van der Linden. 2001. Analysis of Ah-receptor mediated luciferase activity in DR-CALUX cells. Biodetection Systems b.v. Protocol no. Pe-BDS- 004 e. Felzel, E., Y.L. Chan. 2001. Extraction of solid and dried samples by Accelarated Solvent Extraction (ASE). Biodetection Systems b.v. protocol Pe-BDS-013. Felzel, E., Y.L. Chan, A. Jonas. 2001. Sample clean-up for the DR-Calux assay using 14 m diameter chromatography columns. Accelarated Solvent Extraction (ASE). Biodetection Systems b.v. protocol no. Pe-BDS-005f. Felzel, E., Y.L. Chan, A. Jonas. 2001. Sulfur clean-up of sediment extracts for DR-CALUX. Biodetection Systems b.v. protocol no.: Pe-BDS-014c. Peters, R., P.E.G Leonards. Sediment sample extraction and clean-up for the analysis of dioxin and/or dioxin-like compounds using the DR-CALUX bioassay. Draft versie RIKZ, Middelburg. Leonards, P. E. G., I. van der Veen. 2001. Chemische validatie van analysemethoden in sediment voor de toepassing van de DR-CALUX, RIVO rapport nr. C076/01, IJmuiden. Schipper C., J. Stronkhorst, 1999. Handboek SPECIE-07 standaardvoorschrift sediment toxiciteitstest DR-Calux. RIKZ rapport 99.012, Den Haag.
RIVO rapport C048/02 pagina 11 van 11 Stronkhorst, J., C. Schipper, Honkoop, van Essen. 2001. Baggerspecie in zee - hoe regelen we dat verantwoord. RIKZ rapport 2002.030, Den Haag. Stronkhorst, J., P.E.G. Leonards, A.J. Murk (submitted). Using the DR-CALUX in vitro bioassay to screen marine harbor sediments for compounds with a dioxin-like mode of action.
pagina 12 van 11 RIVO rapport C048/02 Bijlage 1: Codes van de baggerspeciemonsters die werden samengevoegd. Code RIKZ Code BDS Lage groep 321682 M-110-626 321690 M-110-645 321676 M-110-621 321681 M-110-648 321689 M-110-644 321684 M-110-641 Midden groep 321966 M-110-780 321665 M-110-628 321941 M-110-760 321986 M-110-804 321940 M-110-759 322016 M-110-842 321974 M-110-790 322003 M-110-825 321942 M-110-761 Hoge groep 321667 M-110-652 321984 M-110-802 321977 M-110-793
RIVO rapport C048/02 pagina 13 van 11 Bijlage 2: TEQ-gehalten (pg TEQ/g dw) in baggerspeciemonsters geëxtraheerd met Soxhlet volgens SPECIE protocol en geanalyseerd met GC-MS. Tevens zijn de geschatte TEQ-gehalte op basis van de extractie-efficiënties van de ASE en de verschillen in gehalten tussen SPECIE protocol en ASE extractie weergegeven. Locatie Soxhlet SPECIE protocol Geschatte gehalte bij ASE extractie Verschil Soxhlet vs. ASE pgteq/g pgteq/g % Rijnmond 19 25.0 24.0 3.7 Rijnmond 60 27.1 25.7 5.3 Rijnmond 75 15.8 15.1 4.1 Scheveningen 0.4 0.4 0.1 Rijnmond 521b 0.6 0.5 6.7 Noordzeekanaal 18 17.8 16.8 5.6 Hansweert 7.6 7.4 2.7 Oesterput 1.0 0.9 8.1 Rijnmond 23 5.9 5.8 2.3 Rijnmond 80 45.7 44.2 3.1 Harlingen 4.8 4.6 3.0 Rijnmond 126 25.9 25.2 2.4 Rijnmond 515 1.6 1.5 7.8 RijnmondNM4 4.3 4.1 4.7 IJmuiden 8.9 8.7 2.8 Den Helder H2 8.6 8.5 2.3 Terneuzen 3.0 2.8 5.3 Delfzijl 9 9.5 8.7 7.8 Lauwersoog 4.9 4.7 3.4 OS kom 20.8 20.6 0.9 Gemiddeld 4.1 SD 2.3 VC (%) 55.3