University of Groningen Mutation detection and correction experiments in epidermolysis bullosa simplex Schuilenga-Hut, Petra Henriette Lidia IMPORTANT NOTE: You are advised to consult the publisher's version (publisher's PDF) if you wish to cite from it. Please check the document version below. Document Version Publisher's PDF, also known as Version of record Publication date: 2002 Link to publication in University of Groningen/UMCG research database Citation for published version (APA): Schuilenga-Hut, P. H. L. (2002). Mutation detection and correction experiments in epidermolysis bullosa simplex s.n. Copyright Other than for strictly personal use, it is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of the author(s) and/or copyright holder(s), unless the work is under an open content license (like Creative Commons). Take-down policy If you believe that this document breaches copyright please contact us providing details, and we will remove access to the work immediately and investigate your claim. Downloaded from the University of Groningen/UMCG research database (Pure): http://www.rug.nl/research/portal. For technical reasons the number of authors shown on this cover page is limited to 10 maximum. Download date: 27-12-2018
Nederlandse samenvatting 111
Dit proefschrift behandelt de diagnose van epidermolysis bullosa simplex (EBS) op DNA niveau en een eerste aanzet tot het ontwikkelen van gentherapie voor deze ziekte. Een korte inleiding op deze twee punten wordt gegeven in hoofdstuk 1. EBS is een erfelijke blaarvormende huidaandoening die bij ongeveer 1 op de 17.000 personen voorkomt. De blaarvorming vindt plaats in de opperhuid of epidermis. In de onderste cellaag van de epidermis, bestaande uit de basale keratinocyten, zorgt een netwerk van keratinefilamenten voor stevigheid. Dit netwerk is opgebouwd uit moleculen van de eiwitten keratine 5 (K5) en keratine 14 (K14). Beide soorten keratinemoleculen bestaan uit een α-helix domein met aan weerszijden een non-helix kop en staart domein. Het α-helix domein is onder verdeeld in de helices 1A, 1B, 2A en 2B waartussen zich drie korte non-helix schakelsegmenten, L1, L12 en L2, bevinden. Op DNA niveau worden de keratine-eiwitten K5 en K14 gecodeerd door de genen keratine 5 (KRT5) en keratine 14 (KRT14). Bij EBS patiënten is vaak een van deze genen gemuteerd, met als gevolg dat het betreffende gen niet meer codeert voor een functioneel eiwit, maar tot een afwijkend eiwit leidt. Dit verstoort de opbouw van het keratine netwerk, waardoor er in de huid een zeer kwetsbare laag ontstaat. Een geringe aanraking van de huid blijkt dan al voldoende voor de vorming van blaren. Zoals in feite alle genen, komen de KRT5 en KRT14 genen in tweevoud voor, één afkomstig van de moeder, het andere van de vader. Doordat aanwezigheid van afwijkend K5 of K14 eiwit al voldoende is voor verstoring van de structuur van het keratine netwerk, erven KRT5 en KRT14 mutaties meestal dominant over. Dit betekent dat het hebben van één mutant KRT5 of KRT14 gen voldoende is om EBS te krijgen. De kans dat de aandoening vervolgens weer wordt doorgegeven aan de volgende generatie is dan bij elke zwangerschap 50%. Het eerste deel van dit proefschrift (hoofdstukken 2, 3 en 4) gaat over genomische mutatieanalyse bij EBS, d.w.z. mutatieanalyse op DNA-niveau. Voor KRT5 bestaat er al zo n mutatie-detectiesysteem. Voor KRT14 wordt genomische mutatieanalyse echter bemoeilijkt door de aanwezigheid van een zeer homoloog 112
Nederlandse samenvatting keratine 14 pseudogen. Omdat dit pseudogen niet tot expressie komt, d.w.z. dat er geen mrna van het pseudogen wordt gemaakt, werd mutatiedetectie bij KRT14 totnogtoe altijd uitgevoerd op RNA, geïsoleerd uit keratinocyten afkomstig van huidbiopten. Voor EBS patiëntjes is het nemen van een huidbiopt een vrij ingrijpende methode. Bovendien is een mutatieanalyse op RNA-niveau veel gecompliceerder dan op DNA-niveau. In dit proefschrift wordt een genomische mutatieanalyse beschreven voor KRT14. Hierbij wordt gebruik gemaakt van restrictie-enzymen die het pseudogen kapot knippen, terwijl het functionele gen ongemoeid wordt gelaten. Vervolgens wordt, net als bij de KRT5 analyse, het functionele gen vermenigvuldigd, totdat er genoeg van is om een DNA-volgorde te bepalen en te zien of daarin een mutatie aanwezig is. De meeste KRT5 en KRT14 mutaties bevinden zich in de gebieden die coderen voor de uiteinden van α-helix domein 1A en 2B en voor het tussen domein L12. Deze gebieden spelen een belangrijke rol bij de vorming van het keratine netwerk. De genomische KRT14 mutatieanalyse is daarom in eerste instantie opgezet voor deze mutatie hotspot gebieden (hoofdstuk 2). Vervolgens is het systeem compleet gemaakt voor het hele KRT14 gen, aangezien er soms ook mutaties buiten de hotspots worden gevonden (hoofdstuk 4). Gebruik makend van dit complete genomische KRT14 mutatie-detectiesysteem in combinatie met de KRT5 mutatieanalyse, hebben we 18 EBS patiënten gescreend op mutaties. In alle patiënten hebben we een mutatie gevonden en wel negen verschillende mutaties in KRT14, waarvan één buiten de hotspot gebieden, en zes verschillende in KRT5, waarvan twee buiten de hotspot gebieden. Een paar keer is dus een zelfde mutatie gevonden. In hoofdstuk 3 wordt een EBS patiënte beschreven die in een mozaïek patroon naast afwezigheid van K14 eiwit in grote delen van de huid ook op enkele plaatsen in haar huid K14 eiwit aanwezig bleek te hebben. Afwezigheid van K14 was het gevolg van een zelfde in beide KRT14 genen voorkomende mutatie, resulterend in een verkeerde splicing van het RNA, waardoor er geen met antilichaam aantoonbaar eiwit meer wordt gevormd. Analyse van mrna geïsoleerd uit keratinocyten van 113
huidgedeelten waarin wel K14 kon worden aangetoond, liet een extra transcript zien dat niet werd gevonden met mrna analyse bij de K14-negatieve keratinocyten. Dit extra transcript codeert voor een abnormaal K14 eiwit met één aminozuur verandering plus een deletie van twee aminozuren. Dit afwijkend K14 eiwit blijkt wel detecteerbaar met K14 antilichaam, maar is niet functioneel. Hoewel er inmiddels redelijk wat bekend is over de oorzaak van de blaarvorming bij EBS, is er geen behandeling beschikbaar voor genezing van deze ziekte. Het tweede deel van dit proefschrift, hoofdstukken 5 en 6, onderzoekt de mogelijkheden voor gencorrectie bij EBS met gebruikmaking van verschillende typen oligonucleotiden, d.w.z. kleine stukjes DNA en/ of RNA. In hoofdstuk 5 wordt de mogelijkheid getest om met behulp van een uit 68 nucleotiden bestaand RNA/DNA oligonucleotide mutant KRT14 te repareren in keratinocyten afkomstig van een patiënt met EBS. Het is echter niet gelukt KRT14 herstel aan te tonen. Daarom hebben we de herstelmogelijkheden in een modelsysteem bestudeerd, zoals beschreven in hoofdstuk 6, waarin we het vermogen van verschillende typen oligonucleotiden onderzoeken om een mutatie in het bacteriële gen LacZ te repareren. Dit gen codeert voor het enzym β-galactosidase, dat in staat is om de kleurloze stof X-gal om te zetten in een blauw gekleurd product. Het mutante LacZ gen heeft een inactief enzymproduct. Door de stof X-gal toe te voegen aan cellen waarin we getracht hebben om LacZ te repareren, kunnen we dus aan de kleur van de cellen zien of LacZ wel of niet gerepareerd is. In blauwe cellen is een gerepareerd LacZ aanwezig, in kleurloze niet. Het LacZ gen ligt op een circulair stukje DNA (plasmide) die we samen met de oligonucleotiden die de mutatie moeten corrigeren kunnen overbrengen in cellen die in kweek zijn (transfecteren). De herstelefficiëntie is zo voor diverse celtypen te bepalen. Voor de herstelexperimenten hebben we gebruik gemaakt van een uit 68 nucleotiden bestaand RNA/DNA oligonucleotide, een uit 54 nucleotiden bestaand enkelstrengs DNA fragment en een uit 509 nucleotiden bestaand enkelstrengs of dubbelstrengs DNA fragment. Alleen met de langste DNA fragmenten zijn we er in geslaagd om LacZ te repareren. Deze DNA fragmenten zijn zo ontworpen, dat ze enerzijds de 114
Nederlandse samenvatting LacZ mutatie repareren en anderzijds een handtekening zetten op de plasmide, d.w.z. een tweede mutatie aanbrengen op DNA niveau die verder niet van invloed is op de activiteit van het eiwit. In 27% van getransfecteerde Chinese hamster ovariumcellen kon gerepareerd LacZ worden aangetoond. Er is geen verschil in herstelefficiëntie tussen de enkelstrengs en de dubbelstrengs fragmenten. Ondanks een herstelefficiëntie van 27% in de getransfecteerde Chinese hamster ovariumcellen bleek van alle plasmiden slechts 0.03% hersteld. Het is aannemelijk dat iedere cel heel veel plasmiden bevat en dat herstel van de mutatie in maar één van de plasmiden al tot blauwkleuring van de cel leidt. In 40% van de gerepareerde plasmiden was de handtekening gezet. Dit betekent, dat het inderdaad de DNA fragmenten zijn geweest die gezorgd hebben voor het herstel van LacZ. In vervolgexperimenten met keratinocyten waarin we zowel mutant KRT14 als mutant LacZ wilden repareren, konden we echter geen herstel bewerkstelligen. Onze resultaten duiden erop, dat de efficiëntie van herstel niet alleen afhangt van het type oligonucleotide, maar ook van het celtype waarin het herstelproces moet plaatsvinden. In een slothoofdstuk, hoofdstuk 7, volgt een algemene discussie over mutatiedetectie in EBS en de invloed van de gedetecteerde KRT5 en KRT14 mutaties op de vorming van het keratinenetwerk en daarnaast over het uitzicht op gencorrectie bij EBS. 115
116