Membrane reconstitution and functional analysis of a sugar transport system Knol, Jan

Transcriptie

1 University of Groningen Membrane reconstitution and functional analysis of a sugar transport system Knol, Jan IMPORTANT NOTE: You are advised to consult the publisher's version (publisher's PDF) if you wish to cite from it. Please check the document version below. Document Version Publisher's PDF, also known as Version of record Publication date: 1999 Link to publication in University of Groningen/UMCG research database Citation for published version (APA): Knol, J. (1999). Membrane reconstitution and functional analysis of a sugar transport system Groningen: s.n. Copyright Other than for strictly personal use, it is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of the author(s) and/or copyright holder(s), unless the work is under an open content license (like Creative Commons). Take-down policy If you believe that this document breaches copyright please contact us providing details, and we will remove access to the work immediately and investigate your claim. Downloaded from the University of Groningen/UMCG research database (Pure): For technical reasons the number of authors shown on this cover page is limited to 10 maximum. Download date:

2 Samenvatting voor niet-biologen (Dutch) Alhoewel bacteriën vaak negatief in de publiciteit komen als ziekteverwekkers zijn ze van essentieel belang voor al het leven op aarde. Ons lichaam bijvoorbeeld bevat keer meer bacteriële cellen dan lichaamscellen en deze bacteriën (meer dan 400 soorten) zijn van groot belang voor onze gezondheid. Ook worden bacteriën al eeuwenlang ingezet voor het maken van voedingsproducten, zoals bijvoorbeeld: yoghurt, kaas, en wijn. Omdat bacteriën eencellig zijn, over het algemeen snel groeien, en een relatief eenvoudige celopbouw hebben, worden ze door veel onderzoekers gebruikt voor het bestuderen van belangrijke biologische processen, en in een aantal biochemische opzichten verschillen bacteriën niet eens zo veel van bijvoorbeeld de mens. Ook bacteriën moeten eten. Voedingsstoffen moeten worden opgenomen om te voorzien in de energiebehoefte en biosynthese, en de eindproducten moeten worden uitgescheiden. Streptococcus thermophilus en Lactobacillus bulgaricus bijvoorbeeld groeien bij voorkeur in melk, waar melksuiker (lactose) in relatief hoge concentraties aanwezig is. Dit melksuiker wordt opgenomen en omgezet in melkzuur wat vervolgens door de cel wordt uitgescheiden. Het omzetten van lactose levert de energie voor het groeien (delen) van de bacteriën. Door de verzuring van de melk beginnen de eiwitten in de melk te klonteren en ontstaat de specifieke textuur van yoghurt. Aangezien de bacteriën ook de aanwezige eiwitten gedeeltelijk afbreken ontstaat bovendien de smaak die yoghurt zo populair heeft gemaakt. Bacteriën bestaan uit een omhulsel (een membraan en een soort celwand) met daarin alle erfelijke informatie (het DNA) en de enzymen (eiwitten die biochemische reacties uitvoeren) die het mogelijk maken om te overleven en te groeien. Hoe bacteriën voedsel de cel in transporteren is een belangrijk onderwerp van studie. Het is bekend dat in de cytoplasma-membraan transporteiwitten aanwezig zijn die stoffen (bijvoorbeeld lactose) van buiten naar binnen kunnen transporteren en eiwitten die afvalproducten weer kunnen uitscheiden. Een eiwit is opgebouwd uit specifieke bouwstenen (aminozuren) die in een door het DNA bepaalde volgorde aan elkaar worden gezet als een soort kralenketting. Deze aminozuurvolgorde en de manier waarop de streng van aminozuren is opgevouwen zijn bepalend voor de structuur, de specificiteit en de activiteit van het eiwit. Hoe transporteiwitten precies werken is nog onduidelijk. Van veel eiwitten die aanwezig zijn in de cel hebben we een veel beter idee hoe ze werken en dat komt omdat we van deze eiwitten kristallen kunnen maken. Kristallen zijn geordende structuren (denk aan kristalsuiker of de ijsbloemen die in de winter op de ramen staan) waarin alle eiwitten op dezelfde manier zijn gestapeld. Door deze grote regelmaat kunnen we met behulp van moderne technieken achterhalen wat de exacte structuur van het eiwit is (manier waarop de streng van aminozuren is opgevouwen). Als we weten wat de structuur is kunnen we vaak ook bepalen hoe het eiwit zijn specifieke functie uitvoert. Voor membraaneiwitten bestaat er echter een groot probleem en dat is dat deze eiwitten zeer moeilijk te kristalliseren zijn. Membraaneiwitten zitten in de vetlaag die de cellen omsluit en hebben daardoor andere eigenschappen dan eiwitten die in de cel in een waterige oplossing voorkomen. Het eiwit dat zorgt voor het opnemen van lactose door S. thermophilus (en andere bacteriën) is een aantal jaren geleden ontdekt en werd LacS genoemd. Dit eiwit bleek anders te zijn dan alle tot dan toe bekende transporteiwitten omdat het bestaat uit twee delen. Het ene deel zit in de membraan en zorgt voor het transporteren van lactose terwijl het andere domein, wat aan de binnenkant van de cel zit, de snelheid van transport blijkt te regelen. Het lactose transporteiwit is niet alleen verantwoordelijk voor het opnemen van lactose maar bovendien ook voor het uitscheiden van galactose (afvalproduct).

3 Nederlandse Samenvatting Voor het bestuderen van transportprocessen is een bacterie eigenlijk nog te complex en daarom zijn technieken ontwikkeld die het mogelijk maken de membraan te scheiden van de rest van de cel. Er ontstaan zo membraanblaasjes (zogenaamde vesicles) waarvan al het DNA en alle wateroplosbare eiwitten zijn verwijderd. Met behulp van radioactief lactose zijn transportstudies gedaan in deze vesicles en is duidelijk geworden hoe de energie voor het transport van lactose wordt geleverd. Bacteriën zetten de energie die wordt verkregen door het afbreken van stoffen uit het medium (bijv. lactose) om in een zogenaamde protonen drijvende kracht. Door positief geladen protonen naar buiten te pompen ontstaat er een verschil in elektrische lading en ph (zuurgraad) tussen de binnen- en buitenzijde van de bacteriën. Door dit verschil hebben protonen de sterke neiging om weer naar binnen te willen. Het lactose transporteiwit maakt hiervan gebruik door alleen een proton naar binnen te laten gaan als deze tevens een lactose mee naar binnen neemt. Het transporteiwit is een beetje vergelijkbaar met een sluis in een kanaal. Door de hoge waterstand aan de ene kant ontstaat een stroom naar de andere kant waar een vaartuig gebruik van kan maken om de sluis te passeren. Dit kan alleen als de sluiswachter de sluis op de juiste manier open zet. LacS is een zeer efficiënt sluisje en het transport van het proton en de suiker is strikt aan elkaar gekoppeld. Ook kan dezelfde waterdruk worden gebruikt om een vaartuig van de lage waterstand omhoog te brengen waardoor de sluis in omgekeerde richting gepasseerd kan worden. Hetzelfde geldt voor een cel die de hoge concentratie protonen kan gebruiken om met behulp van sluisjes in het membraan specifiek stoffen door te laten. Een membraaneiwit is echter een erg klein sluisje en om het exacte werkingsmechanisme van deze eiwitten toch te kunnen bestuderen zijn een aantal specifieke technieken ontwikkeld waarvan een aantal in dit proefschrift worden beschreven. In de eerste plaats kunnen uit de literatuur bekende transporteiwitten met een overeenkomstige aminozuurvolgorde en een soortgelijke functie met elkaar worden vergeleken. Uit bepaalde overeenkomsten en verschillen kunnen we afleiden welke delen van het eiwit betrokken zullen zijn bij de functie van elk specifiek eiwit. In hoofdstuk 2 worden een aantal eiwitten beschreven die allemaal suikers (of daar sterk op lijkende stoffen) transporteren. Het valt op dat de verschillende eiwitten op bepaalde posities dezelfde bouwstenen (aminozuren) gebruiken. Op basis van deze waarnemingen worden een aantal uitspraken gedaan over de mogelijke rol van deze zogenoemde geconserveerde aminozuurresiduen. Het is bovendien mogelijk om met recombinant DNA technieken de aminozuurvolgorde van een bepaald eiwit te muteren (veranderen) om vervolgens te bepalen wat het effect van deze verandering op de eiwitactiviteit is. In hoofdstuk drie worden een aantal mutanten beschreven die allemaal een afwijkende transportactiviteit hebben. Op basis van de vaak verstoorde activiteit kunnen we concluderen wat de rol is van de betreffende aminozuren in de transportactiviteit van het eiwit. Op basis van de verkregen informatie wordt in hoofdstuk 3 een model beschreven voor de binding van protonen door LacS. Om het LacS eiwit in meer detail te kunnen bestuderen is het noodzakelijk het eiwit in zuivere vorm in handen te krijgen. Dit betekent dat het eiwit uit de membraan moet worden gehaald, van alle andere componenten moet worden gescheiden, en vervolgens weer moet worden ingebouwd in een artificiële membraan. Deze gedefinieerde membraanblaasjes met daarin een specifiek membraaneiwit noemen we proteoliposomen en deze proteoliposomen zijn uitermate geschikt om de transportactiviteit van het betreffende eiwit te bestuderen. Voor het zuiveren van een membraaneiwit is het vaak noodzakelijk de expressie van het betreffende eiwit te verhogen. Dit betekent dat cellen meer van het eiwit gaan maken dan dat het van nature geneigd is. Met behulp van moderne DNA technologie is het mogelijk eiwitten en varianten daarvan tot verhoogde expressie te brengen. LacS werd in Escherichia coli (een van de meest favoriete

4 Nederlandse Samenvatting bacteriën voor veel onderzoekers) en S. thermophilus (onze meest favoriete bacterie) tot overexpressie gebracht. In de membraan van S. thermophilus bleek ongeveer 25% van alle eiwitten LacS te zijn wat misschien wel 10 keer meer is dan normaal. Bovendien werd het eiwit verlengd met een aantal aminozuren (histidines) wat de zuivering aanzienlijk vergemakkelijkt. Deze extra histidines binden namelijk erg sterk aan een bepaald materiaal dat nikkel ionen bevat waardoor het gescheiden kan worden van alle andere eiwitten die normaal aanwezig zijn in een cel (hoofdstuk 4). Een extra complicatie voor het zuiveren van membraaneiwitten is de membraan. De structuur van membraaneiwitten blijft alleen intact in een lipide (vettige)-omgeving en de activiteit gaat over het algemeen verloren als de lipiden worden verwijderd. Er zijn echter stoffen die de rol van lipiden kunnen overnemen en die het eiwit toch in een wateroplosbare vorm kunnen houden. Dit zijn de zogenaamde detergentia. Met de waterafstotende kant (hydrofoob) binden detergentia aan membraaneiwitten en met de waterminnende kant (hydrofiel) blijven ze in oplossing waardoor detergentia in staat zijn membraaneiwitten uit de lipidenmembraan in oplossing te brengen (solubiliseren). Er zijn veel verschillende detergentia beschikbaar die allemaal subtiel van elkaar verschillende eigenschappen hebben. Een optimaal detergens zorgt dat al het gewenste eiwit uit de membraan in oplossing komt en bovendien dat het eiwit zijn oorspronkelijke structuur behoudt. Niet alleen het detergens maar ook andere factoren zijn vaak bepalend voor de activiteit van het eiwit in de gesolubiliseerde vorm zoals bijvoorbeeld: temperatuur, ph, concentratie van bepaalde zouten, etc. Deze condities zijn in detail bestudeerd voor het LacS eiwit en het is nu mogelijk het eiwit lange periodes actief te houden in de gesolubiliseerde vorm (hoofdstuk 4 en 5). Om de eigenlijke transportactiviteit te kunnen bestuderen moeten de eiwitten weer worden teruggeplaatst in membraanblaasjes. Er zijn een aantal procedures ontwikkeld maar vaak is deze zogenaamde reconstitutie verre van efficiënt en het exacte mechanisme niet bekend. Meestal worden eiwit en lipiden opgelost in detergens waarna het detergens wordt verwijderd en er spontaan membraanvorming optreedt. Hierbij wordt het eiwit vaak niet correct geïnserteerd in de te vormen membraan en dit kan leiden tot aanzienlijk activiteitsverlies. Daarom is voor LacS de reconstitutie geoptimaliseerd met behulp van een meer fundamentele aanpak. Hiervoor werden eerst liposomen gemaakt (membraanblaasjes bestaande uit zuivere lipiden) die vervolgens werden gedestabiliseerd met exact bepaalde hoeveelheden detergens. Dit destabiliseert de lipidenlaag en geeft het eiwit (aanwezig in detergens) de kans om in de membraan te inserteren (hoofdstuk 4). Het blijkt dat verschillende detergentia verschillende optimum condities hebben voor het reconstitueren van bepaalde membraaneiwitten. De in deze studies meest gebruikte detergentia, DDM en Triton X-100, blijken bijvoorbeeld volkomen anders te reageren met liposomen. Beide detergentia zijn in staat de membraanbolletjes op te lossen en bij een voldoende hoge concentratie worden de lipiden waaruit de liposomen bestaan opgelost in detergens. Echter, bij lagere concentraties detergens zijn er verschillen te zien in de structuren die gevormd wordt tussen de lipiden en het detergens. Wanneer Triton X-100 wordt gebruikt blijven de liposomen intact en worden lipiden deeltjes als het ware uit de membraan geweekt. Het gevolg is wel dat de liposomen steeds kleiner worden maar dat deze nog steeds een min of meer normale membraan hebben. Voor Triton X-100 is de concentratie detergens die gebruikt wordt voor de reconstitutie van LacS niet kritisch omdat altijd de essentiële membraanstructuur over een breed concentratiegebied intact blijft (hoofdstuk 5). Wanneer DDM wordt gebruikt voor de solubilisatie van liposomen blijken, bij vergelijkbare concentraties detergens, hele andere structuren gevormd te worden. Deze structuren zijn in detail bekeken met behulp van elektronenmicroscopie (microscoop voor extreme vergrotingen), en er is waargenomen dat de lipiden en DDM onder andere lange, draadachtige, structuren kunnen vormen. Deze structuren zijn niet te vergelijken met een normale membraan en kunnen hierdoor ook geen

5 Nederlandse Samenvatting membraaneiwitten bevatten. Voor de reconstitutie van membraaneiwitten zijn deze structuren dan ook ongeschikt. Wanneer voor de reconstitutie het LacS eiwit wordt toegevoegd aan liposomen die behandeld zijn met verschillende concentraties DDM, wordt de hoogste activiteit gemeten wanneer liposomen worden gebruikt die verzadigd zijn met DDM. Op dit punt zijn de liposomen niet meer intact maar vallen er gaten in de liposomen en ontstaan er ook platte, uitgestrekte, structuren die nog wel uit normale membranen bestaan (hoofdstuk 5). De genoemde structuren zijn belangrijk voor de manier waarop een membraaneiwit inserteert in de membraan tijdens de reconstitutie. Membraaneiwitten zijn vaak niet symmetrisch en omdat het eiwit moet inserteren in een intacte membraan heeft deze vaak de neiging om op de meest makkelijke manier te inserteren; weg van de minste weerstand. Dat deel van het eiwit dat de membraan het makkelijkst kan passeren komt uiteindelijk aan de binnenkant en het domein dat de membraan niet passeert komt aan de buitenzijde van de proteoliposomen. Dit kan betekenen dat alle eiwitdeeltjes met eenzelfde oriëntatie in de proteoliposomen belanden. Dit is met name het geval als voor de reconstitutie Triton X-100 wordt gebruikt omdat hierbij de liposomen intact blijven. Door deze unidirectionele oriëntatie kunnen voor beide zijden van het eiwit de eigenschappen worden bepaald; dat wil zeggen de zijde die in de bacterie aan de binnen- dan wel aan de buitenkant zit. Inderdaad is gebleken uit studies met deze proteoliposomen dat de binding van lactose erg verschilt voor de binnen - en buitenkant van het LacS eiwit (hoofdstuk 4 en 5). Wanneer DDM gebruikt wordt ontstaan open structuren waardoor het eiwit van beide kanten kan inserteren. Hierdoor ontstaat een willekeurige oriëntatie. Omdat het eiwit niet in beide richtingen dezelfde eigenschappen heeft is dit erg belangrijk voor de interpretatie van de transportstudies met de proteoliposomen. De willekeurige oriëntatie verklaart voor een deel de lagere transportactiviteit in proteoliposomen gemaakt met DDM in vergelijking met proteoliposomen gemaakt met Triton X-100. In de Triton X-100 proteoliposomen heeft het eiwit zijn meest efficiënte kant aan de buitenzijde georiënteerd. Omdat de transportproeven worden uitgevoerd met lage concentraties lactose is dit erg belangrijk. In het geval van DDM heeft de helft van de eiwitten de minder efficiënte kant aan de buitenzijde georiënteerd en hierdoor levert 50% van het eiwit geen significante bijdrage aan het gemeten lactose transport (hoofdstuk 5). Een andere reden voor de lagere transportactiviteit in de DDM proteoliposomen is de belangrijke rol van de verhouding tussen lipiden en eiwit (Hoofdstuk 6). Het is gebleken dat wanneer relatief meer eiwit wordt gereconstitueerd in dezelfde hoeveelheid lipiden de transportactiviteit per eiwit deeltje dramatisch afneemt. Omdat er in het geval van DDM een aanzienlijk verlies van lipiden optreedt tijdens de reconstitutie ontstaan er proteoliposomen met een minder gunstige verhouding tussen eiwit en lipiden. In het geval van Triton X-100 is dit lipiden verlies verwaarloosbaar en blijft de activiteit van de proteoliposomen maximaal. Het belang van de reconstitutie studies is nogmaals weergegeven in hoofdstuk 7 waarbij een overzicht wordt gegeven van de huidige kennis op het gebied van membraanreconstitutie. Een structurele aanpak en het controleren van elke stap is van groot belang voor het opzetten van reconstitutieprotocollen. Dit is uitermate belangrijk want proteoliposomen zijn immers essentieel voor het bestuderen van gezuiverde membraaneiwitten in hun natuurlijke omgeving. Het efficiënte protocol voor de reconstitutie van LacS zal in de toekomst ongetwijfeld nog zijn vruchten afwerpen en leiden tot nieuwe inzichten in de werking van LacS en andere membraaneiwitten. De kennis opgedaan tijdens de zuivering en reconstitutie van LacS kan tevens worden gebruikt voor het ontwikkelen van nieuwe strategieën voor het kristalliseren van membraaneiwitten.