DNA nanotechnology as a tool to manipulate lipid bilayer membranes Meng, Zhuojun

Transcriptie

1 University of Groningen DNA nanotechnology as a tool to manipulate lipid bilayer membranes Meng, Zhuojun IMPORTANT NOTE: You are advised to consult the publisher's version (publisher's PDF) if you wish to cite from it. Please check the document version below. Document Version Publisher's PDF, also known as Version of record Publication date: 2017 Link to publication in University of Groningen/UMCG research database Citation for published version (APA): Meng, Z. (2017). DNA nanotechnology as a tool to manipulate lipid bilayer membranes [Groningen]: University of Groningen Copyright Other than for strictly personal use, it is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of the author(s) and/or copyright holder(s), unless the work is under an open content license (like Creative Commons). Take-down policy If you believe that this document breaches copyright please contact us providing details, and we will remove access to the work immediately and investigate your claim. Downloaded from the University of Groningen/UMCG research database (Pure): For technical reasons the number of authors shown on this cover page is limited to 10 maximum. Download date:

2

3 Samenvatting Grote inzet is toegewijd aan het gebruik van DNA als bouwsteen in de nanotechnologie door zijn veelzijdige eigenschappen, zoals hoge specificiteit en programmeerbaarheid om complexe structuren te vormen. De snelle ontwikkeling van chemische methodologie is bewezen nuttig te zijn, niet alleen voor de bereiding van ongerepte DNA en RNA, maar ook om basen- of ruggengraatmodificaties van de oligonucleotiden evenals vele analogen te maken. De structurele verscheidenheid is verder uitgebreid van 2D-patronen of 3D-nano-objecten, welke hoofdzakelijk zijn vervaardigd met ongerept DNA, naar DNA-hybriden, zoals hybriden van DNA-nanodeeltjes waaronder anorganische of zachte materialen. In het bijzonder is de fosforamidiet-chemie aangepast voor de modificatie van DNA met hydrofobe polymeren of lipiden, waardoor DNA-amphiphiles worden verkregen. Deze DNA-amphiphiles kunnen worden gebruikt om oppervlakte modificaties op biologische membranen uit te voeren. In Hoofdstuk 2 hebben we een nieuwe strategie vastgesteld voor het verankeren van oligonucleotiden in vesikelmembranen door middel van hydrofobe eenheden aan de nucleobase te bevestigen. De membraanankers worden in de oligonucleotide geïncorporeerd door geautomatiseerde vastefasesynthese waardoor nauwkeurige controle over de positie en het aantal hydrofobe eenheden binnen een DNA-sequentie mogelijk is. Een FRET-systeem werd gebruikt om de integratie en stabiliteit van lipide-dna op het liposomale membraan te bewijzen. Enkelstrengs DNA 114

4 gefunctionaliseerd met vier lipide-gemodificeerde nucleobasen was gedurende ten minste 24 uur stabiel geënt op het membraan van liposomen. Nadat de stabiliteit van lipide-dna in de liposomale dubbellaag was aangetoond, werd lipide-dna geïnduceerde liposoomfusie bestudeerd in Hoofdstuk 3. Het resultaat laat het belang zien van de DNAverankeringsstrategie bij hybridisatie geïnduceerde vesikelfusie, aangezien niet alleen de structurele eigenschappen van de eenheid zelf, maar ook het aantal verankeringseenheden de fusogene eigenschappen bepalen. Er werd gevonden dat de oriëntatie van DNA hybridisatie en het aantal verankeringseenheden een cruciale rol speelden bij liposomale fusie. De rits-georiënteerde hybridisatie is efficiënter dan de niet-rits georiënteerde hybridisatie, wat ondersteunt dat dubbelstrengs DNA vlakbij het vesikeloppervlak de verbonden vesikels in nabijheid zou kunnen brengen om volledige fusie te verbeteren. In de rits-oriëntatie brengt de hybridiseringsgebeurtenis vesikels met complementaire sequenties in hun membranen dichter bij elkaar dan in de non-ritsconfiguratie. In tegenstelling tot vesikels welke gefunctionaliseerd zijn met enkelvoudig verankerd of dubbel verankerd DNA, bleken liposomen welke viervoudigverankerde oligonucleotiden bevatten zeer fusogeen zijn, waardoor een aanzienlijke volledige fusie tot 29% werd bereikt zonder opmerkelijke lekkage, wat mogelijk verband houdt met de hogere affiniteit van een viervoudige-lipide anker in het membraan. Met dit fusiesysteem werden de meest efficiënte fusogene DNA probes tot nu toe geproduceerd. Om de functionaliteit van DNA-gebaseerde vesikels verder uit te breiden, was de studie in Hoofdstuk 4 gericht op de functionalisatie van DNAamphiphiles in een fosfolipide dubbellaag. We onderzochten DNA hybridisatie en de dynamische uitwisseling van DNA sequenties op het oppervlak van liposomen door middel van de toevoeging van DNA sequenties met twee FRET systemen. FRET tussen C594 (acceptor) en U4T18-geënte Rh-DHPE-bevattende (donor) vesikels toonde aan dat DNA hybridisatie op het liposoomoppervlak werd bereikt. Vervolgens werd een 20-mer DNA oligonucleotide geïntroduceerd om U4T18 van C594 te vervangen door volledige hybridisatie. De demontage van C594 uit het 115

5 vesikeloppervlak werd gerealiseerd aangezien C594 aan het liposoom was verbonden met 14 complementaire nucleotiden, terwijl de verwijderingsstreng een duplex vormde waarbij 20 nucleotiden betrokken waren. De hybridisatie-energie voor deze laatste is groter dan voor een 14- mer duplexstructuur. Daarna werd de vrije U4T18 gehybridiseerd met C488, welke een donor is voor Rh-DHPE-bevattende vesikels. Verder werd een DNA-gebaseerd amplificatieproces uitgevoerd op het oppervlak van liposomen met een DNA-probe, M2-Cy3. Een opmerkelijke fluorescentieintensiteit van Cy3 werd verkregen door de DNA-hybridisatie ketenreactie, welke de mogelijkheid van vermenigvuldiging van oppervlaktefuncties uit een enkele DNA-verankeringseenheid op het vesikeloppervlak bevestigde. Aan het eind van het proefschrift werd een complexer membraansysteem gefunctionaliseerd met DNA. In hoofdstuk 5 werd de opname van nucleobase viervoudig-verankerd DNA in de oppervlaktelaag van zebravis embryo's geëvalueerd. De lading verbonden door de supramoleculaire DNA-ketting kunnen omkeerbaar verwijderd worden door gebruik te maken van een verwijderingsstreng, welke door enkel de toevoeging van een DNA-sequentie een zeer milde stimulus vertegenwoordigt wat de levensduur van de vis niet beïnvloedt. Net als op het vesikeloppervlak, hebben we met succes de prestatie van een DNA gemedieerde amplificatieproces op de vissenhuid aangetoond. De hybridisatieketenreactie maakt het mogelijk om meerdere delen op een enkele verankerde DNA-streng toe te voegen, waardoor vermenigvuldiging van ladingen of signalen op het oppervlak mogelijk is. Bovendien toonde het aan dat oppervlakmodificatie door verschillende DNA-nanotechnologie procedures aan modelmembranen in de vorm van liposomen gemakkelijk op het levende dier kon worden overgedragen. Dit maakt het mogelijk om DNA-gebaseerde oppervlakfunctionalisatie procedures en hun eenvoudige en snelle implementatie in zebravis te bepalen. Door de brede toepassing van zebravis als diermodel in de ontwikkeling van geneesmiddelen, toxicologie en nanodeeltjes karakterisatie in levende systemen, geloven wij dat het hier gepresenteerde platform de combinatie van DNAnanotechnologie met levende dieren in staat stelt en efficiënte biobarcoding en in-vivo tracking mogelijk maakt. 116

6 Globaal gezien heeft dit proefschrift aangetoond dat chemische synthese een waardevol hulpmiddel is om functionele DNA-moleculen te produceren om de complexiteit van membraan aanpassingsbenaderingen te verhogen. Dit werd bereikt door modificatie van nucleobasen door hydrofobe eenheden en vastefase synthese om amfifiele DNA strengen te fabriceren. Het doordringen van hydrofobe eenheden op het DNA in het binnenste gedeelte van fosfolipide membranen leidt tot stabiele verankering. Hiermee werd het dynamische proces van vesikelfusie bereikt, wat in de toekomst belangrijk kan zijn voor het synthetiseren van kleine hoeveelheden door het gebruik van de inhoudsmenging van liposomen gevuld met verschillende reactanten te exploiteren. Op dezelfde manier zou de fusiebenadering gebruikt kunnen worden in de context van het actief transporteren van beladen vesikels in cellen. In dit geval zal de DNA hybridisatie leiden tot de fusie van vesikels met celmembranen om ladingen in het cytosol te leveren zonder afhankelijk te zijn van endocytische processen. Men zou zelfs kunnen denken over het overbrengen van dit concept op levende dieren, zoals reeds aangetoond in dit proefschrift voor zebravissen. Het is zonder twijfel dat DNA-amfifielen een groot toekomstpotentieel hebben voor geavanceerde DNAnanotechnologie functies op het gebied van synthetische biologie. 117

7