University of Groningen. Regulation of polarity development in hepatocytes van der Wouden, Johanna

Transcriptie

1 University of Groningen Regulation of polarity development in hepatocytes van der Wouden, Johanna IMPORTANT NOTE: You are advised to consult the publisher's version (publisher's PDF) if you wish to cite from it. Please check the document version below. Document Version Publisher's PDF, also known as Version of record Publication date: 2004 Link to publication in University of Groningen/UMCG research database Citation for published version (APA): Wouden, J. M. V. D. (2004). Regulation of polarity development in hepatocytes: a novel role for oncostatin M Groningen: s.n. Copyright Other than for strictly personal use, it is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of the author(s) and/or copyright holder(s), unless the work is under an open content license (like Creative Commons). Take-down policy If you believe that this document breaches copyright please contact us providing details, and we will remove access to the work immediately and investigate your claim. Downloaded from the University of Groningen/UMCG research database (Pure): For technical reasons the number of authors shown on this cover page is limited to 10 maximum. Download date:

2 SAMENVATTING

3 Nederlande samenvatting Samenvatting Epitheelcellen vormen een belangrijk deel van onze lichaamscellen. Zij verzorgen de bekleding van holle organen en kanalen, zoals bijvoorbeeld in het maag-darmstelsel, de nieren en de lever. De algemene opbouw van epitheel hangt nauw samen met zijn functie om de holte van een orgaan of kanaal en de onderliggende weefsels en/of bloedvaten van elkaar te scheiden. Het epitheel vormt dus een cellaag tussen het lumen en het onderliggende weefsel waarbij de epitheelcellen aan elkaar gekoppeld zijn met verbindingscomplexen of tight junctions (TJ). De tight junctions zorgen niet alleen voor de koppeling tussen cellen maar gaan door tot in de plasmamembraan van de cel waardoor deze in twee afzonderlijke delen wordt opgedeeld: de cel is polair. Het membraandomein dat in contact staat met het lumen wordt de apicale plasmamembraan genoemd, het deel dat in contact staat met het onderliggende weefsel en/of de bloedvaten wordt de basolaterale plasmamembraan genoemd (zie figuur 1). In de lever wordt de apicale membraan ook wel galcanaliculaire membraan (BC) genoemd. De in de lever geproduceerde galzouten worden over de galcanaliculaire membraan getransporteerd, alsmede specifieke vetten, en afgevoerd naar de galblaas. Gal helpt bij de vertering van vetten in de darm. De plasmamembraan bestaat uit lipiden en eiwitten. Grofweg kunnen we drie klassen van lipiden onderscheiden: de fosfolipiden, cholesterol en de (glyco)sfingolipiden. In de plasmamembraan van epitheelcellen zijn deze laatste niet gelijk verdeeld over de beide membraandomeinen. Glycosfingolipiden zijn verrijkt in de apicale membraan waar zij o.a. een rol zouden kunnen spelen bij de bescherming van de plasmamembraan. In de cel worden, vanuit het basismolecuul (precursor) ceramide, de (glyco)sfingolipiden in het Golgi apparaat gesynthetiseerd. Om een specifieke verdeling van sfingolipiden en eiwitten over de membraandomeinen te bewerkstelligen, is een epitheelcel gespecialiseerd in het sorteren en transporteren van membraancomponenten. Voor de sortering van membraancomponenten heeft de cel enkele 166

4 Nederlandse samenvatting Figuur 1: Schematische voorstelling van gepolariseerde HepG2 cellen. Links: Het transport van SM en GlcCer van uit de SAC in controle (CTRL) situaties. Rechts: Het transport van SM en GlcCer na stimulatie met Oncostatin M (OSM) of activatie van protein kinase A (PKA). PM, plasma membraan; BC, gal kanaal; TJ, tight junction; SAC, sub-apicaal compartiment; SM, sfingomyeline; GlcCer, glucosylceramide. sorteringsstations. Simpel gezegd zijn dit intracellulaire membraanstructuren die verschillende soorten blaasjes (vesikels) kunnen afsnoeren die dan met de transportmachinerie naar de juiste locatie vervoerd worden. Een van de belangrijke sorteringscentra in de hepatocyt (de epitheelcel van de lever) is het sub-apicale compartiment (SAC) dat, zoals de naam al aangeeft, vlak onder de apicale plasmamembraan ligt. In dit proefschrift wordt gebruik gemaakt van fluorescerende lipiden zodat hun intracellulaire locatie, sortering en transport kunnen worden gevolgd bij de ontwikkeling van plasmamembraan polariteit. Tijdens de ontwikkeling van de lever is het van belang dat de plasmamembraan polariteit op de juiste manier wordt gevormd en dat die gehandhaafd blijft zodat de functie van de lever niet in gevaar komt. Om de biogenese van de apicale membraan te kunnen bestuderen, is er gebruik gemaakt van een lever cellijn (HepG2), die gekweekt kan worden in het laboratorium en die zich na enige tijd ontwikkelt tot een gepolariseerde cel met een apicaal en basolateraal plasmamembraan 167

5 Nederlande samenvatting domein. Gedurende de ontwikkeling van deze epitheliale morfologie is de sortering van sfingomyeline of galactosylceramide (sfingolipiden) vanuit SAC richting de apicale plasmamembraan (PM) bestudeerd. In een volwassen volledig gepolariseerde HepG2 cel worden sfingomyeline en galactosylceramide vanuit het SAC naar de basolaterale membraan getransporteerd. Een ander sfingolipide, glucosylceramide, wordt in beide situaties vanuit het SAC naar de apicale, canaliculaire membraan getransporteerd. In hoofdstuk 2 wordt de ontwikkeling of biogenese van de apicale plasmamembraan beschreven onder invloed van de cytokine Oncostatin M (OSM) en wordt het effect daarvan op de sortering van het sfingolipide sfingomyeline onderzocht. Een cytokine is een bio-actief eiwitmolecuul dat door cellen wordt afgegeven, en dat specifieke functies heeft op het gebied van cel-communicatie en het gedrag van andere cellen kan beinvloeden. OSM is een cytokine dat behoort tot de familie van de IL-6 cytokines. Deze cytokines, die binden aan specifieke receptoren op het cel oppervlak, hebben naast een eigen, d.w.z. cytokine-specifiek, receptordeel, een gemeenschappelijk receptordeel, het gp130, dat zorgt voor de overdracht van het cytokinesignaal in de cel (signaal transductie). Als HepG2 cellen worden gekweekt in de aanwezigheid van OSM wordt de biogenese van de apicale PM gestimuleerd. Dat wil zeggen dat er meer cellen zijn die een apicale PM vormen en dat de gevormde apicale domeinen groter zijn van omvang dan in cellen die niet behandeld zijn. Dit noemen we hyperpolariteit. Het gp130 receptordeel, dat aanwezig is in de basolaterale PM, is nodig voor het verkrijgen van deze hyperpolariteit. Door binding van OSM aan de receptor vindt er een clustering van gp130 plaats in zogenaamde rafts in de PM waardoor er een platform voor efficiënte signaaltransductie ontstaat. Rafts zijn kleine zwevende plasma membraandomeinen die bestaan uit sfingolipiden en cholesterol. Door cholesterol uit de PM te verwijderen en daarmee de raft-structuur te elimineren, kon worden aangetoond dat raft-associatie van gp130 een vereiste is om hyperpolariteit door OSM te krijgen. 168

6 Nederlandse samenvatting Zoals al eerder is opgemerkt, is de sortering en het transport van sfingolipiden belangrijk voor de gepolariseerde bouw van de PM. Onder standaardcondities (in een optimaal gepolariseerde cel) wordt sfingomyeline naar de basolaterale PM getransporteerd terwijl tijdens de ontwikkeling, dus in jonge sub-optimaal gepolariseerde cellen, sfingomyeline naar de apicale PM wordt gesorteerd. Ook na behandeling met OSM is deze switch in sfingomyeline transport vanuit SAC naar de apicale (i.p.v. naar de basolaterale PM zoals in controle cellen) gevonden. Concluderend kan worden vastgesteld dat OSM de biogenese van de apicale PM stimuleert door signaaltransductie via gp130 op de basolaterale PM en dat OSM een apicaal gerichte transport route activeert die gemarkeerd wordt door sfingomyeline, en dat die transport route specifiek betrokken is bij PM polariteit ontwikkeling. Sfingolipiden spelen niet alleen een rol in de ontwikkeling van de apicale membraan maar zijn ook betrokken bij de celgroei. Vaak zijn beiden verstoord in kanker. In hoofdstuk 3 wordt het effect van sfinganine op zowel celpolariteit als de celdeling beschreven en hoe deze twee effecten met elkaar samen kunnen hangen. Sfinganine is een precursor van sfingolipiden maar is zelf ook een bio-actief molecuul. Bij een remming van de omzetting van sfinganine door Fumonisine B1 (waardoor er dus een hoge concentratie sfinganine in de cel ontstaat) wordt de ontwikkeling van de apicale membraan ernstig geremd, terwijl het aantal celdelingen toeneemt. De celdeling verloopt meestal volgens een strikt plan waarbij verschillende eiwitten interacties met elkaar aangaan. Zo n eiwit is p27 kip1, waarbij een hoge concentratie van dit eiwit zorgt voor blokkade in de fase (G1) vlak voordat het genetisch materiaal (DNA) gesynthetiseerd wordt (S). Er treedt een zogenaamd G1/S blokkade op en de celdelingsnelheid zal afnemen. Cellen in de G1 fase van de celdeling kunnen rijpen (differentiëren). Hieronder valt ook de ontwikkeling van plasmamembraan polariteit. In hoofdstuk 3 wordt beschreven dat cellen behandeld met Fumonisine B1 juist een lage concentratie van het p27 kip1 bezitten, hetgeen een verklaring kan geven voor hun snelle groei. Om de afwezigheid van plasmamembraan polariteit in cellen met een lage 169

7 Nederlande samenvatting sfinganine omzetting te kunnen verklaren, is het transport en de apicale sortering van sfingolipiden onderzocht onder condities waarbij een lage sfinganine omzetting plaatsvindt (en er dus ook een lage expressie is van p27 kip1 ). Uit de experimenten blijkt dat als in Fumonisine B1 behandelde cellen PKA werd geactiveerd, er geen switch plaats vindt van galactosylceramide transport vanuit de SAC naar de BC maar dat galactosylceramide, net als in onbehandelde controle cellen, naar de basolaterale plasmamembraan wordt getransporteerd. Om te kunnen aantonen dat het effect van een lage sfinganine omzetting op het transport van galactosylceramide vanuit SAC naar de BC afhankelijk is van de lage p27 kip1 concentraties in de Fumonisine B1 behandelde cellen, wordt in hoofdstuk 3 nog een experiment beschreven. In dit experiment zijn de cellen weer behandeld met Fumonisine B1 maar daarnaast ook nog met een stof die een hoge p27 kip1 waarde simuleert. Ook in deze cellen is het transport van galactosylceramide bestudeerd na activatie van PKA. De resultaten tonen aan dat hoge p27 kip1 concentraties nodig zijn om galactosylceramide, onder polariteit stimulerende condities (activatie van PKA), vanuit SAC naar de apicale plasmamembraan te transporteren. Om meer inzicht te krijgen in de effecten van een hoge cellulaire p27 kip1 concentratie op de ontwikkeling van plasmamembraan polariteit zijn in hoofdstuk 4 experimenten beschreven waarbij met behulp van gentransfectie de expressie van p27 kip1 verhoogd is. Uit de resultaten kan worden afgeleid dat p27 kip1 HepG2 cellen inderdaad in een G1/S blokkade houdt en dat de levensduur van de cellen toeneemt. Naast het effect op de celdeling heeft p27 kip1 ook een stimulerend effect op de ontwikkeling van plasmamembraan polariteit, vooral tijdens de beginfase van de polariteitontwikkeling. Dat effect kan gelegen zijn in het beïnvloeden van het transport van galactosylceramide (hoofdstuk 3) maar daarnaast kan ook de intracellulaire locatie van p27 kip1 een verklaring geven voor het gevonden effect op de polariteitontwikkeling. Tijdens de beginfase van de ontwikkeling bevindt p27 kip1 zich namelijk op een deel van de plasmamembraan van de cel waar uiteindelijk de apicale membraan zich gaat vormen. In oudere cellen is dit niet meer 170

8 Nederlandse samenvatting waarneembaar. Een aantal verklaringen is mogelijk. Ten eerste kan deze lokalisatie erop wijzen dat p27 kip1 de plaats markeert waar apicaal gericht transport naar toe gedirigeerd moet worden. Een soortgelijk proces vindt plaats in gistcellen. Een andere mogelijkheid kan zijn dat cellen met een asymmetrische verdeling van p27 kip1 migreren en proberen dichter naar elkaar toe te komen. Als derde mogelijkheid kan niet uitgesloten worden dat de cellen op deze manier betere cel-celcontacten kunnen maken die nodig zijn om goede polariteit te vormen. Welke hypothese de juiste is, is op dit moment nog niet duidelijk en verder onderzoek zal dit moeten uitwijzen. In de hoofdstukken 2, 3 en 4 is naar de ontwikkeling van de apicale membraan gekeken waarbij als maat voor polariteit het aantal BC per 100 cellen is genomen. In hoofdstuk 5 is echter gekeken naar het aantal cellen per BC, dat onder geschikte experimentele omstandigheden kan variëren van 2 tot plusminus 5. In de lever vormen hepatocyten samen een kanaal (het galkanaal) doordat alle apicale membraan domeinen in zo n kanaal aan elkaar gekoppeld zijn door middel van tight junctions. Hier kan men dus spreken van een complexe architectuur van het epitheel. In de gebruikte HepG2 kweken is in de meeste gevallen deze complexe architectuur afwezig en delen gemiddeld twee cellen één BC, ook als polariteitontwikkeling gestimuleerd wordt met behulp van OSM. Wanneer HepG2 cellen echter worden behandeld met de stof Y-27632, dan blijken er veel meer dan twee cellen één BC te kunnen delen. Er onstaat dus een meer complexe epitheliale structuur. Y is een stof die de effecten van het enzym Rho kinase remt. Rho kinase is onder andere betrokken bij celmigratie, adhesie en bij de flexibiliteit van het actine skelet in de cel. Om het ontstaan van een complexere epitheliale structuur te kunnen verklaren is naar de vorm van de cellen en naar de lokalisatie van het actine skelet in de cel gekeken. Opvallend was dat cellen behandeld met Y weinig laterale cel-cel contacten vormen en het daardoor voor andere cellen, ruimtelijk gesproken, minder moeilijk is om binnen te dringen en samen te gaan met de cellen die al een BC hebben. Het resultaat is drie cellen die samen één BC delen. Op deze 171

9 Nederlande samenvatting manier kan een vierde en wellicht een vijfde cel volgen waardoor er een heus kanaaltje kan ontstaan. Hoe de remming van Rho kinase bijdraagt aan het ontstaan van deze complexe architectuur van levercellen is op dit moment nog niet geheel duidelijk en verder onderzoek zal moeten uitwijzen wat het achterliggende mechanisme is. Samenvattend: in dit proefschrift worden verschillende aspecten van de ontwikkeling van plasmamembraan polariteit beschreven. Onderzoek naar het ontstaan en de handhaving van polariteit is belangrijk omdat in veel pathologische condities deze ernstig verstoord is. Een veel voorkomende ernstige pathologie is leverkanker waarin zowel de celdeling als plasmamembraan polariteit ontregeld zijn. In dit proefschrift wordt beschreven dat de ontwikkeling van polariteit en de celdeling aan elkaar gekoppeld zijn. Dit soort inzicht in de regulatie van polariteitontwikkeling en celdeling zal wellicht op termijn kunnen bijdragen tot de ontwikkeling van een succesvolle therapie in het gevecht tegen kanker. 172