Academiejaar

Transcriptie

1 FACULTEIT GENEESKUNDE EN GEZONDHEIDSWETENSCHAPPEN Academiejaar Cytotoxiciteit van dentine adhesieven. Een vergelijkende literatuurstudie van de klinische en histologische effecten van dentine adhesieven in de restauratieve tandheelkunde. Bavo VERHOEVEN Promotor: Prof. dr. Peter De Coster Masterproef voorgedragen in de Tweede Master in het kader van de opleiding tot TANDARTS

2 VOORWOORD Deze scriptie is de afsluiting van mijn opleiding tot algemeen tandarts. Dit werk zou niet tot stand gekomen zijn zonder de hulp en steun van vele personen. Daarom zou ik graag van de gelegenheid gebruik willen maken om hen te bedanken. Graag wil ik mijn promotor Prof. dr. Peter De Coster bedanken voor de kans die hij mij heeft gegeven om dit onderwerp te onderzoeken. Met zijn enthousiasme, zijn vele aanwijzingen en het nalezen van mijn scriptie, heeft hij me enorm geholpen. Daarnaast verdienen ook mijn medescriptiestudenten een dankwoord voor de steun en de leuke sfeer. In het bijzonder wil ik mijn ouders bedanken omdat ze mij de kans hebben gegeven deze opleiding te volgen en voor de aangename studieomgeving die ze creëerden. Ook mijn zussen Eva en Clara verdienen een woord van dank voor de hulp bij de lay-out van deze scriptie.

3 INHOUDSTABEL Voorwoord... Abstract Inleiding Wat zijn dentine adhesieven? Historiek Soorten dentine adhesieven Hechting Hechting aan glazuur Hechting aan dentine Chemische samenstelling Monomeren Initiators Inhibitors Organische solventen Vulstof Andere Doelstelling Methodologie Resultaten Diffusie van monomeren Mechanisme van cytotoxiciteit In vitro Setting/modellen

4 4.3.2 Resultaten In vivo Setting/technieken Resultaten Discussie & Conclusie Referenties Bijlagen

5 ABSTRACT Dentine adhesieven hebben sinds hun ontwikkeling een enorme evolutie doorgemaakt en zijn intussen onmisbaar geworden in de hedendaagse restauratieve tandheelkunde. Ondanks hun breed toepassingsgebied is men zich meer en meer bewust geworden van de cytotoxische effecten die deze kunstharsadhesieven kunnen induceren ter hoogte van de pulpa. Het doel van deze scriptie was de cytotoxiciteit van de verschillende soorten adhesieven en hun componenten te vergelijken en tot een conclusie te komen welke adhesieven het meest cytotoxisch zijn. Hiervoor werden in totaal 45 in vitro en in vivo studies over de cytotoxiciteit van dentine adhesieven met elkaar vergeleken. Uit deze studies is duidelijk geworden dat de total-etch adhesieven (etch-and-rinse, E&R) een grotere cytotoxiciteit induceren dan de self-etch adhesieven (SEA). De self-etch adhesieven met een lage ph-waarde ( strong SEA) vertonen bovendien meer cytotoxiciteit dan deze met een hogere ph-waarde ( mild SEA). Van de verschillende componenten waaruit dentine adhesieven zijn samengesteld, zijn vooral de kunstharsmonomeren verantwoordelijk voor cytotoxiciteit. De belangrijkste (co)monomeren kunnen gerangschikt worden van meest naar minst toxisch volgens: UDMA > Bis-GMA > TEGDMA >>> HEMA. Het zijn vooral de kleine hydrofiele (co)monomeren zoals TEGDMA en HEMA die kunnen diffunderen doorheen de resterende dentinewand en cytotoxiciteit induceren wanneer intra-pulpaal een kritische concentratie bereikt is. Pulpa-overkapping met kunstharsadhesieven wordt sterk afgeraden, het is beter om hiervoor het biocompatibele Ca(OH) 2 te gebruiken. In de toekomst is nog meer in vitro en in vivo onderzoek nodig naar de cytotoxiciteit van bondingsystemen en dit volgens internationaal gestandaardiseerde testmethoden

6 1. INLEIDING Zoals de titel al vermeldt, handelt het onderwerp van deze masterproef over de cytotoxiciteit van dentine adhesieven. Is dit nu een onvermijdelijk en nadelig neveneffect van de adhesieve kleeftechniek in de restauratieve tandheelkunde en heeft deze cytotoxiciteit ernstige klinische gevolgen voor de tandpulpa (irritatie en/of necrose) of niet? De meningen in de literatuur zijn hierover verdeeld, al zijn er duidelijke bevestigende resultaten voor de cytotoxiciteit van dentine adhesieven in talrijke in vitro studies. Maar wat is cytotoxiciteit nu precies? MedlinePlus (U.S. National Library of Medicine) beschrijft de term cytotoxisch als toxic to cells. Met andere woorden, dentine adhesieven en andere (tandheelkundige) producten zijn cytotoxisch als ze celdood veroorzaken of hieraan bijdragen. 1.1 Wat zijn dentine adhesieven? Dentine adhesieven worden reeds enkele decennia gebruikt in de tandheelkunde en hebben samen met de composieten voor een (r)evolutie gezorgd binnen de restauratieve tandheelkunde. Met deze materialen werd het immers mogelijk direct aan tandmateriaal (glazuur en dentine) te kleven, zonder dat er een uitgebreide caviteitspreparatie nodig was om voor de nodige retentie van het vulmateriaal te zorgen. Dit is namelijk wel het geval bij de niet-klevende amalgaamvullingen, waardoor er vaak een overbodige hoeveelheid gezond tandmateriaal moet weggenomen worden. De adhesieve kleeftechniek heeft de plaats van de retentieve techniek grotendeels ingenomen en is ondertussen niet meer weg te denken uit de hedendaagse (restauratieve) tandheelkunde. Adhesieven of bondings zijn (met anorganische vulstof) gevulde of ongevulde kunstharsen met een lage viscositeit, die op geëtst glazuur en dentine worden aangebracht teneinde de hechting van composietrestauraties aan tandmateriaal te versterken (1). Deze hechting komt tot stand door een micromechanische retentie waarbij kunstharsuitlopers (zogenaamde - 2 -

7 resin tags ) zich gaan vastzetten in de etsputten van het geëtst glazuur enerzijds, en aan het collageennetwerk van het geëtst dentine anderzijds. Een tweede belangrijke functie van de adhesieven is het vormen van een elastische laag tussen de harde caviteitswand en de krimpende composietrestauratie (1). Hierdoor kan de polymerisatiekrimp van het composiet tot op zeker niveau worden gecompenseerd. Deze compensatie is afhankelijk van de dikte van de laag, evenals de elastische rek en sterkte van het adhesief die kan vergroot worden door het toevoegen van anorganische vulstof. Dit elastisch bonding concept zal de restauratie dus beschermen tegen het losscheuren van de caviteitswand. Zonder deze dempende werking van de adhesieflaag kan een randspleet ontstaan met microlekkage en secundaire cariës tot gevolg. Een derde belangrijke functie van een tandheelkundig adhesief is dan ook het verzorgen van een goede afsluiting van de randspleet tussen caviteitswand en composietrestauratie (1). Zoals boven vermeld kan een inefficiënte afsluiting van de randspleet leiden tot lekkage van bacteriën, wat op termijn leidt tot randverkleuring en secundaire cariës. Dit proces is verantwoordelijk voor het grootste deel van de falingen van composietrestauraties. 1.2 Historiek De basisprincipes van de adhesieve tandheelkunde werden gelegd door Buonocore die in 1955 aantoonde dat de adhesie van kunstharsen aan glazuur kon verbeterd worden door het glazuur vóór applicatie van kunsthars te behandelen met een zuur (2). Deze techniek werd toen al gebruikt in de industrie waarbij metaaloppervlakken opgeruwd werden door middel van fosforzuur (H 3 PO 4 ) om zo een betere adhesie van verf en kunstharscoatings te bekomen. Een tiental jaar later (1963) werd duidelijk dat er een verschil in adhesie optreedt tussen glazuur en dentine (3). Glazuur bestaat namelijk voor 96% uit anorganisch (hydroxyapatietkristallen) en 4% organisch materiaal (amelogenines en non-amelogenines), en is het weefsel met de hoogste mineralisatiegraad van het menselijk lichaam. Dentine daarentegen bestaat slechts voor 70 gew% uit hydroxyapatiet, 20 gew% organisch materiaal (= proteïnen, hoofdzakelijk type-1 collageen) en 10 gew% water. Zowel de organische smeerlaag die ontstaat bij de caviteitspreparatie enerzijds, als de uitstromende dentinevloeistof uit de dentinetubuli (dentinekanaaltjes) anderzijds (4), verhinderen een - 3 -

8 stevige en duurzame hechting van kunsthars aan het hydrofiele dentineoppervlak. Dit verklaart de eerder zwakke hechting van de eerste twee generaties bondingsystemen, waarbij binding aan calciumionen uit de smeerlaag nagestreefd werd. Deze vroege bondingsystemen waren bovendien uitermate onderhevig aan hydrolyse wanneer ze lange tijd in contact werden gebracht met water, met nanolekkage tot gevolg (5). Met het etsen van het dentineoppervlak en het appliqueren van een hydrofiele primer voorafgaand aan het dentine adhesief, trachtte de derde generatie bondings hiervoor een oplossing te bieden (5). De smeerlaag werd gedeeltelijk verwijderd en/of gemodificeerd en de hydrofiele groep van de primermoleculen kon het vochtig dentine infiltreren alvorens een ongevuld adhesief (kunsthars) aan te brengen. Bij de vierde generatie bondings werd de smeerlaag volledig verwijderd door glazuur en dentine gelijktijdig te etsen met 40% fosforzuur gedurende seconden (5, 6). Het eerste etch-and-rinse adhesief kwam op de markt onder de naam Clearfil Bond System F (Kuraray ) in Doch, door deze total-etch techniek werd het dentine overetched en dit resulteerde uiteindelijk in een collaps van de blootgestelde collageenvezels na overmatig drogen van de caviteit (= dry bonding ). Deze dry bonding techniek leidde tot zwakke hechtingssterktes tussen dentine en adhesief en was geassocieerd met dentine sensitiviteit, microlekkage en secundaire cariës. Om deze collaps van collageenvezels te vermijden, dient het dentineoppervlak vochtig te blijven of opnieuw bevochtigd te worden na drogen. Kanca (1992) vond dat water een ideaal hulpmiddel was om het gecollabeerde collageennetwerk te herbevochtigen (= wet bonding techniek) (7). Een nadeel van deze wet bonding techniek is het feit dat de term vochtig dentine moeilijk te definiëren, en voor interpretatie vatbaar is. De collaps van collageenvezels kan teniet gedaan worden door de infiltratie van hydrofiele kunstharsmonomeren uit de primer, met als resultaat de vorming van een hybride laag (Eng.: hybrid layer). Nakabayashi (1982) was de eerste die de vorming van deze hybride laag beschreef en dit werd later bevestigd door andere auteurs (8-10). Het proces van de hybride laag vorming wordt hybridisatie genoemd. De vijfde en zesde generatie bondings trachtten de klinische applicatieprocedure voor de practicus te vereenvoudigen door het ontwikkelen van de one-bottle en self-etching primer systemen (5). Bij deze nieuwe bondingsystemen werden primer en adhesief, respectievelijk etsgel en primer samengevoegd tot één vloeistofsysteem

9 De ontwikkeling van nieuwe bondingsystemen maakte het mogelijk de verschillende componenten (etch, primer en bonding) te combineren in één vloeistofsysteem zodat het aantal applicatiestappen gereduceerd, en dus in theorie een tijdswinst bekomen kon worden. Bovendien zijn deze self-etching systemen minder techniekgevoelig met betrekking tot de vochtigheid van het dentineoppervlak, met als gevolg een verminderde postoperatieve gevoeligheid voor de patiënt. Deze nieuwe systemen staan bekend als de zevende generatie bondingsystemen (one-bottle self-etch adhesives of all-in-one adhesives). Tabel 1.1 De 7 generaties bondingsystemen en hun typische kenmerken. Generatie Periode Kenmerken 1 e generatie Vanaf e generatie Eind jaren 70 begin jaren 80 3 e generatie Midden jaren 80 4 e generatie Eind jaren 80 5 e generatie Midden jaren 90 6 e generatie Eind jaren 90 begin jaren 00 7 e generatie Eind jaren e generatie? Nog in ontwikkeling - Enkel glazuur werd geëtst - Hechting aan de calciumionen van hydroxyapatiet uit de smeerlaag - Hechting zeer gevoelig voor hydrolyse - Zwakke hechting (1-3 MPa) - Toevoeging van Bis-GMA en HEMA vanaf 2 e generatie - Gedeeltelijke verwijdering/ modificatie van de smeerlaag - Glazuur én dentine werden geëtst - Hydrofiele primer - Zwakke hechting - Total-etch techniek - Volledige verwijdering van de smeerlaag - Dry bonding vs. Wet bonding - Vorming van de hybride laag - Reduceren van het aantal applicatiestappen - One-bottle systemen (primer + bonding) - Reduceren van het aantal applicatiestappen - Self-etching systemen (self-etching primer) - Reduceren van het aantal applicatiestappen - All-in-one adhesieven - All-in-one restauraties - Zelfhechtende composieten De dag van vandaag bestaat er een duidelijke trend om adhesieven te ontwikkelen met een uiterst eenvoudige en gebruiksvriendelijke applicatieprocedure voor de practicus. Zo is er de - 5 -

10 dag van vandaag een achtste generatie bondingsystemen in ontwikkeling waarbij adhesief en composietrestauratie in één enkele component vervat zitten. Tabel 1.1 geeft een overzicht van de 7 generaties bondingsystemen. 1.3 Soorten dentine adhesieven Er bestaan momenteel 3 grote groepen van adhesieven: de etch-and-rinse (E&R) adhesieven, de self-etch (SEA) adhesieven en de glasionomeercement (GIC) adhesieven. Deze indeling werd gemaakt door Van Meerbeek et al. (11). De eerste 2 groepen kunnen verder onderverdeeld worden in 3- en 2-step adhesieven, respectievelijk in 2- en 1-step adhesieven naargelang het aantal applicatiestappen van het adhesief. De 3-step adhesieven worden in 3 verschillende stappen geappliqueerd (etch, primer, bonding), terwijl de 1-step adhesieven in 1 enkele applicatiestap aangebracht kunnen worden. De manier waarop hechting bekomen wordt, is verschillend bij de 3 groepen (zie 1.4 Hechting). Bij de etch-and-rinse adhesieven (E&R) wordt door etsen en overvloedig spoelen met water de smeerlaag volledig verwijderd en worden glazuur en dentine oppervlakkig gedemineraliseerd en geïnfiltreerd met kunstharsmonomeren waardoor er een hybride laag ontstaat tussen het adhesief hars en het niet-gedemineraliseerde dentine (8, 12). Deze hybride laag heeft een variabele dikte van ongeveer 2-4 µm. In een (of twee) volgende stap(pen) worden vervolgens primer en bonding aangebracht. Bij de self-etch adhesieven (SEA) daarentegen wordt de smeerlaag slechts gedeeltelijk verwijderd en/of gemodificeerd, en het onderliggend glazuur en dentine gelijktijdig gedemineraliseerd en geïnfiltreerd met kunstharsmonomeren. De hybride laag die bij deze twee processen gevormd wordt (zowel E&R als SEA), is de zwakke schakel van het kleefproces en de grootste oorzaak van faling van composietrestauraties. Deze laag is namelijk permeabel voor bacteriën, met nanolekkage en secundaire cariës tot gevolg. Het risico op nanolekkage is echter lager bij de self-etch adhesieven (13) (zie 1.4.2)

11 Een verdere onderverdeling van de self-etch adhesieven kan gebeuren op basis van de zuurtegraad. Strong self-etch adhesieven hebben een lage ph waarde ( < 1). Hierdoor wordt de smeerlaag volledig opgelost terwijl de kunstharsmonomeren kunnen diffunderen in het gedemineraliseerde dentine. Het hechtingsmechanisme is primair gebaseerd op deze diffusie en dus micromechanische retentie na polymerisatie, vergelijkbaar met de E&R adhesieven. De strong SEA geven dan ook de beste klinische resultaten wat betreft hechtingsterkte (14). Mild self-etch adhesieven daarentegen hebben een hogere ph waarde ( + /- 2) waardoor het dentineoppervlak slechts gedeeltelijk gedemineraliseerd wordt en er residuele hydroxyapatietkristallen aanwezig blijven in een dunne, ondiepe hybride laag. Chemische interactie tussen deze hydroxyapatietkristallen en carboxyl/fosfaatgroepen van de functionele monomeren zorgen voor een additionele adhesie (15, 16). De glasionomeercementen (GIC) zijn glaspolyalkenoaatcementen die al dan niet versterkt zijn met kunstharsmonomeren (kunsthars-gemodificeerde/resin-modified GIC) en worden beschouwd als de enige aan tandweefsel zelf-hechtende materialen in de tandheelkunde (17). Deze adhesieven kunnen niet alleen een micromechanische, maar ook een additionele chemische binding aangaan met glazuur en dentine, evenals met legeringen van onedele metalen. Deze sterke hechting kan bovendien tot stand komen zonder dat een verwijdering van de smeerlaag vereist is. Een korte conditionering van de caviteitswand met een polyalkenoaatzuur is echter wel aan te raden. Deze procedure verwijdert de smeerlaag, demineraliseert het dentine en zorgt voor een expositie van de collageenvezels over een diepte van ongeveer µm. Deze voorbehandeling met een polyalkenoaatzuur resulteert in een verhoogde hechtingsterkte en betere klinische resultaten. De GIC bevatten bovendien fluoride (F - ) die ze op termijn kunnen vrijstellen ter hoogte van de randen van de restauratie. Op deze manier kan het optreden van secundaire cariës gereduceerd worden. 1.4 Hechting Zoals hoger vermeld, kunnen we 3 soorten adhesieven (etch-and-rinse, self-etch en glasionomeer) onderscheiden met elk hun eigen hechtingsmechanisme en verschillende klinische effectiviteit (11, 15). Uit onderzoek blijkt dat de glasionomeren veruit de beste klinische resultaten geven qua hechting en duurzaamheid (15, 18). Bij de kunstharsadhesieven worden de 3-step E&R adhesieven als de gouden standaard aangeduid. Door zijn - 7 -

12 reproduceerbare en betrouwbare in vitro en in vivo klinische prestaties wordt het 3-step E&R adhesief OptiBond FL (Kerr ) beschouwd als de gouden standaard onder de adhesieven (19). Enkel de 2-step SEA kunnen de klinische resultaten van de 3-step E&R adhesieven het best benaderen. De duurzaamheid van 2-step E&R adhesieven is duidelijk minder dan van deze laatste terwijl de 1-step SEA op dit vlak de slechtste klinische resultaten vertonen. Deze stelling wordt onderbouwd door een aantal systematische reviews (15, 18). De hechtingssterkte van adhesieven aan tandmateriaal wordt uitgedrukt in µtbs (micro tensile bond strength) Hechting aan glazuur De micromechanische hechting van kunstharsadhesieven aan glazuur komt tot stand doordat de monomeren kunnen infiltreren in de etsputten (microporiën) van het geëtst glazuur (2, 12). Het glazuuroppervlak wordt klassiek met een 32-37% fosforzuurgel geëtst gedurende seconden waardoor er een poreuze laag (diepte + /- 10 µm) met microporiën ontstaat (20). Bovendien zorgt de etsprocedure ervoor dat de meerderheid van de residuele bacteriën in de geïnfecteerde caviteit gedood worden (18). Aan de etsgel kunnen extra antimicrobiële componenten worden toegevoegd om een maximale desinfectie van de caviteit mogelijk te maken. Voorbeeld van een dergelijke antimicrobiële component is benzalkonium chloride, dat tevens een MMP inhibitor is (zie 1.5.6). Door overvloedig spoelen met water worden de afbraakproducten en resterende etsgel verwijderd. De vorming van kunstharsuitlopers (hybridisatie) wordt geholpen door de capillariteit van de microporiën en de lage viscositeit van het (gevulde of ongevulde) adhesief kunsthars. Polymerisatie van het adhesief zorgt aldus voor een micromechanische verankering aan glazuur Hechting aan dentine De hechting van kunstharsadhesieven aan dentine wordt bemoeilijkt door de complexe structuur en variabele samenstelling, de aanwezigheid van een organische smeerlaag en het hydrofiele karakter van dentine (21). Een toename in diepte van de caviteit en bijgevolg een toename van de dentinetubuli (zie figuur 1.1) en vochtigheid ervan maakt hechting aan dieper gelegen dentine moeilijker dan aan oppervlakkig dentine (4, 21, 22). Een voorbehandeling met etsgel en primer is dan ook noodzakelijk teneinde het dentineoppervlak meer ontvankelijk te maken voor het hydrofobe adhesief. Echter, door de etsprocedure worden de dentinetubuli - 8 -

13 meer opengezet waardoor het tubulair vocht afkomstig van de pulpa vlotter naar het dentineoppervlak kan vloeien (21, 23-25). Figuur 1.1 Toename in aantal en diameter van dentinetubuli van oppervlakkig (A) naar dieper gelegen (B) dentine toe. Het aantal tubuli varieert van 15000/mm 2 ter hoogte van de glazuur-dentine grens tot 65000/mm 2 ter hoogte van de pulpa. De diameter neemt toe van 0.5 µm naar 2.5 µm. (Met toestemming overgenomen uit Bouillaguet et al. (26)) Afhankelijk van het soort bondingsysteem wordt de smeerlaag al dan niet gebruikt in het kleefproces. De smeerlaag (0.5 tot 5µm dik) is een laag organisch slijpafval die door de warmteontwikkeling van de caviteitspreparatie als het ware op het dentine gebakken wordt. Bij de huidige bondingsystemen wordt deze smeerlaag ofwel volledig verwijderd (E&R), ofwel gemodificeerd (SEA). Bij GIC kan hechting zonder verwijdering van de smeerlaag tot stand komen. Het conditioneren van het dentine met een zuur of calcium complexvormer is de eerste stap in het kleefproces en heeft als doel de smeerlaag te verwijderen en het dentine oppervlakkig te demineraliseren. Meestal wordt hiervoor een fosforzuurgel (32-37% H 3 PO 4 ; ph ) gebruikt (18, 20). Hierdoor wordt ter hoogte van het inter- en peritubulair dentine een netwerk van collageenvezels blootgelegd waarin de bifunctionele kunstharsmonomeren van de primer kunnen infiltreren. Deze maken het dentineoppervlak hydrofoob waardoor het kunstharsadhesief zich micromechanisch kan gaan hechten aan het intertubulair en peritubulair collageennetwerk. Deze kunsthars geïnfiltreerde zone is de hybride laag (8)

14 Bij het gebruik van een zelf-etsende primer worden de smeerlaag en het onderliggend dentine over een geringe diepte gelijktijdig gedemineraliseerd en geïnfiltreerd met zure monomeren. De smeerlaag wordt dus niet volledig verwijderd, maar gemodificeerd en betrokken in het hechtingsproces. Doordat de hybride laag over de volledige dikte wordt gedemineraliseerd en geïnfiltreerd, is deze laag minder permeabel voor bacteriën dan bij de etch-and-rinse adhesieven en dus beter bestand tegen nanolekkage (13). Naast deze micromechanische retentie treedt er bij de mild SEA ook nog een additionele chemische hechting op, namelijk door een chemische interactie tussen resterend hydroxyapatiet en functionele groepen van de monomeren. Door het appliqueren van verschillende lagen adhesief op de caviteitswand, kunnen de monomeren en andere componenten van het adhesief beter infiltreren in het gedemineraliseerde dentine. Hierdoor wordt een minder permeabele hybride laag gevormd, waardoor de micromechanische retentie en hechtingsterkte van het adhesief aan de caviteitswand sterk toeneemt. Dit is zowel het geval bij de etch-and-rinse als bij de self-etch adhesieven (27). De hechting van glasionomeercementen aan tandweefsel komt tot stand door een dubbel mechanisme: enerzijds door de micromechanische retentie aan de opgeruwde caviteitswand, anderzijds door een additionele chemische hechting aan hydroxyapatiet. De micromechanische hechting kan vergeleken worden met deze van de kunstharsadhesieven, waarbij GIC componenten penetreren in het blootgelegde collageennetwerk volgens de principes van de hybridisatie. De additionele chemische hechting is het resultaat van een interactie tussen calcium van het hydroxyapatiet en carboxylgroepen van het polyalkeenzuur (17). De carboxylgroepen (COO - ) nemen de plaats in van de fosfaationen (PO 3-4 ) van het hydroxyapatiet en gaan ionbindingen aan met calciumionen. Gemiddeld 67.5% van de carboxylgroepen van het polyalkeenzuur gaan een dergelijke ionbinding aan met hydroxyapatiet (17). 1.5 Chemische samenstelling Klassiek bevatten adhesieven kunstharscomponenten, organische solventen, initiators, inhibitors en soms anorganische vulstof (1). De kunstharscomponenten zijn samengesteld uit

15 dezelfde oligomeer/monomeer systemen als de composieten, namelijk Bis-GMA en/of UDMA verdund met de meer hydrofiele monomeren TEGDMA en/of HEMA. Verschillende soorten oligomeren en monomeren worden in adhesieven verwerkt en diverse combinaties van deze oligomeer/monomeer systemen zijn mogelijk. Waar composieten meestal zijn samengesteld uit steeds dezelfde monomeer combinaties die in het verleden reeds uitvoerig zijn bestudeerd, bevatten adhesieven vaak nog onbekende monomeren. Deze laatste zijn door de verschillende fabrikanten zelf ontwikkeld en beschermd via patenten, waardoor de exacte samenstelling van een dentine adhesief vaak niet gekend is (1). Verschillende componenten van dentine primers en adhesieven worden verondersteld cytotoxische effecten te hebben op de tandpulpa en omgevende weefsels. Vooral de kunstharsmonomeren, maar ook initiators en inhibitors zouden een invloed hebben op de cytotoxiciteit in vivo. De cytotoxiciteit van de verschillende componenten wordt verder besproken (zie 4. Resultaten)

16 Tabel 1.2 Afkortingen van monomeren, initiators, inhibitors en vulstof gebruikt in tandheelkundige primers en adhesieven. Afkorting BEMA BHT Bis-GMA Bis-MA BPA BPDM BPO CQ DDMA DEGDMA DHEpT DMA/DMAEMA E-BPA EG EGDMA GDMA HEMA MA MDP MDPB MEHQ MMA PENTA PMDM PMGDM SiO 2 TCB TEGDMA TEGMMA UDMA Volledige benaming Benzyl methacrylaat Butylhydroxytolueen Bisphenol-A diglycidyl methacrylaat (= Bowen s hars) Bisphenol-A methacrylaat Bisphenol-A Biphenyl dimethacrylaat Benzoylperoxide Camphorquinone Dodecanidiol dimethacrylaat Diethyleenglycol dimethacrylaat Dihydroxyethyl-p-toluidine Dimethylaminoethyl methacrylaat Ethoxylated bisphenol-a Ethyleenglycol Ethyleenglycol dimethacrylaat Glycol dimethacrylaat 2-Hydroxyethyl methacrylaat Methacrylaatzuur 10-Methacryloyloxydodecyl dihydrogeen fosfaat 12-Methacryloyloxydodecyl pyridinium bromide Monoethylether hydroquinone Methylmethacrylaat Dipentaerythritol pentaacrylaat monofosfaat Pyromellitisch dimethacrylaat Pyromellitisch glycerol dimethacrylaat Silicium dioxide l "_acarboxylzuur hydroxyethyl methacrylaatester Triethyleenglycol dimethacrylaat Triethyleenglycol monomethacrylaat Urethaan dimethacrylaat

17 1.5.1 Monomeren De kunstharsmonomeren kunnen beschouwd worden als de belangrijkste componenten van het adhesief, aangezien ze na polymerisatie een netwerk vormen dat structuur en stevigheid verleent aan de adhesieflaag. Dit netwerk is de organische matrix van het gepolymeriseerde adhesief. Algemeen zijn er 2 soorten monomeren te onderscheiden: functionele monomeren met 1 polymeriseerbare en 1 functionele groep (vb. HEMA, MMA), en cross-linking monomeren met 2 of meer polymeriseerbare groepen (vb. TEGDMA, Bis-GMA, UDMA). Deze laatste vertonen na polymerisatie betere mechanische eigenschappen aangezien ze cross-linked polymeren vormen (3-dimensionele matrix), terwijl de functionele monomeren enkel lineaire polymeerketens kunnen vormen. Combinaties van functionele en cross-linking monomeren kunnen eveneens voorkomen: PENTA, BPDM, TCB, PMDM, (zie tabel 1.2 met afkortingen en figuur 1.4). Dit zijn monomeren met meerdere polymeriseerbare en functionele groepen, en behoren zowel tot de groep van de functionele als de cross-linking monomeren (1, 28). POLYMERISEERBARE GROEP SPACER POLYMERISEERBARE GROEP FUNCTIONELE GROEP Figuur 1.2 Algemene structuur van een cross-linking (2 of meer polymeriseerbare groepen, rechtsboven) en functioneel monomeer (functionele groep, rechtsonder). (Aangepast naar Van Landuyt et al. (1)) Monomeren hebben een 3-delige structuur: 1 of 2 polymeriseerbare (vinyl, C=C ) groepen die samen met een functionele groep gebonden zijn aan een spacer-molecule (figuur 1.2). De structuur van de spacer-molecule moet zodanig zijn dat deze 2 of meer polymeriseerbare

18 groepen kan combineren in geval van cross-linking monomeren, en een polymeriseerbare en adhesieve/functionele groep in geval van self-etching/functionele monomeren. De spacer heeft niet enkel een structurele functie, maar beïnvloedt eveneens een aantal specifieke eigenschappen van het monomeer zoals oplosbaarheid, viscositeit, vluchtigheid, bevochtiging en penetratie. Ook na polymerisatie zal de spacer een invloed hebben op de eigenschappen van het gepolymeriseerde adhesief: zwelling en krimp, hydrofiliciteit, flexibiliteit en stijfheid (14). De meest gebruikte polymeriseerbare groepen zijn de acrylaten, en dan voornamelijk de methacrylaten aangezien deze minder reactief zijn. Een nadeel van de acrylaat monomeren is dat de ester groep (R 1 -CO-OR 2 ) gevoelig is voor hydrolyse. In een waterig milieu zullen de acrylaat monomeren gemakkelijk gaan ontbinden met de vorming van twee nieuwe moleculen (vb. HEMA + H2O MA + EG). De methacrylamides daarentegen hebben een amide groep (R 1 -CO-NH-R 2 ) in plaats van een ester groep die meer bestand is tegen deze degradatie door water (1). De functionele groep geeft specifieke eigenschappen mee aan het monomeer en is meestal hydrofiel, terwijl de polymeriseerbare groepen overwegend hydrofoob zijn. Traditioneel worden de functionele monomeren daarom gebruikt in de primer (bevochtigen van het dentine d.m.v. solvent), terwijl de cross-linking monomeren in de bonding gebruikt worden. De meest gebruikte functionele groepen zijn alcohol-, carboxyl- en fosfaatgroepen. Deze laatste twee kunnen eveneens onderhevig zijn aan hydrolyse in een waterige omgeving. De functionele groep kan eveneens gebruikt worden om antibacteriële eigenschappen mee te geven aan het adhesief. Een voorbeeld hiervan is MDPB (12-methacryloyloxydodecyl pyridinium bromide), een monomeer ontwikkeld en gepatenteerd door Kuraray en dat in tegenstelling tot de meeste functionele monomeren overwegend hydrofoob is. Dit antibacteriële monomeer wordt gebruikt in Clearfil Protect Bond. Bij de self-etch adhesieven (SEA) komt nog een derde soort monomeren voor, namelijk de self-etching adhesieve monomeren (14). Deze monomeren combineren een polymeriseerbare groep met een zure adhesieve groep, beiden gekoppeld aan de spacermolecule (figuur 1.3). De zure adhesieve groep kan bestaan uit een carboxyl-, fosfaat-, fosfonaat- of sulfaatgroep. Deze groep zorgt voor het etsen van, en de chemische binding met het tandmateriaal. Self-etching adhesieve monomeren moeten voldoen aan bepaalde

19 eigenschappen om gebruikt te kunnen worden in SEA: ze moeten (a) zuur genoeg zijn om glazuur en dentine te etsen in een relatief korte tijd en een oppervlakte ruwheid te creëren voor micromechanische retentie, (b) het dentine voldoende kunnen bevochtigen voor diffusie en penetratie van de monomeren en (c) een snelle chemische interactie aangaan met componenten van het harde tandweefsel zoals covalente en ionbindingen met collageen en hydroxyapatiet (14). Een voorbeeld van dergelijk adhesief monomeer is MDP (10- methacryloyloxydodecyl dihydrogeen fosfaat), dat gebruikt wordt in adhesieven en adhesiefcementen van Kuraray (vb. Clearfil Protect Bond). POLYMERISEERBARE GROEP SPACER ADHESIEVE GROEP Figuur 1.3 Algemene structuur van een self-etch adhesief monomeer. (Aangepast naar Van Landuyt et al. (1) en Moszner et al. (14)) Onderstaande figuur toont de chemische structuur van de belangrijkste functionele en crosslinking monomeren gebruikt in primers en dentine adhesieven (figuur 1.4). Zowel functionele, cross-linking, als combinaties van beide soorten monomeren zijn in de figuur weergegeven

20 Figuur 1.4 Chemische structuur van de belangrijkste functionele en cross-linking monomeren. Centraal staan enkele monomeren met meerdere polymeriseerbare groepen, en ten minste 1 functionele groep. (Met toestemming overgenomen uit Van Landuyt et al. (1))

21 Aangezien de monomeren uit primers en adhesieven gemakkelijk kunnen diffunderen en cytotoxische effecten hebben op de tandpulpa en omgevende weefsels (zie 4. Resultaten), zijn er adhesieven ontwikkeld die geen hydrofiele monomeren met een laag moleculair gewicht (zoals HEMA en TEGDMA) meer bevatten (29). Een voorbeeld van dergelijk HEMA- en TEGDMA-vrij adhesief is het cmf Adhesive System (3-step E&R, Saremco ). Door het vermijden van hydrofiele monomeren in de samenstelling van bondingsystemen kan de cytotoxiciteit van adhesieven gereduceerd, en misschien zelfs geëlimineerd worden. Mine et al. toonden aan dat dit monomeervrij adhesief uiterst goede klinische resultaten boekt qua hechting en duurzaamheid en dat deze zelfs te vergelijken is met een conventioneel 3-step etch-and-rinse adhesief (controle groep: OptiBond FL, Kerr ) (29). Enkel de hechtingsterkte aan dentine was significant lager dan bij het conventioneel E&R adhesief. De gunstige klinische eigenschappen van een HEMA-vrij adhesief (G-Bond, GC ) worden bevestigd door Van Landuyt et al. (30) Initiators De kunstharsmonomeren in dentine adhesieven polymeriseren via een radicalaire polymerisatiereactie. Initieel wordt deze reactie in gang gezet door specifieke initiators die aanwezig zijn in het adhesief en radicalen kunnen vrijstellen. We onderscheiden fotoinitiators die radicalen afgeven onder invloed van elektromagnetische energie (licht) en redox-initiators die radicalen afgeven door toevoeging van een extra component. Deze initiators worden toegepast in respectievelijk photo-curing en self-curing adhesieven. Een combinatie van deze 2 systemen is eveneens mogelijk, namelijk de dual-curing adhesieven waarbij een initiële polymerisatie bekomen wordt via foto-initiators en een verdere polymerisatie via redox-initiators. Het camphorquinone/co-initiator systeem is de meest gebruikte foto-initiator in zowel composieten als adhesieven. Het breed absorptiespectrum ( nm met maximale absorptie bij 468 nm = blauw licht) van dit systeem maakt het uiterst gebruiksvriendelijk in de tandheelkunde (1). De chemische of redox-initiators worden meestal gebruikt in cementen en adhesieven die in klinische omstandigheden niet optimaal belicht kunnen worden. Deze self- en dual-curing adhesieven zullen dus ook volledig kunnen polymeriseren zonder dat het adhesief over zijn

22 volledige oppervlakte belicht wordt. De meest gebruikte chemische initiator in self-curing adhesieven is benzoylperoxide (BPO). Niet alleen kunstharsmonomeren, maar ook initiators zoals benzoylperoxide en camphorquinone (CQ) worden geassocieerd met cytotoxiciteit van dentine adhesieven (31-34). Deze cytotoxiciteit zou te wijten zijn aan de vrijstelling van vrije radicalen bij activatie van de initiator (zie 4.2), maar ook zonder activatie door irradiatie vertoont CQ cyto- en genotoxische effecten in vitro (34). Deze radicalen kunnen vooral schade veroorzaken ter hoogte van de lipiden celmembraan via lipide peroxidatie. In subtoxische concentraties heeft CQ een invloed op de synthese van enkele structurele membraanlipiden (toegenomen synthese van neutrale lipiden, afgenomen synthese van fosfolipiden). BPO geeft dezelfde effecten wanneer subtoxische concentraties in contact komen met de celmembraan. Deze veranderingen in de samenstelling en structuur van de celmembraan kunnen de oorzaak zijn van een gewijzigde celrespons (32) Inhibitors Inhibitors worden toegevoegd aan adhesieven om te reageren met vrije radicalen die zijn vrijgekomen uit prematuur geactiveerde initiators. Deze activatie kan het gevolg zijn van slechte bewaringsomstandigheden van het ongepolymeriseerde adhesief zoals een te hoge omgevingstemperatuur of blootstelling aan licht. Inhibitors reageren met deze vrije radicalen en verhinderen zo een spontane polymerisatiereactie van kunsthars. Wanneer een zekere kritische concentratie van vrije radicalen overschreden wordt en alle inhibitors hiermee gereageerd hebben, zal toch een spontane polymerisatie kunnen optreden. Echter, wanneer een adhesief of composiet grote hoeveelheden inhibitors bevat, zal het na uitharden een gereduceerde polymerisatiegraad vertonen (1). Butylhydroxytolueen (BHT) is vanwege zijn hydrofobe karakter de meest gebruikte inhibitor in composieten en hydrofobe adhesieven, terwijl monoethylether hydroquinone (MEHQ) meestal zijn toepassing vindt in hydrofiele adhesieven (1). Zowel BHT als MEHQ kan diffunderen uit adhesieven en kan daarom bijdragen aan de cytotoxiciteit van kunstharsen (35, 36)

23 1.5.4 Organische solventen De meest gebruikte solventen in adhesiefsystemen zijn aceton, water en ethanol (1). Deze organische solventen zijn sterk polair en hydrofiele monomeren kunnen er makkelijk in oplossen. Door de combinatie van polair solvent en hydrofiele monomeren wordt de bevochtigingscapaciteit van primer en bonding sterk verbeterd en zal een betere penetratie in het hydrofiele dentineoppervlak tot stand kunnen komen. Deze hydrofiele systemen maken het mogelijk om aan vochtig dentine te hechten (wet bonding techniek). Water, ethanol en aceton kunnen als solvent alleen voorkomen, maar combinaties zijn eveneens mogelijk (vb. water en co-solvent aceton in SEA). De organische solventen vertonen een goede biocompatibiliteit (1) Vulstof Adhesieven zijn niet altijd gevuld met vulstof, waar dit bij composieten per definitie wel het geval is. Anorganische vulstofpartikels worden om verschillende redenen toegevoegd. Door het toevoegen van vulstof aan het adhesief wordt de cohesieve sterkte, de viscositeit van het ongepolymeriseerde adhesief en de elasticiteit van de adhesieflaag verhoogd. Dit laatste zorgt ervoor dat het adhesief de polymerisatiekrimp van het composiet tot op bepaald niveau kan compenseren en het losscheuren van de restauratie kan verhinderen (1). Dit is het zogenaamde elastisch bonding concept. Enkel kleine hoeveelheden vulstofpartikels, meestal SiO 2, met een beperkte grootte kunnen aan het adhesief toegevoegd worden. Dit om de viscositeit van het adhesief en de infiltratie ervan in het collageennetwerk niet negatief te beïnvloeden. De vulstofpartikels mogen een maximale grootte hebben van ongeveer 20 nm, aangezien de interfibrillaire ruimten van het gedemineraliseerde collageennetwerk binnen dezelfde grootteorde liggen. Bij sommige adhesieven zijn nanovulstofpartikels toegevoegd (vb. Prime&Bond NT en Single Bond Plus). Mede omwille van het inerte karakter van puur SiO 2 is dit materiaal zeer geschikt om als vulstof te verwerken in adhesieven. Net als de organische solventen is de anorganische vulstof biocompatibel en draagt aldus niet bij tot de cytotoxiciteit van adhesieven

24 1.5.6 Andere Gedemineraliseerd dentine bevat gebonden matrix metalloproteïnases (MMP s) die, wanneer ze geactiveerd worden door etsen met een zuur, de collageenvezels uit de kunsthars geïnfiltreerde hybride laag geleidelijk aan kunnen gaan degraderen (18). MMP s zijn proteases, dit wil zeggen dat ze proteïnen kunnen afbreken. Het is deze degradatie van de laag tussen caviteitswand en composietrestauratie die verantwoordelijk is voor het fenomeen van nanolekkage en secundaire cariës op lange termijn. De endogene MMP s kunnen geïnactiveerd worden zodat de kans op nanolekkage en secundaire cariës drastisch afneemt. Deze inactivatie kan geschieden door het gedemineraliseerde dentine te behandelen met MMP inhibitors of proteïne cross-linking agentia. MMP inhibitors zijn chelatoren zoals EDTA, en zorgen ervoor dat de MMP s hun tertiaire structuur en hydrolase activiteit verliezen. Deze protease inhibitors kunnen rechtstreeks verwerkt worden in de etsgel waardoor een bijkomende applicatiestap wordt vermeden. Een andere mogelijkheid om MMP s te inactiveren is het gebruik van crosslinking agentia in primers, waardoor ze gehinderd worden in hun moleculaire mobiliteit. Deze interactie is nefast voor hun enzymatische activiteit. Andere voorbeelden van MMP inhibitors zijn chloorhexidine (CHX) en benzalkonium chloride, beide antibacteriële stoffen. Het toevoegen van MMP inhibitors in etsgel en/of cross-linking agentia in primers kan de duurzaamheid van het adhesief en bijgevolg de composietrestauratie drastisch verhogen doordat de degradatie van de adhesieflaag afneemt. Het is dan ook nuttig in de toekomst bondingsystemen te ontwikkelen die standaard deze MMP inhibitors bevatten (18, 21)

25 2. DOELSTELLING Verschillende humane en animale studies hebben aangetoond dat bepaalde monomeren, comonomeren, inhibitors en initiators een cytotoxisch effect hebben op weefselcellen in vitro. In de literatuur bestaat er echter reeds lange tijd discussie over het in vivo klinischsymptomatisch effect van deze toxiciteit. Andere studies uitgevoerd op animale en humane tanden in vivo toonden dan weer geen uitgesproken pulpa inflammatie of weefselnecrose. Uit voorgaande rijst de vraag of, en in welke mate, de bovenvermelde cytotoxische effecten in vivo optreden bij de cellen van de humane tandpulpa en de omgevende weefsels, en welke componenten van adhesieven daar verantwoordelijk voor zijn. Het doel van deze masterproef is de in vitro en in vivo cytotoxiciteit van verschillende soorten dentine adhesieven te vergelijken aan de hand van een literatuurstudie, en tot een besluit te komen welke componenten het meest toxisch zijn voor de humane tandpulpa in vivo, rekening houdend met de talrijke variabele factoren die deze cytotoxiciteit kunnen beïnvloeden. Interpretatie van de reeds bekomen resultaten is niet eensluidend aangezien deze afhankelijk is van de setting van de verschillende onderzoeken. Bovendien kunnen diverse factoren de cytotoxiciteit van adhesieven in vivo beïnvloeden, zoals oa. dentine permeabiliteit, vorm en uitgebreidheid van de caviteit, graad van conversie van het adhesief en residual/remaining dentin thickness (RDT). Hiermee dient men dan ook rekening te houden bij het formuleren van een algemene conclusie betreffende de cytotoxiciteit van adhesieven

26 3. METHODOLOGIE Er werd een gestructureerde elektronische search uitgevoerd via PubMed, waarvan de details (search terms, limits) weergegeven zijn in onderstaande tabel (tabel 3.1). Het resultaat van deze search is een totaal van 280 publicaties waarvan 106 relevante. Van deze 106 publicaties werden er 28 bij meerdere searches teruggevonden, wat een totaal geeft van 78 verschillende relevante artikels. Niet alle 78 artikels worden gebruikt in deze masterproef. Artikels werden als relevant beschouwd indien ze specifieke resultaten behandelden van vergelijkende analyses qua chemische samenstelling en klinische resultaten van adhesieven, cytotoxiciteit en biocompatibiliteit ervan, of vergelijkingen maakten tussen in vitro vs. in vivo studies of humane vs. animale studies, telkens met inclusie van controlegroep(en). Publicaties werden als niet-relevant beschouwd en uitgesloten indien ze deze resultaten niet behandelden, net als case reports. Een aanvullende handsearch, gebaseerd op literatuurlijsten of verwijzingen in publicaties en reviews, werd eveneens uitgevoerd en geeft een totaal van 82 publicaties. Van deze artikels werden er 74 als relevant beschouwd. Het resultaat van deze twee zoekopdrachten (e-search + handsearch) is een totaal van 124 relevante publicaties. Enkel naar de meest relevante artikels zal gerefereerd worden in deze masterproef

27 Tabel 3.1 Methodologie van het literatuuronderzoek via PubMed (e-search). Datum Terms Limits Hits Relevant Full text/ Abstract Review dentin adhesives AND evolution 6 3 full:1; abstract:2 3 dentin bonding AND evolution 24 5 full: 2; abstract:3 4 dentin bonding AND guideline 8 2 full: 1; abstract:1 2 dentin adhesives AND cytotoxicity human full: 7; abstract: 3 1 animal 10 7 full: 6; abstract: dentin bonding AND composition review 11 6 full: 2; abstract: 4 6 dentin bonding AND chemical composition last 5 years, review full: 11; abstract: dentin bonding AND cytotoxicity last 5 years full: 11; abstract:2 0 dentin adhesive AND cytotoxicity last 5 years full: 9; abstract: immediate dentin sealing 33 3 full: 1; abstract: dentin bonding AND biocompatibility full: 9; abstract: in vivo cytotoxicity AND dental adhesives 28 9 full: 5; abstract: Biomaterials [journal] AND cytotoxicity AND bonding 10 2 full: 2; abstract: 0 0 Totaal full: 66; abstract: (Last accessed on )

28 4. RESULTATEN Uit de literatuur blijkt dat er reeds lange tijd onderzoek verricht wordt naar de cytotoxiciteit en biocompatibiliteit van bondingsystemen en composieten. Naarmate de kunstharsen meer en meer gebruikt werden in de restauratieve tandheelkunde was er nood aan uitgebreider onderzoek naar de mogelijke effecten ervan op de tandpulpa en omgevende weefsels. Zoals reeds eerder vermeld, vertonen bepaalde componenten van primers en bondings cytotoxische effecten op weefselcellen in vitro, maar is deze toxiciteit in vivo niet algemeen aanvaard. Dit zorgt voor nogal wat controverse binnen de wetenschappelijke literatuur. Het is dan ook nuttig een onderscheid te maken tussen cytotoxiciteit bij in vitro experimenten en in vivo experimenten. Deze twee verschillende onderzoeksmethoden geven namelijk een ander beeld van de cyto- en genotoxiciteit van dentine primers en adhesieven. Waar in vitro studies de cytotoxiciteit van een adhesief (in zijn geheel of componenten ervan) in direct contact met een gekweekte celcultuur nagaan, testen in vivo studies de cytotoxiciteit van een adhesief in indirect contact met humane of animale pulpa cellen. Uitzondering hierop zijn de zogenaamde pulp capping testen waarbij een iatrogeen geëxponeerde pulpa bedekt wordt met een dentine adhesief. De resterende dentinewand tussen het wortelkanaal en de geprepareerde caviteit zal steeds als een barrière tegen diffusie van toxische stoffen kunnen fungeren (22). Afhankelijk van de dikte (residual dentin thickness), permeabiliteit en de lokatie van de caviteit zal er meer of minder diffusie van monomeren en toxische stoffen kunnen optreden (22, 25, 37-39). De resultaten van in vitro studies kunnen daarom moeilijk vergeleken worden met deze van in vivo studies. Met het ontwikkelen van een artificieel 3D pulpakamer model ( pulp chamber test ) voor cytotoxiciteitstesten en de zogenaamde dentin barrier testen, werd getracht de in vivo situatie te simuleren (40, 41). De resultaten van deze in vitro cytotoxiciteitstesten zijn vergelijkbaar met deze van in vivo testen. Desondanks blijven de humane in vivo testen de meest betrouwbare op vlak van klinische resultaten

29 Bij in vitro cytotoxiciteitstesten wordt vaak gebruikt gemaakt van gave, vers geëxtraheerde tanden (inflammatie vrij en extractie geïndiceerd wegens orthodontische redenen, meestal premolaren en verstandskiezen). Het bewaren van deze tanden kan op lange termijn gebeuren door middel van cryopreservatie: de tanden worden ingevroren en ondergaan een temperatuursdaling van +37 C naar -196 C. Op deze manier kunnen de tanden bewaard worden voor onderzoek op een later tijdstip zonder dat de tandpulpa histologische veranderingen ondergaat of schade ondervindt. Camps et al. vonden geen significante histologische verschillen tussen vers geëxtraheerde en gecryopreserveerde tanden wanneer deze gebruikt werden voor cytotoxiciteitstesten van adhesieven (42). Het merendeel van de studies over cytotoxiciteit van adhesieven die terug te vinden zijn in de literatuur zijn in vitro studies (zie tabel 4.1). Deze zijn immers gemakkelijker uit te voeren, minder tijdrovend, goedkoper en ethisch meer aanvaardbaar dan in vivo humane en animale experimenten. In de tabellen 4.3 en 4.4 is een overzicht weergegeven van enkele in vitro, respectievelijk in vivo studies betreffende de cytotoxiciteit van dentine adhesieven. Tabel 4.1 Aantal in vitro en in vivo studies uit de zoekresultaten van PubMed- en handsearch. In vitro In vivo PubMed search 12 6 Handsearch Totaal Diffusie van monomeren In de literatuur is aangetoond dat verschillende componenten van dentine adhesieven en composieten zowel in vitro als in vivo doorheen dentinetubuli kunnen diffunderen tot in de pulpa waar ze, afhankelijk van het soort component en de concentratie ervan, cytotoxiciteit kunnen induceren (39, 43-46). Het cytotoxisch karakter van een kunstharsrestauratie is dan

30 ook afhankelijk van het type en de hoeveelheid uitloogbare componenten die aanwezig zijn in het adhesief of composiet. Niet alle componenten en monomeren kunnen in even grote mate diffunderen en dit is vooral afhankelijk van de grootte van de moleculen (moleculair gewicht), hun hydrofiel karakter of hydrofiliciteit en de polymerisatiegraad van het adhesief. Het zijn dus voornamelijk de ongepolymeriseerde, hydrofiele (co)monomeren en additieven met een laag moleculair gewicht die zullen uitgeloogd worden in een waterig milieu. Voorbeelden van dergelijke kleine monomeren zijn MMA (methylmethacrylaat), HEMA (hydroxyethyl methacrylaat) en de wateroplosbare ethyleenglycol comonomeren (EGDMA, TEGDMA en TEGMMA). Uit onderzoek blijkt dat vooral HEMA en TEGDMA vlot kunnen diffunderen uit verschillende soorten ongepolymeriseerde (47) en gepolymeriseerde adhesieven (48, 49). Het is vanzelfsprekend dat de concentraties uitgeloogde componenten groter zullen zijn bij ongepolymeriseerde dan bij gepolymeriseerde adhesieven wegens het grotere aantal vrije, ongebonden monomeren. Ethyleenglycol (EG) is een product dat, samen met methacrylaatzuur (MA), vrijkomt bij de hydrolyse van HEMA (zie 1.5.1). De splitsing in EG en MA gebeurt ter hoogte van de ester groep van het methacrylaat, die zeer gevoelig is voor hydrolyse. Ethyleenglycol komt slechts in kleine concentraties voor in waterige extracten van adhesieven en vertoont bij deze lage concentraties geen cytotoxische effecten (49). Uit verschillende in vitro testen is gebleken dat HEMA en TEGDMA een milde, respectievelijk meer ernstige cytotoxiciteit vertonen (48-53). De hoge concentratie van deze uitgeloogde (co)monomeren lijkt dan ook verantwoordelijk te zijn voor de cytotoxiciteit op de pulpa (47). Deze stelling wordt bevestigd door Ratanasathien et al., die Bis-GMA als het meest toxische monomeer aanduidden, gevolgd door UDMA, TEGDMA en HEMA (50). Voor de cytotoxiciteit van deze monomeren zie Bovendien zouden diverse combinaties van monomeren, zoals ze voorkomen in de klinisch toegepaste dentine adhesieven, een invloed hebben op de cytotoxiciteit van het adhesief in zijn geheel. Ratanasathien et al. beschreven een in vitro synergetisch, additioneel en antagonistisch cytotoxisch effect van monomeren wanneer ze in binaire combinaties voorkomen (50, 54). Deze effecten zijn enerzijds afhankelijk van de concentraties van beide

31 monomeren en anderzijds van de totale blootstellingstijd. Zo zal bijvoorbeeld een kleine concentratie van Bis-GMA in vitro een antagonistisch effect hebben op de cytotoxiciteit van HEMA, terwijl een grotere concentratie een synergetisch effect heeft ongeacht de concentratie HEMA. Hoe langer de blootstellingstijd van adhesieven aan de geteste celcultuur, hoe meer uitgesproken het synergetisch effect tot uiting komt. Het optreden van deze synergetische interacties tussen monomeren betekent dus dat dentine adhesieven cytotoxische effecten kunnen veroorzaken ter hoogte van de pulpa, in lagere concentraties dan nodig is voor aparte monomeren om cytotoxisch te zijn. Deze bevinding geeft aan dat niet alleen mag uitgegaan worden van de toxiciteit van monomeren op zich, maar dat combinaties ervan en de totale blootstellingstijd belangrijke parameters zijn bij het bepalen van de toxiciteit van adhesieven. De manier waarop deze synergetische interacties optreden is nog onbekend. De interacties tussen de verschillende soorten monomeren komen niet alleen voor in het adhesief zelf, maar ook tussen adhesief en kunstharsrestauratie. De monomeren van het adhesief kunnen hierbij een (licht) antagonistische of synergetische werking hebben op de diffusie van monomeren uit de composietrestauratie, en omgekeerd (44). Zo zal bijvoorbeeld een TEGDMA-bevattend adhesief in combinatie met een TEGDMA-bevattend composiet resulteren in een verhoogde diffusie doorheen dentine. Antagonistische en reducerende effecten treden slechts in zeer geringe mate op. Gerzina en Hume stellen dus dat de gepolymeriseerde adhesieflaag niet fungeert als een barrière tegen de monomeer diffusie vanuit een kunstharsrestauratie, maar dat deze de diffusie kan versterken (44). Deze stelling wordt tegengesproken door de studie van Franz et al., waarin geen significante invloed van adhesieven op de cytotoxiciteit van composieten in vitro gevonden werd (55). In tegenstelling tot de kleine (co)monomeren en additieven zullen de eerder grote monomeren zoals UDMA en Bis-GMA veel moeilijker kunnen diffunderen en slechts in kleine hoeveelheden aanwezig zijn na uitloging in een waterig milieu (48, 49). Ondanks hun zeer cytotoxisch karakter (zie ) zullen Bis-GMA en UDMA daarom minder bijdragen aan de cytotoxiciteit dan de kleinere, hydrofiele monomeren (49, 50, 53). Ook de foto-initiator camphorquinone (CQ) blijkt gemakkelijk te kunnen diffunderen uit verschillende soorten adhesieven (52). Bovendien is deze veel gebruikte initiator in staat om

32 cytotoxische effecten te induceren (32-34). Door het toevoegen van DMA (dimethylaminoethyl methacrylaat) als co-initiator (initiator/co-initiator systeem) wordt de hoeveelheid vrije radicalen tijdens irradiatie nog verhoogd, zonder dat het intracellulaire ROS (reactive oxygen species) gehalte en de cytotoxiciteit toenemen (zie 4.2) (33). Camphorquinone/DMA is aldus een uiterst efficiënte initiator/co-initiator combinatie voor het gebruik in kunstharsadhesieven en -composieten. 4.2 Mechanisme van cytotoxiciteit De cytotoxiciteit van dentine adhesieven (en composieten) in vitro is te wijten aan de verstoring van het stabiele redox-evenwicht tussen ROS en antioxidant beschermende factoren. Het zijn de residuele (ongepolymeriseerde) kunstharsmonomeren van de adhesieven die verantwoordelijk zijn voor een verstoring van dit evenwicht en een toegenomen oxidatieve stress. De polymerisatiegraad van adhesieven is namelijk nooit volledig waardoor er steeds een deel ongepolymeriseerde monomeren in de adhesieflaag resteert. Naast deze vrijstelling van residuele monomeren op korte termijn, worden eveneens monomeren in het mondmilieu vrijgesteld door erosie en degradatie van de adhesieflaag op langere termijn (56). In vitro (met direct contact tussen kunsthars en de celcultuur) kunnen de residuele monomeren gemakkelijk diffunderen uit de gepolymeriseerde kunstharslaag en zo de pulpa cellen bereiken. Fysiologisch wordt de redox balans in evenwicht gehouden door de productie van antioxidanten zoals glutathion (GSH). Glutathion beschermt de cel tegen schade veroorzaakt door ROS en is één van de belangrijkste antioxidanten in de humane cel. Het verdedigingsmechanisme dat door de cel ontwikkeld werd tegen de schadelijke effecten van oxidatieve stress bevat niet alleen GSH, maar ook vitamine E (Trolox), ascorbaat en N-acetylcysteine (NAC). Deze antioxidanten zijn onmisbaar voor elke cel aangezien ROS, dat in kleine hoeveelheden vrijkomt als een product van het aerobe celmetabolisme, oxidatieve schade kan induceren met als uiteindelijk gevolg celdood via apoptose. Celculturen die eerst behandeld worden met één van deze antioxidanten alvorens te worden blootgesteld aan kunstharsmonomeren, vertonen een duidelijke reductie van de lediging van de intracellulaire GSH-pool en een verminderde hoeveelheid apoptotische cellen (57, 58)

33 ROS wordt zowel endogeen (aeroob celmetabolisme) als exogeen (blootstelling aan UV-licht, ioniserende straling en andere omgevingsfactoren) gegenereerd. Wanneer cellen in contact komen met kunstharsmonomeren treedt er een snelle lediging op van de intracellulaire GSHpool, en bovendien een toename van de intracellulaire ROS productie (57, 59, 60). Kunstharsmonomeren zullen dus een dubbel cytotoxisch effect hebben: enerzijds via een reductie van de beschermende factoren (GSH) en anderzijds via een toename van de toxische factoren (ROS). De wijze van interactie tussen kunstharsmonomeren en ROS, en waarom deze interactie optreedt, is nog niet duidelijk. Uit voorgaande onderzoeken blijkt dat het ROS gehalte van pulpa cellen tot 5 keer verhoogd wordt in aanwezigheid van kunstharsmonomeren en dat deze toename dosis gerelateerd is (57-61). Wel moet vermeld worden dat deze effecten afwezig waren bij in vitro dentin barrier testen, waarbij dus de in vivo situatie gesimuleerd werd door een fysische barrière tussen pulpa en adhesief (62). Men kan dus concluderen dat kunstharsmonomeren een cytotoxisch effect hebben op de pulpa van zodra intra-pulpaal een kritische concentratie bereikt en overschreden wordt. Zo vonden Chang et al. en Engelmann et al. bijvoorbeeld een kritische concentratie van respectievelijk en 0.1 mm voor Bis-GMA in vitro (63-65) en Stanislawski et al. en Volk et al. een kritische concentratie TEGDMA van 1.2 en 2.6 mm voor gingivale respectievelijk pulpale fibroblasten (57, 61). Een andere studie van Volk et al. kwam tot een vergelijkbaar resultaat waarbij UDMA als meest toxisch werd aangeduid, gevolgd door TEGDMA en HEMA (51). Deze resultaten worden bevestigd door verschillende andere studies (50, 52, 53). Dentine adhesieven induceren niet alleen cytotoxische effecten op testcellen, ze kunnen ook genotoxische effecten uitlokken (66). In de literatuur bestaat nog geen overeenkomst over het feit dat ROS hiervoor verantwoordelijk is. Chromosomale schade en breuken van de DNA strengen kunnen microscopisch waargenomen worden als de vorming van micronuclei. Klinische effecten hiervan zijn het stopzetten van de celcyclus in de G1 en G2/M fase en in een later stadium apoptose, afhankelijk van de geïnduceerde schade. Indien de cel deze DNA schade met succes kan herstellen, is overleving van de cel mogelijk. Net als de cytotoxiciteit, is genotoxiciteit afhankelijk van de concentratie monomeren waarmee de cel in contact komt. Met andere woorden: cyto- en genotoxiciteit zijn beiden dosis gerelateerd (34, 58, 67)

34 De evaluatie van de cytotoxiciteit van dentine adhesieven wordt standaard uitgevoerd met een MTT (methyltetrazolium bromide) analyse. Via deze analyse kan de overleving van cellen geëvalueerd worden aan de hand van hun metabole activiteit. MTT detecteert het succinic dehydrogenase enzym (SDH) dat actief is bij mitochondriale processen in levende cellen (68). MTT assay is een zeer efficiënte testmethode aangezien deze test heel gevoelig is. Bijgevolg is er slechts een kleine hoeveelheid testcellen nodig om een snelle, betrouwbare en goedkope screening te kunnen doen van een grotere populatie testcellen (67). 4.3 In vitro Setting/modellen Onderstaande tabel (tabel 4.3) geeft een overzicht weer van 27 verschillende in vitro cytotoxiciteitsstudies en hun resultaten. In deze tabel wordt per auteur aangegeven welke adhesieven/monomeren getest werden op cytotoxiciteit, welke celsoorten hiervoor gebruikt werden, op welke manier de cytotoxiciteit getest werd en welke resultaten daarbij werden bekomen. Uit de tabel wordt duidelijk dat het overgrote deel van de cytotoxiciteitstesten wordt uitgevoerd met het adhesief in direct contact met de celcultuur (direct contact testmethode). Zoals in 4.1 vermeld zullen de residuele, ongepolymeriseerde monomeren (afkomstig van de onvolledige conversie van het adhesief en de zuurstof geïnhibeerde laag) diffunderen uit de adhesieflaag en een toxisch effect induceren op de (pulpa)cellen. Deze diffusie kan ongestoord optreden bij het ontbreken van een residuele dentinewand tussen adhesief en celcultuur (= direct contact) en zal dus een ernstiger cytotoxisch effect uitlokken dan bij de dentin barrier testmethode. De meest gebruikte celculturen voor in vitro cytotoxiciteitstesten zijn animale fibroblasten afkomstig van dentale pulpa, parodontaal ligament (PDL) of gingiva. Het probleem met deze cellen van verschillende origine is dat ze niet allemaal even gevoelig zijn voor de toxische effecten van dentine adhesieven. Geurtsen et al. (52) en Moodley et al. (69) kwamen tot de conclusie dat humane PDL en pulpa fibroblasten gevoeliger zijn voor cytotoxiciteit dan humane gingivale en 3T3 muis fibroblasten. Uit tabel 4.3 blijkt dat fibroblasten van

35 gekweekte albino muizen (Balb/c fibroblasten) uiterst geschikt zijn voor dit soort in vitro cytotoxiciteitstesten. Verder kunnen hiervoor ook cellen van ratten of runderen worden gebruikt. Bij de dentin barrier testmethode daarentegen wordt de in vivo situatie gesimuleerd waarbij een dentineschijfje de residuele, axiale dentinewand van de caviteit voorstelt. Deze vormt als het ware een barrière tegen de diffusie van monomeren en toxische componenten van de adhesieflaag naar de pulpa toe. Afhankelijk van verschillende factoren (RDT, permeabiliteit van het dentine, lokatie van de caviteit, samenstelling adhesief) zal de diffusie van monomeren en componenten in meer of mindere mate gehinderd worden. Voor de dentin barrier testen wordt gebruik gemaakt van humaan of animaal dentine van runderen, die praktisch dezelfde permeabiliteit vertonen (70). De dentin barrier testmethode geeft meer betrouwbare resultaten dan de direct contact testmethode en benaderen deze van in vivo studies (zie ook figuur 5.1). Dergelijke verschillen tussen direct contact en dentin barrier testen enerzijds, maar ook verschillen in de setting van deze in vitro studies anderzijds, maken het moeilijk om de bekomen resultaten met elkaar te vergelijken en tot een gefundeerd besluit te komen Resultaten Cytotoxiciteit van kunstharsmonomeren afzonderlijk Uit tabel 4.3 blijkt dat de resultaten voor de cytotoxiciteit van kunstharsmonomeren in vitro onafhankelijk van elkaar bevestigd worden door verschillende studies. Het betreft telkens studies die de cytotoxiciteit van afzonderlijke componenten (overwegend monomeren) van dentine adhesieven testen in direct contact met een gekweekte celcultuur. De cytotoxiciteit van enkele commerciële adhesieven in hun totaliteit wordt besproken in De 4 meest gebruikte, en tevens belangrijkste (co)monomeren voor de cytotoxiciteit van adhesieven zijn Bis-GMA (bisfenol-a diglycidyl methacrylaat of Bowen s hars), UDMA (urethaan dimethacrylaat), TEGDMA (triethyleenglycol dimethacrylaat) en HEMA (hydroxyethyl methacrylaat). Zowel Hanks et al. (53), Geurtsen et al. (49) als Volk et al. (51) kwamen in hun onderzoek tot de conclusie dat UDMA het meest toxisch monomeer was,

36 gevolgd door Bis-GMA, TEGDMA en HEMA. Ratanatashien et al. daarentegen duidden Bis- GMA als meest toxisch aan, gevolgd door UDMA, TEGDMA en HEMA (50). Dezelfde rangschikking voor cytotoxiciteit wordt bekomen na vergelijking van de resultaten van Chang et al. (63, 64) en Engelmann et al. (65) enerzijds, en van Stanislawski et al. (57) en Volk et al. (61) anderzijds. Deze resultaten bevestigen dat Bis-GMA reeds toxische effecten uitlokt bij een lagere kritische concentratie dan TEGDMA, namelijk mm tegenover mm. Conclusie : Op basis van de besproken in vitro studies kan de cytotoxiciteit van deze (co)monomeren gerangschikt worden van meest naar minst toxisch: UDMA > Bis-GMA > TEGDMA >>> HEMA. Deze resultaten gelden in dit geval voor de direct contact testmethode, dus zonder diffusie doorheen dentine Cytotoxiciteit van commerciële dentine adhesieven Het overgrote deel van de in vitro cytotoxiciteitsstudies testen commerciële dentine adhesieven in direct contact met een gekweekte celcultuur (23/27 studies uit tabel 4.3). Op deze manier kan geen informatie verkregen worden over de cytotoxiciteit van deze adhesieven na diffusie doorheen een resterende dentinewand, zoals dit het geval zou zijn bij de dentin barrier testmethode alsook bij in vivo testen. De dentin barrier testen daarentegen simuleren de in vivo cytotoxiciteitstesten en benaderen de klinische resultaten ervan. De meest op cytotoxiciteit geteste adhesieven uit tabel 4.3 zijn Prime&Bond 2.1 en NT, Xeno III, Adper Single Bond, Adper Scotchbond 1 en Multi-Purpose, Clearfil Protect Bond en SE Bond, Syntac Single Component en Syntac Sprint, Heliobond, ExciTE, Fuji BOND LC (= RM-GIC), Adper Prompt en Prompt L-Pop, Solobond en Clearfil Liner Bond 2V. Deze adhesieven werden in totaal 2 keer of meer gebruikt voor de in vitro cytotoxiciteitstesten. In tabel 4.2 wordt een overzicht gegeven van de verschillende adhesieven

37 Tabel 4.2 Merknamen van de in vitro en in vivo geteste bondingsystemen en Ca(OH) 2 liners. Firma Merknaam Soort adhesief 3M ESPE Adper Prompt Adper Prompt L-Pop Adper Scotchbond 1 Adper Scotchbond Multi-Purpose (MP) Adper Single Bond Adper Single Bond Plus Vitrebond 1-step SEA 1-step SEA 2-step E&R 3-step E&R 2-step E&R 2-step E&R RM-GIC adhesief Coltène/Whaledent A.R.T. Bond 3-step E&R Degussa Etch&Prime step SEA Dentsply Dycal Prime&Bond 2.1 Prime&Bond NT Xeno III Xeno V Ca(OH) 2 liner 2-step E&R 2-step E&R 1-step SEA 1-step SEA GC Fuji BOND LC RM-GIC adhesief Ivoclar Vivadent ExciTE Heliobond Syntac Syntac Single Component (SC) Syntac Sprint 2-step E&R 2-step E&R 3-step E&R 2-step E&R 2-step E&R Kerr Life Ca(OH) 2 liner Kuraray Clearfil Liner Bond (LB) 2V Clearfil Protect Bond Clearfil Self-Etch (SE) Bond Clearfil S 3 Bond 2-step SEA 2-step SEA 2-step SEA 1-step SEA VOCO Solobond 2-step E&R Zowel Adper Scotchbond 1 als Adper Scotchbond Multi-Purpose (3M ESPE ) blijken vaak het meest cytotoxisch adhesief te zijn. Het zijn respectievelijk 2-step en 3-step E&R adhesieven. Het cytotoxisch karakter van deze adhesieven in vitro wordt duidelijk uit de

38 studies van Geurtsen et al. (49), Koliniotou-Koubia et al. (71), Szep et al. (72) en Koulaouzidou et al. (73). Murray et al. (74), Demarco et al. (75) en Grobler et al. (76) vonden dan weer een lagere cytotoxiciteit voor Scotchbond. De laatste twee vonden een gelijke, respectievelijk lagere cytotoxiciteit voor Scotchbond dan voor Clearfil. Prime&Bond 2.1 en Prime&Bond NT (Dentsply ) zijn beiden 2-step E&R adhesieven en vertonen relatief weinig cytotoxiciteit in vergelijking met de andere geteste adhesieven. Toch bestaan er enkele opmerkelijke verschillen tussen de verschillende studies. Zo vinden Grobler et al. (76) een groot verschil in cytotoxiciteit tussen Xeno III (meest toxisch) en Prime&Bond NT, terwijl dit bij Yeh et al. (59) omgekeerd is. Ook Huang et al. (77) vinden een afwijkende waarde voor de cytotoxiciteit van Prime&Bond NT: enkel in deze studie is Prime&Bond NT toxischer dan Syntac, terwijl dit niet het geval is bij de andere studies. De twee Prime&Bond adhesieven verschillen van elkaar doordat aan Prime&Bond NT een nanovulstof is toegevoegd (Nano-Technology). Hierdoor kunnen zowel adhesief als vulstofpartikels penetreren tot in de dentinetubuli met als gevolg een verhoogde hechtsterkte. Clearfil SE Bond en Clearfil Protect Bond (Kuraray ) zijn net als Clearfil Liner Bond 2V (= voorloper van SE Bond) 2-step self-etching adhesieven. Clearfil SE Bond verschilt van Protect Bond doordat deze laatste het antibacteriële monomeer MDPB (methacryloyloxydodecyl pyridinium bromide) bevat en langdurig een hoeveelheid fluoride kan vrijstellen. Ze vertonen beiden een relatief lage cytotoxiciteit in vitro. Demarco et al. (75) en Grobler et al. (76) daarentegen vonden een hogere cytotoxiciteitswaarde voor respectievelijk Clearfil Liner Bond 2V en Protect Bond. Demirci et al. (62) vonden dat Clearfil Protect Bond cytotoxischer was dan SE Bond in een direct contact test, terwijl Lanza et al. (78) geen verschil zagen tussen beide adhesieven in een dentin barrier test. Een vierde Clearfil bondingsysteem is Clearfil S 3 Bond. Dit systeem is een self-etching all-inone adhesief (1-step SEA). Adper Single Bond en Single Bond Plus (3M ESPE ) zijn 2-step E&R adhesieven. Single Bond vertoont cytotoxiciteit bij de in vitro dentin barrier testen van Vajrabhaya et al. (45) en Lanza et al. (78). Vajrabhaya et al. vonden bij hun dentin barrier test geen verschil in cytotoxiciteit tussen Single Bond en de overige adhesieven. De cytotoxiciteit ervan is iets groter dan deze van Clearfil SE Bond en iets lager dan deze van Prime&Bond (59, 77-79). Dit

39 wordt tegengesproken door Huang en Chang (77), en Chen et al. (80) die een hogere cytotoxiciteitswaarde vonden voor Single Bond. Porto et al. (81) daarentegen vonden geen verschil tussen Single Bond Plus en Clearfil SE. Single Bond Plus heeft dezelfde samenstelling als Single Bond, maar bevat bovendien ook nog nanovulstof waardoor volgens de producent een sterkere hechting aan dentine bekomen kan worden. Xeno III en Xeno V (Dentsply ) zijn beiden all-in-one adhesieven (1-step SEA) en vertonen in de studies van Grobler et al. (76) en Porto et al. (81) een grote cytotoxiciteit tegenover de andere geteste adhesieven. Zelfs na diffusie doorheen een dentin barrier was Xeno het meest cytotoxische adhesief. Yeh et al. (direct contact) (59) en Lanza et al. (dentin barrier) (78) daarentegen vonden geen superieure cytotoxiciteit van het Xeno III adhesief. Xeno V is de opvolger van het Xeno III adhesief. Syntac, Syntac Single Component (SC) en Syntac Sprint (Ivoclar Vivadent ) zijn E&R adhesieven waarvan enkel Syntac en Syntac SC nog op de markt verkrijgbaar zijn. Het etsen van dentine is optioneel bij Syntac: het maleïnezuur in primer (ph 1.3) en adhesief (ph 4.0) kan het dentine oppervlakkig demineraliseren en de smeerlaag modificeren. Syntac Primer en Adhesive bevatten geen polymerisatie initiators en daarom moet na het aanbrengen ervan het lichtuithardend adhesief Heliobond worden geappliqueerd. Syntac is minder cytotoxisch dan Scotchbond, en is qua cytotoxiciteit vergelijkbaar met Prime&Bond 2.1 en Single Bond (45, 52, 72, 77, 79, 80). Heliobond kan qua cytotoxiciteit vergeleken worden met de Syntac adhesieven (71, 77). Adper Prompt en Prompt L-Pop (3M ESPE ) zijn beiden 1-step SEA met een vrij lage cytotoxiciteit in vergelijking met andere adhesieven. Prompt L-Pop is verpakt in een handige unit-dose. Demirci et al. (direct contact) (62) en Lanza et al. (dentin barrier) (78) vonden een cytotoxiciteit die lager is dan deze van Clearfil SE en Clearfil Protect Bond. Yasuda et al. (82) daarentegen vonden een grotere cytotoxiciteit voor Adper Prompt, zowel in ongepolymeriseerde als in gepolymeriseerde vorm. ExciTE (Ivoclar Vivadent ) is een 2-step E&R adhesief dat zowel bij Demirci et al. (62) als bij Koulaouzidou et al. (73) als meest toxisch adhesief aangeduid wordt. Bij de dentin barrier test waren geen cytotoxische effecten van het adhesief merkbaar (62)

40 Solobond (VOCO ) is een 2-step E&R adhesief. Geurtsen et al. (52) vonden een grotere cytotoxiciteit voor Solobond dan voor Scotchbond, terwijl dit omgekeerd was bij Koliniotou- Koubia et al. (71). Beiden vinden wel een grotere cytotoxiciteit voor Solobond dan Syntac in hun direct contact testen. Yeh et al. (59) vonden een cytotoxiciteit die praktisch gelijk was aan deze van Xeno III, maar veel lager dan deze van Prime&Bond NT. Fuji BOND LC (GC ) is een kunsthars-versterkt GIC (RM-GIC) adhesief. Het bindt zowel chemisch (adhesieve hechting van GIC) als micromechanisch (hybride laag) aan glazuur en dentine. De vloeistof bevat polyacrylzuur, HEMA, UDMA en CQ en heeft een ph-waarde van 1.9. De direct contact test van Koulaouzidou et al. (83) resulteert in een lage cytotoxiciteit van Fuji BOND LC. Niettegenstaande de goede eigenschappen van de glasionomeercementen vertonen de RM-GIC cytotoxiciteit tegenover cellen in direct contact testen (83-85). De cytotoxiciteit is evenwel lager als deze van de kunstharsadhesieven. Uit de direct contact testen van Bouillaguet et al. (86) en Grobler et al. (76) blijkt dat de primer van een etch-and-rinse, respectievelijk self-etch bondingsysteem telkens een grotere cytotoxiciteit induceert dan de bonding. De primers en bondings die in deze in vitro studies op cytotoxiciteit getest werden zijn Scotchbond MP en A.R.T. Bond (86), en Clearfil Protect Bond (76). Grobler et al. (76) vergeleken de self-etching primer met de gepolymeriseerde bonding van Clearfil Protect Bond in direct contact met de celcultuur. De primer bevat HEMA, het antibacteriële MDPB-monomeer en het zure adhesief MDP-monomeer. De verklaring voor de grotere cytotoxiciteit kan liggen in het feit dat de ongepolymeriseerde primer een lagere viscositeit heeft dan de gepolymeriseerde bonding en dus gemakkelijker ongebonden monomeren kan vrijstellen. Bovendien heeft de primer een ph-waarde van 2.0, wat voor een extra irritatie van de cellen kan zorgen. Bouillaguet et al. (86) vergeleken de cytotoxiciteit van de primer en bonding van de 3-step E&R adhesieven Scotchbond MP en A.R.T. Bond (Coltène/Whaledent ). Ze kwamen net als Grobler et al. tot de conclusie dat de primer cytotoxischer was dan de bonding in direct contact met de celcultuur. Beide primers en bondings bevatten HEMA, respectievelijk HEMA en Bis-GMA. De primer van A.R.T. Bond (ph 2.0) bevat bovendien GDMA (glycol dimethacrylaat) en een kleine hoeveelheid maleïnezuur, de bonding component bevat

41 overwegend TEGDMA en Bis-GMA. Over de specifieke samenstelling van Scotchbond MP is weinig informatie gekend. De primer van dit bondingsysteem heeft een ph-waarde van 3.3. Scotchbond MP en A.R.T. Bond vertonen een vergelijkbare cytotoxiciteit na diffusie doorheen dentin barriers van 0.3 en 1.0 mm dik. Een lagere cytotoxiciteit van deze adhesieven werd waargenomen na diffusie doorheen dentin barriers van 1.0 mm dikte. Dit toont aan dat de RDT een belangrijke rol speelt in de cytotoxiciteit van dentine adhesieven (zie 5). Zowel Vajrabhaya et al. (dentin barrier test) als Koulaouzidou et al. (direct contact test) stellen dat de total-etch systemen (etch-and-rinse) cytotoxischer zijn dan de self-etch systemen (45, 83). De totale verwijdering van de smeerlaag en de verwijding van de blootliggende dentinetubuli tijdens de etsprocedure bij de total-etch systemen kan hiervoor een verklaring zijn. Immers, door het verwijderen van de smeerlaag verdwijnt de fysische barrière tussen de openstaande dentinetubuli en de caviteit waardoor het pulpaweefsel beter in contact kan komen met de toxische stoffen uit het adhesief. Bij de self-etch adhesieven zal de smeerlaag slechts gedeeltelijk verwijderd en/of gemodificeerd worden zodat de dentinetubuli afgesloten blijven met een zogenaamde smeerprop. Dit proces is afhankelijk van de zuurtegraad van de self-etching primer (strong of mild self-etch adhesief). Volgens deze redenering zullen de mild SEA dus de beste resultaten moeten geven wat betreft cytotoxiciteit, terwijl ze een lagere hechtingsterkte aan dentine hebben dan de strong SEA (14). Conclusie : - Wanneer bovenstaande bevindingen getoetst worden aan de resultaten van de studies uit tabel 4.3, dan blijkt dat de total-etch bondingsystemen vaak als meest cytotoxisch worden aangeduid (Scotchbond, Prime&Bond, Syntac, ExciTE, Solobond, Single Bond). De self-etch adhesieven vertonen in deze studies overwegend de minste cytotoxiciteit (Clearfil, Xeno, Adper Prompt en Prompt L- Pop). - Mild self-etch adhesieven (ph + /- 2) penetreren minder ver in de dentinetubuli dan strong self-etch adhesieven (ph < 1) en geven minder irritatie ter hoogte van de pulpa. - De primer component van zowel de etch-and-rinse als de self-etch adhesieven is cytotoxischer dan de bonding component

42 Tabel 4.3 Overzicht van de in vitro cytotoxiciteitsstudies in chronologische volgorde. Auteur Celcultuur Soort test Testmethode Humaan Animaal Direct contact Dentin barrier Meest toxische component/ soort adhesief Meest toxisch adhesief (merknaam) Hanks et al. (53) (1991) Balb/c 3T3 fibro s X Light microscopy E-BPA >> UDMA > Bis-GMA > BPA > TEGDMA >> CQ > DHEpT > DMAEM Bouillaguet et al. (86) (1993) Pulpa cellen X X Light microscopy Direct contact: primer > bonding Dentin barrier: Scotchbond MP = A.R.T. Bond Ratanasathien et al. (50) (1995) Balb/c 3T3 fibro s X MTT assay Bis-GMA > UDMA > TEGDMA >>> HEMA Geurtsen et al. (52) (1998) Fibro s (gingiva, pulpa, PDL) 3T3 fibro s X DNAintercalating dye H33342 UDMA > DEGDMA > Bis-GMA > Bis-MA > TEGDMA > EGDMA > HEMA > BEMA >> DDMA Costa et al. (79) (1999) MDPC-23 X MTT assay Prime&Bond 2.1 = Syntac Sprint > Single Bond Geurtsen et al. (49) (1999) Balb/c 3T3 fibro s X DNAintercalating dye H33342 Solobond >> Scotchbond Multi- Purpose > Syntac SC >> Prime&Bond 2.1 > Solist Murray et al. (74) (2000) Wistar rat pulpa s X X Light microscopy Salicylzuur > puur CaOH 2 > Kalzinol ZOE > high-mercury Amalgam > Prime&Bond > Dycal > pure Barium sulphate > Hypocal > Scotchbond > Calasept > Life > One-step Demarco et al. (75) (2001) NIH-3T3 muis fibro s X Light microscopy Scotchbond Multi-Purpose = Clearfil Liner Bond 2V >> CaOH 2 (control) Koliniotou-Koubia et al. (71) (2001) L929 muis fibro s X Light microscopy Scotchbond 1 > F-2000 > Solobond > Bond 1 > Heliobond Syntac

43 Huang en Chang (77) (2002) Pulpa cellen X MTT assay Single Bond > Prime&Bond NT > Syntac Single Component > Heliobond > Clearfil SE Bond Szep et al. (72) (2002) Gingivale fibro s X Contrasting phase microscopy Scotchbond 1 > Ariston Liner > Syntac Sprint >> Etch&Prime 3.0 OptiBond solo Prime&Bond NT Chen et al. (80) (2003) Lan et al. (84) (2003) Pulpa cellen X MTT assay Pulpa cellen X MTT assay RM-GIC > GIC High concentration: Single Bond > Syntac Sprint > Prime&Bond 2.1 Low concentration: Syntac Sprint > Single Bond > Prime&Bond 2.1 ProTec CEM > Fuji BOND II LC > Compoglass > GC Lining Vajrabhaya et al. (45) (2003) L929 muis fibro s X MTT assay Total-etch > self-etch Syntac Single Component = Single Bond = Prime&Bond 2.1 >> OneUpBond F Souza et al. (85) (2006) MDPC-23 X MTT assay Vitrebond > Vitremer > Rely X Luting cement Volk et al. (51) (2006) Gingivale fibro s X Monobromobimane assay UDMA > TEGDMA > HEMA Demirci et al. (62) (2008) thpc X X Crystal violet assay Direct contact: ExciTE > AdheSE bond > Clearfil Protect Bond > Clearfil SE bond > Prompt L-Pop Dentin barrier: no cytotoxic effects Grobler et al. (76) (2008) 3T3 fibro s X X (enkel Xeno III) MTT assay Clearfil Protect Bond: Primer >> Bond Xeno III > Clearfil Protect Bond > Scotchbond 1 Prime&Bond NT

44 Koulaouzidou et al. (73) (2008) RPC-C2A, BHK21/C13, MRC5 X Sulforhodamine B assay (SRB) Cured: ExciTE > Adper Scotchbond 1 > One Step Plus > Tyrian SPE > Clearfil Protect Bond Yasuda et al. (82) (2008) Pulpa cellen MDPC-23 X Light microscopy Uncured: Adper Prompt > Clearfil S 3 Bond Absolute G-Bond > AQ Bond Plus Cured: Adper Prompt > Absolute > G-Bond = Clearfil S 3 Bond > AQ Bond Plus Koulaouzidou et al. (83) (2009) Long fibro s Rat pulpa fibro s X Sulforhodamine B assay (SRB) Total-etch > SEA en RM-GIC Gluma >> Admira >> ED Primer II > Clearfil Liner 2V > NanoBond > Fuji BOND LC Lanza et al. (78) (2009) MDPC-23 X MTT assay Single Bond > Clearfil SE Bond = Xeno III = Cearfil Protect Bond Adper Prompt Porto et al. (87) (2009) Wistar rat macro s X MTT assay Adper Single Bond 2 > control group Ulker en Sengun (88) (2009) Bovine dental papilla cellen X MTT assay Biscem > Panavia F > Rely X > Bistite > Maxcem > control Yeh et al. (59) (2009) Hamster CHO-K1 X MTT assay Prime&Bond NT > Single Bond 2 > Xeno III Solobond M > Futurabond NR Huang et al. (58) (2010) Pulpa cellen X MTT assay Prime&Bond 2.1 > Single Bond > Clearfil SE Bond Porto et al. (81) (2011) Wistar rat macro s X MTT assay Xeno V > Clearfil SE Bond = Single Bond Plus > control (X) = niet verder gespecificeerd in artikel.

45 4.4 In vivo Setting/technieken In de literatuur zijn er relatief weinig studies te vinden die de cytotoxiciteit van dentine adhesieven in vivo onderzoeken (zie tabel 4.1). De reden hiervoor ligt in het feit dat in vitro studies gemakkelijker en sneller uit te voeren zijn dan in vivo studies, en dat met de ontwikkeling van de dentin barrier en pulp chamber testen de in vitro resultaten als betrouwbaar beschouwd kunnen worden (zie ook figuur 5.1). In tegenstelling tot in vitro cytotoxiciteitstesten worden in vivo testen niet uitgevoerd op gekweekte humane of animale celculturen, maar (direct of indirect) op pulpa cellen bij levende wezens (mammalia). Dit soort testen heeft het grote voordeel dat ze de klinische situatie perfect weergeven en de resultaten dus klinisch relevant zijn. Het nadeel van de in vivo testen is dat ze tijdrovend, duur, moeilijker te realiseren en dikwijls ethisch minder aanvaardbaar zijn dan de in vitro testen. Dentine adhesieven worden aangebracht op de bodem van een klasse I of klasse V caviteit die geprepareerd wordt tot in het dentine. Om tot vergelijkbare resultaten te komen, dient de caviteitspreparatie op een gestandaardiseerde manier te gebeuren. Dit wil zeggen dat alle caviteiten dezelfde afmetingen (lengte, breedte, diepte) dienen te hebben en geprepareerd worden met een sneldraaiende diamantboor onder waterkoeling. Een verschil in RDT, afmeting en lokatie van de caviteiten van eenzelfde studie leidt immers tot uiteenlopende resultaten voor de cytotoxiciteit van het adhesief. Bij de zogenaamde pulp capping testen wordt er iatrogeen een pulpa exponatie veroorzaakt zodat het adhesief in direct contact kan komen met pulpaweefsel (cfr. in vitro direct contact testen). Pulp capping met kunstharsadhesieven is reeds verschillende malen onderzocht, en blijkt niet de ideale behandeling te zijn van caviteiten met pulpa exponatie (46, 75, 89-94). Doordat het adhesief in direct contact staat met pulpaweefsel kunnen residuele ongepolymeriseerde monomeren gemakkelijker diffunderen en de pulpa irriteren. De meeste fabrikanten raden het gebruik van hun bondingsysteem als pulp capping agent dan ook af

46 Standaard wordt een Ca(OH) 2 liner gebruikt in caviteiten van de controlegroep. Ca(OH) 2 is een uiterst biocompatibel materiaal dat geen irritatie of ontsteking geeft van het onderliggend pulpaweefsel, noch bij klassieke caviteiten, noch bij caviteiten met pulpa exponatie. Ca(OH) 2 is geassocieerd met pulpa genezing en de vorming van dentine bruggen bij blootliggende pulpa s (46, 90, 91, 94-97) en onder diepe dentinecaviteiten. Bij caviteiten met een minimale RDT en/of pulpa exponatie is het gebruik van een beschermende Ca(OH) 2 liner (vb. Dycal of Life ) onder het adhesief en de restauratie dan ook de behandeling bij voorkeur (46, 89, 97, 98). Onderstaande tabel (tabel 4.4) geeft een overzicht van 18 in vivo cytotoxiciteitsstudies van dentine adhesieven en enkele RM-GIC. Het betreft hier vooral pulp capping testen. In deze in vivo studies worden enkel merken met elkaar vergeleken, geen aparte componenten van adhesieven zoals bij de in vitro studies vaker het geval is. De geteste adhesieven worden weergegeven in tabel Resultaten De biocompatibiliteit van enkele dentine adhesieven en Ca(OH) 2 werd vergeleken door Costa et al. (99, 100) en Teixeira et al. (101). Buisjes van gepolymeriseerde adhesieven werden subcutaan geïmplanteerd bij ratten gedurende een bepaalde periode. De weefselreactie op de adhesieven werd vergeleken met deze van Ca(OH) 2, dat dienst deed als controle. In elk van de 3 studies was na 1-2 weken een milde tot hevige ontstekingsreactie van het bindweefsel merkbaar rondom de geïmplanteerde adhesieven en een chronische ontsteking ervan na 8-9 weken. Ontstekingsreacties waren afwezig bij Ca(OH) 2 en het omgevend bindweefsel vertoonde een volledige genezing (99-101). Deze studies tonen aan dat Ca(OH) 2 een uiterst biocompatibel materiaal is dat bovendien genezing van geïnflammeerd weefsel kan induceren. Dit kan niet gezegd worden van kunstharsadhesieven en -composieten (102), die cytotoxische effecten veroorzaken ter hoogte van de cellulaire omgeving en dus een onaanvaardbare biocompatibiliteit vertonen. De slechte biocompatibiliteit van kunstharsadhesieven en -composieten wordt tegengesproken door Cox et al. (103), die noch bij geëxposeerde noch bij niet-geëxposeerde pulpa s cytotoxische effecten merkten. Negen verschillende bondingsystemen en composieten werden geappliqueerd in diepe dentine caviteiten bij apen waar al dan niet pulpa exponatie was

47 veroorzaakt. Ook Akimoto et al. (104) merkten geen cytotoxiciteit van een dentine adhesief (Clearfil Liner Bond 2V) bij geëxposeerde en niet-geëxposeerde pulpa s. Clearfil Liner Bond 2V en Clearfil SE Bond (Kuraray ) zijn de meest geteste bondingsystemen uit tabel 4.4. Het zijn beiden 2-step self-etch adhesieven ( mild ) met een relatief lage cytotoxiciteit in vitro (zie ). Ook bij in vivo testen blijken de Clearfil adhesieven relatief weinig cytotoxiciteit te vertonen. Akimoto et al. (104) vonden in hun onderzoek bij apen geen cytotoxische effecten van Clearfil Liner Bond 2V wanneer deze als pulp capping agent of in diepe caviteiten gebruikt werd. Kitasako et al. (105) vonden in een animale pulp capping test zelfs een lagere cytotoxiciteit voor Clearfil Liner Bond 2V dan voor Ca(OH) 2. Deze resultaten worden bevestigd door Lu et al. (96), die geen significante verschillen zagen tussen Clearfil SE Bond en Ca(OH) 2. Alle andere onderzoeken tonen een grotere cytotoxiciteit voor de Clearfil adhesieven dan voor Ca(OH) 2 (75, 91, 93, 94, 106, 107). Accorinte et al. (94) vonden geen significante verschillen voor de cytotoxiciteit tussen Clearfil Liner Bond 2V en Clearfil SE Bond in een pulp capping test. Opmerkelijk is het verschil in cytotoxiciteit tussen Clearfil en Vitrebond (3M ESPE ) in de studies van Costa et al. (91) en de Souza Costa et al. (106). Waar de eerstgenoemde een grotere cytotoxiciteit vond voor Vitrebond, vond de laatstgenoemde een grotere cytotoxiciteit voor Clearfil. Vitrebond is een kunsthars-gemodificeerd GIC dat als liner of base (onderlaag) kan gebruikt worden onder restauraties. Scotchbond Multi-Purpose (3-step E&R) heeft net als bij de in vitro studies een grotere cytotoxiciteit dan de Clearfil adhesieven. Demarco et al. (75) vond in een pulp capping test dat Scotchbond Multi-Purpose de grootste cytotoxiciteit vertoonde. Adper Single Bond (3M ESPE ) is een relatief cytotoxisch 2-step E&R adhesief wanneer het gebruikt wordt als pulp capping materiaal (93), maar vertoont minder cytotoxische effecten na applicatie in diepe dentinecaviteiten (107). Prompt L-Pop (1-step SEA) en Etch&Prime 3.0 (1-step SEA, Degussa ) vertonen een lagere cytotoxiciteit dan Single Bond bij gebruik als pulpa-overkapping materiaal, terwijl ze een grotere cytotoxiciteit vertonen na applicatie in caviteiten zonder pulpa exponatie. Dit zou een gevolg kunnen zijn van de afzonderlijke etsprocedure die uitgevoerd wordt bij het etch-and-rinse adhesief Single Bond

48 Blootliggend pulpaweefsel ondergaat namelijk een extra irritatie door het etsen van de caviteit met 37% H 3 PO 4. Op basis van de eerder beperkte gegevens over de cytotoxiciteit van adhesieven in vivo (tabel 4.4), is het moeilijk om een vergelijking te maken tussen total-etch en self-etch adhesiefsystemen. Nayyar et al. (108) vonden een significant verschil qua cytotoxiciteit tussen een total-etch (Prime&Bond NT) en een self-etch adhesief (Xeno III) in diepe caviteiten. Ook Koliniotou-Koumpia et al. (93) merkten een grotere cytotoxiciteit voor het etch-and-rinse adhesief Single Bond dan voor de self-etch adhesieven Prompt L-Pop en Etch&Prime 3.0 na directe applicatie op geëxposeerde humane pulpa s. Na applicatie van dezelfde adhesieven in diepe dentinecaviteiten bij honden daarentegen, kwamen ze tot de conclusie dat de self-etch adhesieven cytotoxischer waren dan de etch-and-rinse adhesieven. Conclusie in vivo: - Uit het beperkte aantal in vivo studies die terug te vinden zijn in de literatuur kan geconcludeerd worden dat adhesiefsystemen een slechte biocompatibiliteit vertonen. Het is daarom af te raden pulpa-overkappingen uit te voeren met kunsthars bevattende materialen. De applicatie van een Ca(OH) 2 liner op de geëxposeerde pulpa is hier de behandeling bij voorkeur. Ca(OH) 2 is een zeer biocompatibel materiaal dat genezing van geïnflammeerd weefsel induceert en dentinebrug vorming stimuleert. - Het verschil in cytotoxiciteit tussen total-etch en self-etch adhesieven is minder duidelijk dan bij de in vitro studies (zie )

49 Tabel 4.4 Overzicht van de in vivo studies en hun resultaten betreffende cytotoxiciteit. Auteur Celcultuur Soort caviteit Testmethode Meest toxische component Meest toxisch adhesief Humaan Animaal Pulp capping Caviteit (Merk / Soort) Akimoto et al. (104) (1998) Monkey pulps Klasse I en V Klasse I en V Light microscopy Clearfil Liner Bond 2V = Ca(OH) 2 (geen toxiciteit) Cox et al. (103) (1998) Monkey pulps Klasse I en V Klasse I en V Light microscopy Geen toxische effecten zowel mét als zonder pulpa exponatie Tarim et al. (109) (1998) Monkey pulps Klasse V Light microscopy XR-primer > OptiBond Hebling et al. (22) (1999) Pulpa cellen Klasse V (gecontamineerd vs nietgecontamineerd) Light microscopy Gecontamineerd nietgecontamineerd (All Bond 2) > Ca(OH) 2 Hebling et al. (46) (1999) Pulpa cellen X Light microscopy All Bond 2 > Ca(OH) 2 Kitasako et al. (105) (1999) Monkey pulps Klasse V Light microscopy Super Bond C&B = Bondwell LC > Dycal > Clearfil Liner Bond 2V do Nascimento et al. (95) (2000) Pulpa cellen Buccale klasse V Light microscopy Vitrebond > Ca(OH) 2 Pereira et al. (90) (2000) Pulpa cellen X Light microscopy Scotchbond Multi-Purpose > Ca(OH) 2 Demarco et al. (75) (2001) Pulpa cellen X Light microscopy Scotchbond Multi-Purpose > Clearfil Liner Bond 2V >> Ca(OH) 2

50 Costa et al. (91) (2003) Rat pulpa cellen Klasse I Light microscopy Vitrebond > Clearfil Liner Bond 2V > Ca(OH) 2 Accorinte et al. (98) (2005) Pulpa cellen Mesioocclusale caviteiten Light microscopy Only primer > acid+primer+adhesive > only adhesive > only composite > CaOH 2 Ersin en Eronat (92) (2005) Pulpa cellen (human) Pulpa cellen (schapen) X Light microscopy Prime&Bond 2.1 > Ca(OH) 2 Koliniotou-Koumpia et al. (93) (2005) Pulpa cellen X Light microscopy Single Bond > Prompt L-Pop Etch&Prime 3.0 > Clearfil SE Bond > Ca(OH) 2 Lu et al. (96) (2006) Pulpa cellen (beagle dogs) Klasse V Light microscopy Clearfil SE Bond = Ca(OH) 2 de Souza Costa et al. (106) (2007) Pulpa cellen Klasse V Light microscopy Clearfil SE Bond > Ultra Blend Plus = Vitrebond > Dycal (Ca(OH) 2 ) Koliniotou-Koumpia et al. (107) (2007) Dog pulps Klasse V Light microscopy Etch&Prime 3.0 Prompt L-Pop > Single Bond Clearfil SE Bond > Dycal (Ca(OH) 2 ) Nayyar et al. (108) (2007) Pulpa cellen Klasse V Light microscopy Prime&Bond NT > Xeno III Accorinte et al. (94) (2008) Pulpa cellen Klasse I Light microscopy Clearfil Liner Bond 2V = Clearfil SE Bond > Ca(OH) 2 (X) = niet verder gespecificeerd in artikel.

51 5. DISCUSSIE & CONCLUSIE Verschillende factoren hebben een invloed op het al dan niet optreden van cytotoxiciteit van dentine adhesieven. Hierbij moet vooral gedacht worden aan de polymerisatiegraad van het adhesief, de permeabiliteit van het resterend dentine, de hoeveelheid resterend dentine op de bodem van de caviteit (RDT), de eventuele aanwezigheid van bacteriën, en de samenstelling en applicatieprocedure van het adhesief. De in vitro en in vivo cytotoxiciteitstudies die vergeleken worden in tabellen 4.3 en 4.4 houden niet allemaal rekening met deze beïnvloedende factoren en de bekomen resultaten zijn vaak model afhankelijk. Om de evaluatie en vergelijking van verschillende dentine adhesieven te optimaliseren, is er in de toekomst nood aan internationaal gestandaardiseerde testmodellen die rekening houden met alle mogelijke variabelen (55, 110). De graad van conversie van het adhesief (= percentage monomeren die effectief een polymerisatiereactie ondergaan hebben) speelt een niet onbelangrijke rol in de cytotoxiciteit van dentine adhesieven (47, ). Immers, hoe kleiner het percentage polymerisatie van het adhesief, hoe meer vrije, ongebonden monomeren in staat zijn om te diffunderen doorheen dentine richting pulpa of omgevende weefsels. Dit geldt eveneens voor primers die niet gepolymeriseerd worden en dus een aanzienlijke hoeveelheid vrije monomeren kunnen vrijstellen (47). Dit wordt duidelijk uit de studies van Bouillaguet et al. (86), Accorinte et al. (98) en Grobler et al. (76), waar de primer een grotere cytotoxiciteit vertoont dan de bonding. Vooral de kleine, hydrofiele (co)monomeren zoals HEMA en TEGDMA kunnen diffunderen uit primer en bonding, zowel in ongepolymeriseerde (47) als in gepolymeriseerde vorm (48, 49) (zie 4.1). Kaga et al. stelden echter dat de hoeveelheid gediffundeerde monomeren uit gepolymeriseerde adhesieven in vitro niet genoeg was om cytotoxiciteit te induceren (47). De graad van polymerisatie is zelden compleet en vooral afhankelijk van de lichtintensiteit en belichtingstijd waarmee het adhesief belicht wordt. Hoe lager de intensiteit en hoe korter de belichtingstijd, hoe minder vrije radicalen worden vrijgesteld door de (onvoldoende geactiveerde) initiators en hoe minder polymeren gevormd kunnen worden. Zelfs bij een optimale belichtingsprocedure zal steeds een deel ongebonden monomeren overblijven in de gepolymeriseerde adhesieflaag. Uit de studies van Sigush et al. en Chen et al. wordt duidelijk dat de lichtintensiteit (en hieruit volgend de graad van conversie) een effect heeft op de cytotoxiciteit van adhesieven (111, 112). Namelijk hoe lager de lichtintensiteit, hoe minder

52 polymerisatie van het adhesief, en hoe groter de cytotoxiciteit ervan. Hieruit volgt dat ook het type lichtbron van belang is. Ergün et al. merkten significant meer celoverleving bij adhesieven gepolymeriseerd met een LED-lamp (sterkte 1000 mw/cm 2 ; range nm) dan met een halogeenlamp (sterkte 650 mw/cm 2 ; range nm) (114). Een andere factor die het polymerisatieproces kan inhiberen is het contact van adhesief met zuurstof. Franz et al. vonden een significante reductie in de graad van conversie wanneer adhesieven gepolymeriseerd werden in contact met zuurstof (55). De niet-gepolymeriseerde buitenste laag van het adhesief wordt de zuurstof geïnhibeerde laag genoemd en zorgt voor een sterke hechting tussen adhesief en composietrestauratie. Aangezien deze laag enkel ongebonden monomeren bevat, kan dit bij de direct contact in vitro testen voor een extra irritatie van de celcultuur zorgen. Deze resultaten zijn dus minder betrouwbaar aangezien in de in vivo situatie geen zuurstof geïnhibeerde laag voorkomt aan de pulpale zijde van het adhesief, en dus ook een kleinere concentratie vrije monomeren. Verder zijn nog de aanwezigheid van intrinsiek water uit de dentinetubuli en residuele solventen uit de primer nefast voor de volledige polymerisatie van adhesieven, met een verhoogde concentratie uitloogbare monomeren tot gevolg (1). Ook de permeabiliteit van dentine speelt een belangrijke rol in de cytotoxiciteit van adhesieven (42). Uit figuur 1.1 wordt duidelijk dat de permeabiliteit van dentine niet overal gelijk is: hoe dichter tegen de pulpa, hoe groter het aantal en de diameter van de tubuli. Jonge tanden hebben bovendien een grotere permeabiliteit dan oudere tanden (25). Het gebruik van beschermende liners in diepe caviteiten bij jonge patiënten is daarom aangeraden, mede omdat het etsen van dentine de permeabiliteit nog doet toenemen (23, 25). Bouillaguet et al. kwamen tot de conclusie dat adhesieven cytotoxisch waren na diffusie doorheen dentine met zowel een lage, medium als hoge permeabiliteit en een RDT van 0.5 mm (115). Deze cytotoxiciteit is echter sterk afhankelijk van het soort adhesief en zijn samenstelling. Cavalheiro et al. onderzochten de invloed van een incorrecte primer applicatie op de dentine permeabiliteit in vitro (38). De minste toename in permeabiliteit werd bekomen wanneer de primer aangebracht werd volgens de richtlijnen van de fabrikant. Verkeerde applicaties van de primer (agressief drogen, te korte applicatietijd, geen primer applicatie) leidden tot een toename in permeabiliteit en dus tot een te verwachten toename in diffusie van vrije monomeren. Een belangrijk verdedigingsmechanisme van het pulpa-dentine complex is de pulserende uitstroom van tubulair vocht van zodra de tubuli geopend zijn en in contact staan met het

53 intra-orale milieu (4). Op deze manier tracht de pulpa te verhinderen dat schadelijke stoffen (zoals monomeren uit adhesieven) door diffusie via de dentinetubuli de pulpa bereiken. Bovendien bevat dentinevocht enkele plasmaproteïnen (albumine en globulines) die kunnen agglutineren en zo de tubuli afsluiten (4). De uitwaartse stroom tubulair vocht kan de inwaartse diffusie van toxische stoffen en bacteriën evenwel niet volledig compenseren. In vitro dentin barrier studies die de cytotoxiciteit van adhesieven testen zonder de uitwaartse vloeistofstroom te simuleren, geven minder betrouwbare resultaten in vergelijking met in vivo studies. Figuren 5.1 A en B tonen een in vitro testopstelling voor het meten van de cytotoxiciteit van adhesieven onder een gesimuleerde pulpale druk (42). Fig 5.1 Schematische (A) en werkelijke (B) weergave van een testopstelling voor het meten van de cytotoxiciteit van adhesieven onder gesimuleerde pulpale druk. De pijlen in (A) geven de drukgradiënt weer. (Aangepast naar Camps et al. (42)) Een tweede vorm van pulpa bescherming op langere termijn is de vorming van tertiair dentine (116). Tertiair (reparatief of reactionair) dentine kan door odontoblasten gevormd worden aan de pulpale zijde van een caviteit ter bescherming tegen externe irritaties. Dit tertiair dentine vormt een bijkomende barrière tussen pulpa en caviteit en beschermt als dusdanig de pulpa tegen thermische en/of chemische irritantia. De vorming van tertiair dentine is gecorreleerd met de RDT, de leeftijd van de patiënt, het restauratiemateriaal, en de breedte en oppervlakte van de caviteit (117). Murray et al. (118) toonden aan dat een maximale hoeveelheid reparatief dentine werd gevormd wanneer de caviteitswand een RDT had tussen mm. Bij een RDT lager dan 0.25 mm werden er meer odontoblasten aangetast en dus minder reparatief dentine gevormd. De vorming van tertiair dentine was het grootst bij Ca(OH) 2, en

54 afnemend bij composiet, RM-GIC en zinkoxide eugenol cement. Deze resultaten worden bevestigd door verschillende pulp capping studies waarbij geëxposeerde pulpa s overkapt werden met dentine adhesieven (46, 89, 92, 119). Pulpa s vertoonden chronische inflammatie en onvolledige/afwezige dentinebrug vorming. Directe pulpa-overkappingen worden daarom best niet uitgevoerd met kunsthars bevattende materialen, maar wel met een Ca(OH) 2 liner (89, 97). In tegenstelling tot deze studies merkten Costa et al. wel pulpa genezing en dentinebrug vorming na pulpa-overkapping met een self-etch adhesief en RM-GIC (91). Het is duidelijk dat er een sterke correlatie bestaat tussen de RDT (residual/remaining dentin thickness) van de caviteitswand en het al dan niet optreden van cytotoxiciteit van bepaalde restauratiematerialen zowel in vitro (25, 39, 115, 120, 121) als in vivo (22, 108, 122). Stanley et al. trachtten reeds in 1979 om dit verband weer te geven in een lineaire regressie formule van het type: y = a bx (120). Hierin is y: de pulpa respons, a: de pulpa respons bij een RDT = 0, b: de (negatieve) helling van de lineaire regressie en x: de RDT. Hoe groter de RDT, hoe dikker de barrière tussen pulpa en caviteit zal zijn, en dus hoe minder pulpa respons er optreedt ten gevolge van chemische en/of thermische irritatie. Ook hier hebben het soort adhesief (samenstelling) en de permeabiliteit van het resterend dentine een belangrijke invloed op de cytotoxiciteit. Deze significante correlatie wordt bevestigd door verschillende studies. Bouillaguet et al. (115) zagen cytotoxische effecten van adhesieven bij een RDT van 0.5 mm terwijl Cetingüç et al. (25) geen cytotoxiciteit merkten bij een RDT van 1.0 mm, beide in vitro studies. Hebling et al. stelden de kritische RDT (in vivo) waarbij geen chronische inflammatie van pulpaweefsel meer optreedt op 300 µm (0.3 mm) (22). Murray et al. bevestigden deze resultaten met een kritische RDT van 0.25 mm (118). Algemeen kan gesteld worden dat een minimale RDT van 0.5 mm een merkbaar betere bescherming van de pulpa geeft tegen chemische irritatie afkomstig van etsvloeistof en gediffundeerde componenten uit het adhesief. Eén van de grote onbekende variabelen in het veroorzaken van cytotoxiciteit is de aanwezigheid van bacteriën in de caviteit. Verschillende in vitro en in vivo studies hebben intussen aangetoond dat dentine adhesieven cytotoxische effecten hebben op de pulpa, maar waarschijnlijk spelen bacteriën hierin een belangrijke bijkomende rol. Bouillaguet maakte in zijn review een onderverdeling tussen directe en indirecte biologische risico s van kunstharsmaterialen in de restauratieve tandheelkunde (26). Directe biologische risico s worden veroorzaakt door de toxische eigenschappen van de kunsthars zelf, indirecte

55 biologische risico s door de contaminatie met bacteriën op korte of langere termijn (micro- en nanolekkage). Indirecte risico s kunnen beperkt worden door een volledige cariës verwijdering, steriele werkomstandigheden, het gebruik van desinfectantia, het verzorgen van een perfecte afsluiting van de restauratie en het beperken van de polymerisatiekrimp. Wanneer de directe en indirecte risico s zoveel mogelijk gereduceerd kunnen worden, is de kans op pulpa inflammatie op korte en lange termijn beperkt. In hun onderzoek toonden Hebling et al. (22), About et al. (122) en Nayyar et al. (108) een significante correlatie aan tussen de aanwezigheid van bacteriën in de caviteit en inflammatoire pulpa respons. Camps et al. vonden dat een bacteriële contaminatie van de caviteit een significant grotere invloed heeft op het optreden van cytotoxiciteit dan de residual dentin thickness (37). Tziafas et al. onderzochten de invloed van het antibacteriële monomeer MDPB op de pulpa respons en dentinebrug vorming in gecontamineerde caviteiten in vivo (RDT mm) (123). Het MDPB-adhesief had geen cytotoxische effecten in gecontamineerde caviteiten met of zonder pulpa exponatie. Dentinebrug vorming onder deze caviteiten was vergelijkbaar met deze onder caviteiten bedekt met een Ca(OH) 2 liner. Men kan dus stellen dat het antibacteriële monomeer MDPB efficiënt is in het reduceren van bacteriële contaminatie (op korte en lange termijn) en het ondersteunen van pulpa herstel. Zoals reeds vermeld in 1.4 worden glazuur en dentine geëtst met een zuur (meestal 32-37% H 3 PO 4 ) alvorens een kunstharsadhesief aan te brengen. Afhankelijk van het soort bondingsysteem zal het etsen in een afzonderlijke etsprocedure uitgevoerd worden (etchand-rinse adhesieven), dan wel gecombineerd worden met het appliqueren van de primer en/of bonding (self-etch adhesieven). In vitro onderzoek heeft aangetoond dat etsen van 0.5 mm dikke dentine schijfjes met 35% fosforzuur een significante ph daling veroorzaakt aan de pulpale zijde ervan (124). Dit zou erop kunnen wijzen dat niet alleen kunstharsmonomeren en andere componenten van het adhesief verantwoordelijk zijn voor cytotoxiciteit, maar eveneens de ph daling die veroorzaakt wordt door de etsprocedure. Het etsen van dentine zorgt er bovendien voor dat de permeabiliteit toeneemt, wat de diffusie van toxische componenten in de hand werkt (23). Een ph daling was niet merkbaar bij self-etching primers en all-in-one adhesieven in vitro (124). Dit zou dan ook een verklaring kunnen zijn voor het feit dat de self-etch adhesieven minder cytotoxiciteit vertonen bij in vitro studies dan de etchand-rinse adhesieven (zie )

56 Algemene conclusie: - De besproken studies tonen aan dat vrije kunstharsmonomeren de belangrijkste oorzaak zijn van cytotoxiciteit van dentine adhesieven. De cytotoxiciteit van de 4 meest gebruikte (co)monomeren kan gerangschikt worden van meest naar minst toxisch volgens: UDMA > Bis-GMA > TEGDMA >>> HEMA. Het zijn vooral de hydrofiele (co)monomeren met een laag moleculair gewicht zoals HEMA en TEGDMA die kunnen diffunderen naar de pulpa en verantwoordelijk zijn voor de cytotoxische effecten. Andere cytotoxische componenten zoals CQ, BPO, MEHQ en BHT komen enkel in minieme concentraties voor ter hoogte van de pulpa zodat ze slechts in geringe mate bijdragen aan de cytotoxiciteit van adhesieven. - De in vitro studies uit deze review tonen aan dat de total-etch adhesieven cytotoxischer zijn dan de self-etch adhesieven. Bovendien vertonen de mild selfetch (ph + /- 2) minder cytotoxische effecten dan de strong self-etch (ph < 1) adhesieven. Het verschil in cytotoxiciteit tussen total-etch en self-etch adhesieven is minder duidelijk bij de in vivo studies, mede omwille van het beperkt aantal van deze studies in de literatuur. - Een RDT 0.5 mm geeft reeds een merkbaar betere bescherming van de pulpa tegen cytotoxische componenten uit dentine adhesieven. - Pulp capping met kunsthars materialen (adhesieven) wordt zowel door fabrikanten als de literatuur afgeraden, Ca(OH) 2 is in dit geval de voorkeursbehandeling. - In de toekomst is er nog meer in vivo onderzoek nodig naar de cytotoxiciteit van adhesieven en hiervoor is er bovendien nood aan de ontwikkeling van internationaal gestandaardiseerde testmethoden. Cytotoxiciteitstesten uit het verleden zijn sterk model afhankelijk en kunnen daarom moeilijk met elkaar vergeleken worden

57 Guidelines voor het gebruik van dentine adhesieven: - Bij het klinisch gebruik van adhesiefsystemen dienen de richtlijnen zoals voorgeschreven door de fabrikant zeer strikt gevolgd te worden (etsen primer bonding). - Etch-and-rinse adhesieven geven de beste klinische resultaten qua hechting aan glazuur en dentine, maar self-etch adhesieven geven minder secundaire cariës op lange termijn (nanolekkage). - Op vlak van cytotoxiciteit geven de self-etch adhesieven de beste resultaten, en de etch-and-rinse adhesieven de slechtste. - Belangrijke klinische handelingen: volledige cariës curettage, vermijden van bacteriële contaminatie door steriel te werken, gebruik van desinfectantia, verzorgen van een goede afsluiting (seal) tussen restauratie en caviteitswand, volledige polymerisatie nastreven en beperken van de polymerisatiekrimp. - Verbeteringen in de toekomst qua materialen: toevoegen van MMP s aan etsgel en/of andere componenten, het gebruik antibacteriële monomeren en desinfectantia, en verdere ontwikkeling van monomeervrije adhesieven ter vermindering van de cytotoxiciteit

58 6. REFERENTIES 1. Van Landuyt KL, Snauwaert J, De Munck J, Peumans M, Yoshida Y, Poitevin A, et al. Systematic review of the chemical composition of contemporary dental adhesives. Biomaterials Sep;28(26): Buonocore MG. A simple method of increasing the adhesion of acrylic filling materials to enamel surfaces. J Dent Res Dec;34(6): Buonocore MG. Principles of Adhesive Retention and Adhesive Restorative Materials. J Am Dent Assoc Sep;67: Pashley DH. Dynamics of the pulpo-dentin complex. Crit Rev Oral Biol Med. 1996;7(2): Kugel G, Ferrari M. The science of bonding: from first to sixth generation. J Am Dent Assoc Jun;131 Suppl:20S-5S. 6. Fusayama T, Nakamura M, Kurosaki N, Iwaku M. Non-pressure adhesion of a new adhesive restorative resin. J Dent Res Apr;58(4): Kanca J, 3rd. Improving bond strength through acid etching of dentin and bonding to wet dentin surfaces. J Am Dent Assoc Sep;123(9): Nakabayashi N, Kojima K, Masuhara E. The promotion of adhesion by the infiltration of monomers into tooth substrates. J Biomed Mater Res May;16(3): Van Meerbeek B, Inokoshi S, Braem M, Lambrechts P, Vanherle G. Morphological aspects of the resin-dentin interdiffusion zone with different dentin adhesive systems. J Dent Res Aug;71(8): Van Meerbeek B, Dhem A, Goret-Nicaise M, Braem M, Lambrechts P, VanHerle G. Comparative SEM and TEM examination of the ultrastructure of the resin-dentin interdiffusion zone. J Dent Res Feb;72(2): Van Meerbeek B, De Munck J, Yoshida Y, Inoue S, Vargas M, Vijay P, et al. Buonocore memorial lecture. Adhesion to enamel and dentin: current status and future challenges. Oper Dent May-Jun;28(3): Buonocore MG, Matsui A, Gwinnett AJ. Penetration of resin dental materials into enamel surfaces with reference to bonding. Arch Oral Biol Jan;13(1): Koshiro K, Inoue S, Sano H, De Munck J, Van Meerbeek B. In vivo degradation of resin-dentin bonds produced by a self-etch and an etch-and-rinse adhesive. Eur J Oral Sci Aug;113(4): Moszner N, Salz U, Zimmermann J. Chemical aspects of self-etching enamel-dentin adhesives: a systematic review. Dent Mater Oct;21(10): Peumans M, Kanumilli P, De Munck J, Van Landuyt K, Lambrechts P, Van Meerbeek B. Clinical effectiveness of contemporary adhesives: a systematic review of current clinical trials. Dent Mater Sep;21(9): Yoshida Y, Nagakane K, Fukuda R, Nakayama Y, Okazaki M, Shintani H, et al. Comparative study on adhesive performance of functional monomers. J Dent Res Jun;83(6): Yoshida Y, Van Meerbeek B, Nakayama Y, Snauwaert J, Hellemans L, Lambrechts P, et al. Evidence of chemical bonding at biomaterial-hard tissue interfaces. J Dent Res Feb;79(2): Pashley DH, Tay FR, Breschi L, Tjaderhane L, Carvalho RM, Carrilho M, et al. State of the art etch-and-rinse adhesives. Dent Mater Jan;27(1): Van Meerbeek B, Kanumilli PV, De Munck J, Van Landuyt K, Lambrechts P, Peumans M. A randomized, controlled trial evaluating the three-year clinical effectiveness of two etch & rinse adhesives in cervical lesions. Oper Dent Jul-Aug;29(4): Leinfelder KF. Is there a standardized procedure for bonding? J Am Dent Assoc Oct;130(10): Perdigao J. Dentin bonding-variables related to the clinical situation and the substrate treatment. Dent Mater Feb;26(2):e Hebling J, Giro EM, Costa CA. Human pulp response after an adhesive system application in deep cavities. J Dent Nov;27(8): Stanley HR, Going RE, Chauncey HH. Human pulp response to acid pretreatment of dentin and to composite restoration. J Am Dent Assoc Oct;91(4): Pashley DH, Michelich V, Kehl T. Dentin permeability: effects of smear layer removal. J Prosthet Dent Nov;46(5): Cetinguc A, Olmez S, Vural N. HEMA diffusion from dentin bonding agents in young and old primary molars in vitro. Dent Mater Mar;23(3): Bouillaguet S. Biological Risks of Resin-Based Materials to the Dentin-Pulp Complex. Crit Rev Oral Biol Med. 2004;15(1): Loguercio AD, Reis A. Application of a dental adhesive using the self-etch and etch-and-rinse approaches: an 18- month clinical evaluation. J Am Dent Assoc Jan;139(1): Venz S, Dickens B. Modified surface-active monomers for adhesive bonding to dentin. J Dent Res Mar;72(3): Mine A, De Munck J, Van Landuyt KL, Poitevin A, Kuboki T, Yoshida Y, et al. Bonding effectiveness and interfacial characterization of a HEMA/TEGDMA-free three-step etch&rinse adhesive. J Dent Oct;36(10): Van Landuyt KL, Peumans M, Fieuws S, De Munck J, Cardoso MV, Ermis RB, et al. A randomized controlled clinical trial of a HEMA-free all-in-one adhesive in non-carious cervical lesions at 1 year. J Dent Oct;36(10):

59 31. Datar R, Rueggeberg FA, Caughman GB, Wataha JC, Lewis J, Schuster GS. Effects of subtoxic concentrations of benzoyl peroxide on cell lipid metabolism. J Biomed Mater Res A Dec 15;71(4): Datar RA, Rueggeberg FA, Caughman GB, Wataha JC, Lewis JB, Schuster GS. Effects of sub-toxic concentrations of camphorquinone on cell lipid metabolism. J Biomater Sci Polym Ed. 2005;16(10): Atsumi T, Ishihara M, Kadoma Y, Tonosaki K, Fujisawa S. Comparative radical production and cytotoxicity induced by camphorquinone and 9-fluorenone against human pulp fibroblasts. J Oral Rehabil Dec;31(12): Volk J, Ziemann C, Leyhausen G, Geurtsen W. Non-irradiated campherquinone induces DNA damage in human gingival fibroblasts. Dent Mater Dec;25(12): Reed M, Fujiwara H, Thompson DC. Comparative metabolism, covalent binding and toxicity of BHT congeners in rat liver slices. Chem Biol Interact Nov 28;138(2): Lapp CA, Schuster GS. Effects of DMAEMA and 4-methoxyphenol on gingival fibroblast growth, metabolism, and response to interleukin-1. J Biomed Mater Res Apr;60(1): Camps J, Dejou J, Remusat M, About I. Factors influencing pulpal response to cavity restorations. Dent Mater Nov;16(6): Cavalheiro A, Vargas MA, Armstrong SR, Dawson DV, Gratton DG. Effect of incorrect primer application on dentin permeability. J Adhes Dent Dec;8(6): Bouillaguet S, Wataha JC, Hanks CT, Ciucchi B, Holz J. In vitro cytotoxicity and dentin permeability of HEMA. J Endod May;22(5): Schmalz G, Schuster U, Nuetzel K, Schweikl H. An in vitro pulp chamber with three-dimensional cell cultures. J Endod Jan;25(1): Schuster U, Schmalz G, Thonemann B, Mendel N, Metzl C. Cytotoxicity testing with three-dimensional cultures of transfected pulp-derived cells. J Endod Apr;27(4): Camps J, Tardieu C, Dejou J, Franquin JC, Ladaique P, Rieu R. In vitro cytotoxicity of dental adhesive systems under simulated pulpal pressure. Dent Mater Jan;13(1): Hanks CT, Wataha JC, Parsell RR, Strawn SE. Delineation of cytotoxic concentrations of two dentin bonding agents in vitro. J Endod Dec;18(12): Gerzina TM, Hume WR. Diffusion of monomers from bonding resin-resin composite combinations through dentine in vitro. J Dent Jan-Mar;24(1-2): Vajrabhaya LO, Pasasuk A, Harnirattisai C. Cytotoxicity evaluation of single component dentin bonding agents. Oper Dent Jul-Aug;28(4): Hebling J, Giro EM, Costa CA. Biocompatibility of an adhesive system applied to exposed human dental pulp. J Endod Oct;25(10): Kaga M, Noda M, Ferracane JL, Nakamura W, Oguchi H, Sano H. The in vitro cytotoxicity of eluates from dentin bonding resins and their effect on tyrosine phosphorylation of L929 cells. Dent Mater Jul;17(4): Spahl W, Budzikiewicz H, Geurtsen W. Determination of leachable components from four commercial dental composites by gas and liquid chromatography/mass spectrometry. J Dent Mar;26(2): Geurtsen W, Spahl W, Muller K, Leyhausen G. Aqueous extracts from dentin adhesives contain cytotoxic chemicals. J Biomed Mater Res. 1999;48(6): Ratanasathien S, Wataha JC, Hanks CT, Dennison JB. Cytotoxic interactive effects of dentin bonding components on mouse fibroblasts. J Dent Res Sep;74(9): Volk J, Engelmann J, Leyhausen G, Geurtsen W. Effects of three resin monomers on the cellular glutathione concentration of cultured human gingival fibroblasts. Dent Mater Jun;22(6): Geurtsen W, Lehmann F, Spahl W, Leyhausen G. Cytotoxicity of 35 dental resin composite monomers/additives in permanent 3T3 and three human primary fibroblast cultures. J Biomed Mater Res Sep 5;41(3): Hanks CT, Strawn SE, Wataha JC, Craig RG. Cytotoxic effects of resin components on cultured mammalian fibroblasts. J Dent Res Nov;70(11): Hashieh IA, Cosset A, Franquin JC, Camps J. In vitro cytotoxicity of one-step dentin bonding systems. J Endod Feb;25(2): Franz A, Konig F, Lucas T, Watts DC, Schedle A. Cytotoxic effects of dental bonding substances as a function of degree of conversion. Dent Mater Feb;25(2): Goldberg M. In vitro and in vivo studies on the toxicity of dental resin components: a review. Clin Oral Investig Mar;12(1): Stanislawski L, Lefeuvre M, Bourd K, Soheili-Majd E, Goldberg M, Perianin A. TEGDMA-induced toxicity in human fibroblasts is associated with early and drastic glutathione depletion with subsequent production of oxygen reactive species. J Biomed Mater Res A Sep 1;66(3): Huang FM, Li YC, Lee SS, Chang YC. Cytotoxicity of dentine bonding agents on human pulp cells is related to intracellular glutathione levels. Int Endod J Dec;43(12): Yeh HW, Chang MC, Lin CP, Tseng WY, Chang HH, Wang TM, et al. Comparative cytotoxicity of five current dentin bonding agents: role of cell cycle deregulation. Acta Biomater Nov;5(9): Chang HH, Guo MK, Kasten FH, Chang MC, Huang GF, Wang YL, et al. Stimulation of glutathione depletion, ROS production and cell cycle arrest of dental pulp cells and gingival epithelial cells by HEMA. Biomaterials Mar;26(7): Volk J, Leyhausen G, Dogan S, Geurtsen W. Additive effects of TEGDMA and hydrogenperoxide on the cellular glutathione content of human gingival fibroblasts. Dent Mater Aug;23(8): Demirci M, Hiller KA, Bosl C, Galler K, Schmalz G, Schweikl H. The induction of oxidative stress, cytotoxicity, and genotoxicity by dental adhesives. Dent Mater Mar;24(3):

60 63. Chang MC, Lin LD, Chan CP, Chang HH, Chen LI, Lin HJ, et al. The effect of BisGMA on cyclooxygenase-2 expression, PGE2 production and cytotoxicity via reactive oxygen species- and MEK/ERK-dependent and -independent pathways. Biomaterials Sep;30(25): Chang MC, Chen LI, Chan CP, Lee JJ, Wang TM, Yang TT, et al. The role of reactive oxygen species and hemeoxygenase-1 expression in the cytotoxicity, cell cycle alteration and apoptosis of dental pulp cells induced by BisGMA. Biomaterials Nov;31(32): Engelmann J, Janke V, Volk J, Leyhausen G, von Neuhoff N, Schlegelberger B, et al. Effects of BisGMA on glutathione metabolism and apoptosis in human gingival fibroblasts in vitro. Biomaterials Aug;25(19): Prica D, Galic N, Zeljezic D, Prica A. Genotoxicity evaluation of five different dentin bonding agents by chromosomal aberration analysis. J Oral Rehabil Jun;33(6): Schweikl H, Schmalz G. Toxicity parameters for cytotoxicity testing of dental materials in two different mammalian cell lines. Eur J Oral Sci Jun;104(3): Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. J Immunol Methods Dec 16;65(1-2): Moodley D, Grobler SR, Olivler A. Cytotoxicity of a dentine bonding agent on four different cell-lines. SADJ Jul;60(6): Schmalz G, Hiller KA, Nunez LJ, Stoll J, Weis K. Permeability characteristics of bovine and human dentin under different pretreatment conditions. J Endod Jan;27(1): Koliniotou-Koubia E, Dionysopoulos P, Koulaouzidou EA, Kortsaris AH, Papadogiannis Y. In vitro cytotoxicity of six dentin bonding agents. J Oral Rehabil Oct;28(10): Szep S, Kunkel A, Ronge K, Heidemann D. Cytotoxicity of modern dentin adhesives--in vitro testing on gingival fibroblasts. J Biomed Mater Res. 2002;63(1): Koulaouzidou EA, Helvatjoglu-Antoniades M, Palaghias G, Karanika-Kouma A, Antoniades D. Cytotoxicity evaluation of an antibacterial dentin adhesive system on established cell lines. J Biomed Mater Res B Appl Biomater Jan;84(1): Murray PE, Lumley PJ, Ross HF, Smith AJ. Tooth slice organ culture for cytotoxicity assessment of dental materials. Biomaterials Aug;21(16): Demarco FF, Tarquinio SB, Jaeger MM, de Araujo VC, Matson E. Pulp response and cytotoxicity evaluation of 2 dentin bonding agents. Quintessence Int Mar;32(3): Grobler SR, Oliver A, Moodley D, Van Wyk Kotze TJ. Cytotoxicity of recent dentin bonding agents on mouse fibroblast cells. Quintessence Int Jun;39(6): Huang FM, Chang YC. Cytotoxicity of dentine-bonding agents on human pulp cells in vitro. Int Endod J Nov;35(11): Lanza CR, de Souza Costa CA, Furlan M, Alecio A, Hebling J. Transdentinal diffusion and cytotoxicity of selfetching adhesive systems. Cell Biol Toxicol Dec;25(6): Costa CA, Vaerten MA, Edwards CA, Hanks CT. Cytotoxic effects of current dental adhesive systems on immortalized odontoblast cell line MDPC-23. Dent Mater Nov;15(6): Chen RS, Liu CC, Tseng WY, Jeng JH, Lin CP. Cytotoxicity of three dentin bonding agents on human dental pulp cells. J Dent Mar;31(3): Porto IC, Oliveira DC, Raele RA, Ribas KH, Montes MA, De Castro CM. Cytotoxicity of current adhesive systems: in vitro testing on cell cultures of primary murine macrophages. Dent Mater Mar;27(3): Yasuda Y, Inuyama H, Maeda H, Akamine A, Nor JE, Saito T. Cytotoxicity of one-step dentin-bonding agents toward dental pulp and odontoblast-like cells. J Oral Rehabil Dec;35(12): Koulaouzidou EA, Helvatjoglu-Antoniades M, Palaghias G, Karanika-Kouma A, Antoniades D. Cytotoxicity of dental adhesives in vitro. Eur J Dent Jan;3(1): Lan WH, Lan WC, Wang TM, Lee YL, Tseng WY, Lin CP, et al. Cytotoxicity of conventional and modified glass ionomer cements. Oper Dent May-Jun;28(3): Souza PP, Aranha AM, Hebling J, Giro EM, Costa CA. In vitro cytotoxicity and in vivo biocompatibility of contemporary resin-modified glass-ionomer cements. Dent Mater Sep;22(9): Bouillaguet S, Ciucchi B, Holz J. [The evaluation of the cytotoxicity of 2 dental adhesives using human pulp cells in culture]. Schweiz Monatsschr Zahnmed. 1993;103(9): Porto IC, Andrade AK, Guenes GM, Ribeiro AI, Braz R, Castro CM. In vitro potential cytotoxicity of an adhesive system to alveolar macrophages. Braz Dent J. 2009;20(3): Ulker HE, Sengun A. Cytotoxicity Evaluation of Self Adhesive Composite Resin Cements by Dentin Barrier Test on 3D Pulp Cells. Eur J Dent Apr;3(2): Costa CA, Hebling J, Hanks CT. Current status of pulp capping with dentin adhesive systems: a review. Dent Mater May;16(3): Pereira JC, Segala AD, Costa CA. Human pulpal response to direct pulp capping with an adhesive system. Am J Dent Jun;13(3): Costa CA, Oliveira MF, Giro EM, Hebling J. Biocompatibility of resin-based materials used as pulp-capping agents. Int Endod J Dec;36(12): Ersin NK, Eronat N. The comparison of a dentin adhesive with calcium hydroxide as a pulp-capping agent on the exposed pulps of human and sheep teeth. Quintessence Int Apr;36(4): Koliniotou-Koumpia E, Tziafas D. Pulpal responses following direct pulp capping of healthy dog teeth with dentine adhesive systems. J Dent Sep;33(8): Accorinte ML, Loguercio AD, Reis A, Costa CA. Response of human pulps capped with different self-etch adhesive systems. Clin Oral Investig Jun;12(2):

61 95. do Nascimento AB, Fontana UF, Teixeira HM, Costa CA. Biocompatibility of a resin-modified glass-ionomer cement applied as pulp capping in human teeth. Am J Dent Feb;13(1): Lu Y, Liu T, Li X, Li H, Pi G. Histologic evaluation of direct pulp capping with a self-etching adhesive and calcium hydroxide in beagles. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod Oct;102(4):e Modena KC, Casas-Apayco LC, Atta MT, Costa CA, Hebling J, Sipert CR, et al. Cytotoxicity and biocompatibility of direct and indirect pulp capping materials. J Appl Oral Sci Nov-Dec;17(6): Accorinte Mde L, Loguercio AD, Reis A, Muench A, de Araujo VC. Adverse effects of human pulps after direct pulp capping with the different components from a total-etch, three-step adhesive system. Dent Mater Jul;21(7): Costa CA, Teixeira HM, do Nascimento AB, Hebling J. Biocompatibility of two current adhesive resins. J Endod Sep;26(9): Costa CA, Teixeira HM, do Nascimento AB, Hebling J. Biocompatibility of an adhesive system and 2- hydroxyethylmethacrylate. ASDC J Dent Child Sep-Oct;66(5):337-42, Teixeira HM, Do Nascimento AB, Hebling J, De Souza Costa CA. In vivo evaluation of the biocompatibility of three current bonding agents. J Oral Rehabil Jul;33(7): Nasjleti CE, Castelli WA, Caffesse RG. Effects of composite restorations on the periodontal membrane in monkeys. J Dent Res Jan;62(1): Cox CF, Hafez AA, Akimoto N, Otsuki M, Suzuki S, Tarim B. Biocompatibility of primer, adhesive and resin composite systems on non-exposed and exposed pulps of non-human primate teeth. Am J Dent Jan;11 Spec No:S Akimoto N, Momoi Y, Kohno A, Suzuki S, Otsuki M, Cox CF. Biocompatibility of Clearfil Liner Bond 2 and Clearfil AP-X system on nonexposed and exposed primate teeth. Quintessence Int Mar;29(3): Kitasako Y, Inokoshi S, Tagami J. Effects of direct resin pulp capping techniques on short-term response of mechanically exposed pulps. J Dent May;27(4): de Souza Costa CA, Teixeira HM, Lopes do Nascimento AB, Hebling J. Biocompatibility of resin-based dental materials applied as liners in deep cavities prepared in human teeth. J Biomed Mater Res B Appl Biomater Apr;81(1): Koliniotou-Koumpia E, Papadimitriou S, Tziafas D. Pulpal responses after application of current adhesive systems to deep cavities. Clin Oral Investig Dec;11(4): Nayyar S, Tewari S, Arora B. Comparison of human pulp response to total-etch and self-etch bonding agents. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod Aug;104(2):e Tarim B, Hafez AA, Suzuki SH, Suzuki S, Cox CF. Biocompatibility of Optibond and XR-Bond adhesive systems in nonhuman primate teeth. Int J Periodontics Restorative Dent Feb;18(1): Bouillaguet S, Wataha JC. Future directions in bonding resins to the dentine-pulp complex. J Oral Rehabil Apr;31(4): Sigusch BW, Pflaum T, Volpel A, Schinkel M, Jandt KD. The influence of various light curing units on the cytotoxicity of dental adhesives. Dent Mater Nov;25(11): Chen RS, Liuiw CC, Tseng WY, Hong CY, Hsieh CC, Jeng JH. The effect of curing light intensity on the cytotoxicity of a dentin-bonding agent. Oper Dent Sep-Oct;26(5): Mantellini MG, Botero TM, Yaman P, Dennison JB, Hanks CT, Nor JE. Adhesive resin induces apoptosis and cellcycle arrest of pulp cells. J Dent Res Aug;82(8): Ergun G, Egilmez F, Uctasli MB, Yilmaz S. Effect of light curing type on cytotoxicity of dentine-bonding agents. Int Endod J Mar;40(3): Bouillaguet S, Virgillito M, Wataha J, Ciucchi B, Holz J. The influence of dentine permeability on cytotoxicity of four dentine bonding systems, in vitro. J Oral Rehabil Jan;25(1): Murray PE, Lumley PJ, Smith AJ. Preserving the vital pulp in operative dentistry: 3. Thickness of remaining cavity dentine as a key mediator of pulpal injury and repair responses. Dent Update May;29(4): Murray PE, About I, Lumley PJ, Smith G, Franquin JC, Smith AJ. Postoperative pulpal and repair responses. J Am Dent Assoc Mar;131(3): Murray PE, About I, Lumley PJ, Franquin JC, Remusat M, Smith AJ. Cavity remaining dentin thickness and pulpal activity. Am J Dent Feb;15(1): Subay RK, Demirci M. Pulp tissue reactions to a dentin bonding agent as a direct capping agent. J Endod Mar;31(3): Stanley HR, Bowen RL, Folio J. Compatibility of various materials with oral tissues. II: Pulp responses to composite ingredients. J Dent Res May;58(5): Galler K, Hiller KA, Ettl T, Schmalz G. Selective influence of dentin thickness upon cytotoxicity of dentin contacting materials. J Endod May;31(5): About I, Murray PE, Franquin JC, Remusat M, Smith AJ. Pulpal inflammatory responses following non-carious class V restorations. Oper Dent Jul-Aug;26(4): Tziafas D, Koliniotou-Koumpia E, Tziafa C, Papadimitriou S. Effects of a new antibacterial adhesive on the repair capacity of the pulp-dentine complex in infected teeth. Int Endod J Jan;40(1): Hiraishi N, Kitasako Y, Nikaido T, Foxton RM, Tagami J, Nomura S. Detection of acid diffusion through bovine dentine after adhesive application. Int Endod J Jul;37(7):

62 BIJLAGEN ELSEVIER LICENSE TERMS AND CONDITIONS Jan 16, 2011 This is a License Agreement between Bavo Verhoeven ("You") and Elsevier ("Elsevier") provided by Copyright Clearance Center ("CCC"). The license consists of your order details, the terms and conditions provided by Elsevier, and the payment terms and conditions. All payments must be made in full to CCC. For payment instructions, please see information listed at the bottom of this form. Supplier Registered Company Number Customer name Elsevier Limited The Boulevard,Langford Lane Kidlington,Oxford,OX5 1GB,UK Bavo Verhoeven Customer address Willem Van Doornyckstraat 59 Haasdonk, other 9120 License number License date Jan 16, 2011 Licensed content publisher Elsevier Licensed content publication Biomaterials Licensed content title Licensed content author Systematic review of the chemical composition of contemporary dental adhesives Kirsten L. Van Landuyt, Johan Snauwaert, Jan De Munck, Marleen Peumans, Yasuhiro Yoshida, André Poitevin, Eduardo Coutinho, Kazuomi Suzuki, Paul Lambrechts, Bart Van Meerbeek Licensed content date September 2007 Licensed content volume number Licensed content issue number Number of pages 29 Start Page 3757 End Page 3785 Type of Use Portion reuse in a thesis/dissertation figures/tables/illustrations

63 Number of figures/tables/illustrations Format Are you the author of this Elsevier article? Will you be translating? 4 both print and electronic No No Order reference number Title of your thesis/dissertation Cytotoxiciteit van dentine adhesieven. Een vergelijkende literatuurstudie van de klinische en histologische effecten van dentine adhesieven in de restauratieve tandheelkunde. Expected completion date Apr 2011 Estimated size (number of pages) 60 Elsevier VAT number GB Permissions price Value added tax 20% Total 0.00 USD 0.0 USD / 0.0 GBP 0.00 USD Title: Author: Biological Risks of Resin-based Materials to the Dentin- Pulp Complex Serge Bouillaguet Publication: Critical Reviews in Oral Biology & Medicine Publisher: Sage Publications Date: 01/01/2004 Copyright 2004, International & American Associations for Dental Research Logged in as: Bavo Verhoeven Account #: Gratis Permission is granted at no cost for sole use in a Master's Thesis and/or Doctoral Dissertation. Additional permission is also granted for the selection to be included in the printing of said scholarly work as part of UMI s "Books on Demand" program. For any further usage or publication, please contact the publisher. Copyright 2011 Copyright Clearance Center, Inc. All Rights Reserved. Privacy statement. Comments? We would like to hear from you. us at customercare@copyright.com

64 Order Completed Title: Author: In vitro cytotoxicity of dental adhesive systems under simulated pulpal pressure. Jean Camps, Corrine Tardieu, Jacques De jou, Jean Claude Franquin, Patrick Ladaique, Regis Rieu Publication: Dental Materials Publisher: Elsevier Date: January 1997 Copyright 1997, Elsevier Logged in as: Bavo Verhoeven Account #: Thank you very much for your order. This is a License Agreement between bavo verhoeven ("You") and Elsevier ("Elsevier"). The license consists of your order details, the terms and conditions provided by Elsevier, and the payment terms and conditions. License Number License date Apr 12, 2011 Licensed content publisher Elsevier Licensed content publication Dental Materials Licensed content title Licensed content author Licensed content date January 1997 Licensed content volume number Licensed content issue number Number of pages 9 Type of Use Portion Number of figures/tables/illustrations Format Are you the author of this Elsevier article? Will you be translating? Order reference number Title of your thesis/dissertation In vitro cytotoxicity of dental adhesive systems under simulated pulpal pressure Jean Camps, Corrine Tardieu, Jacques De jou, Jean Claude Franquin, Patrick Ladaique, Regis Rieu 13 1 reuse in a thesis/dissertation figures/tables/illustrations 2 both print and electronic No No Expected completion date Apr 2011 Estimated size (number of pages) Cytotoxiciteit van dentine adhesieven. Een vergelijkende literatuurstudie van de klinische en histologische effecten van dentine adhesieven in de restauratieve tandheelkunde. 60 Elsevier VAT number GB Permissions price VAT/Local Sales Tax Total 0.00 EUR 0.0 USD / 0.0 GBP 0.00 EUR