1HGHUODQGVH6DPHQYDWWLQJ

Transcriptie

1 1HGHUODQGVH6DPHQYDWWLQJ IOXRURGHR[\XULGLQHGLSDOPLWDDW HHQOLSRILHOHSURGUXJLQLPPXQROLSRVRPHQ

2 1HGHUODQGVHVDPHQYDWWLQJ Darmkanker Kanker van de dikke darm (colorectaal kanker) komt vooral in de westerse wereld veel voor. In Nederland wordt jaarlijks bij 8000 nieuwe patiënten darmkanker vastgesteld, wereldwijd ligt dit aantal boven de Wat aantallen patiënten betreft staat darmkanker bij vrouwen, na borstkanker, op de tweede plaats en bij mannen, na long-enprostaatkanker, op de derde plaats. De eerste behandeling die plaats vindt bij darmkankerpatiënten is operatieve verwijdering van de primaire tumor. Bij vroege diagnose hebben deze patiënten dan een goede prognose. Voor patiënten die uitzaaiingen (metastasen) hebben in de lever of in de longen is de prognose veel slechter. Operatief verwijderen van deze metastasen is alleen mogelijk bij een kleine groep patiënten, die slechts enkele metastasen hebben, die bovendien beperkt moeten zijn tot een klein deel (één lob) van de lever. Bestraling is therapeutisch niet effectief en werkt hooguit verzachtend, daarnaast zijn levermetastasen ongevoelig voor veel cytostatica, met uitzondering van de fluoropyrimidines. Deze worden dan ook gebruikt in de behandeling van levermetastasen van darmkanker. Ondanks de therapeutische activiteit van de fluoropyrimidines blijft het effect over het algemeen beperkt tot een verlenging van de levensduur en een remming van de tumorontwikkeling en leidt behandeling nauwelijks tot genezing. Fluoropyrimidines Tot de fluoropyrimidines behoren onder andere 5-fluorouracil (5-FU) en 5-fluorodeoxyuridine (FUdR). Fluoropyrimidines hebben een sterk groeiremmend effect op snel delende cellen, zoals tumorcellen. Ze remmen de celdeling en de eiwitsynthese van de cel. Fluoropyrimidines lijken sterk op verbindingen (nucleotiden) die normaal voorkomen in DNA (genetisch materiaal) en RNA (codes voor eiwitsynthese) en kunnen daarom in deze structuren worden ingebouwd. De aanwezigheid van het fluoratoom (zie Figuur 1 van Hoofdstuk1) in de fluoropyrimidines veroorzaakt vervolgens de schadelijke effecten, zoals DNA-breuk en remming van eiwitsynthese. Ook zijn fluoropyrimidines sterke remmers van het enzym thymidylaatsynthase wat een cruciale rol speelt in de DNA-synthese. Naast hun werking op tumorcellen veroorzaken deze middelen ook ernstige bijwerkingen, zoals remming van de bloedcelvorming in het beenmerg en schade aan het maag-darm kanaal. Nieuwe therapieën in de behandeling van kanker zijn erop gericht om efficiënter de tumor te doden en daarnaast de schadelijke bijwerkingen te verminderen. Voor de behandeling van levermetastasen van darmkanker wordt bijvoorbeeld gebruikt gemaakt van lokale behandeling van de lever door middel van leverperfusie. Hierbij wordt de lever voor korte tijd losgekoppeld van de normale bloedcirculatie en doorstroomd met vloeistof met daarin het cytostaticum FUdR of 5-FU. Deze ingrijpende behandelmethode voorkomt inderdaad bijwerkingen elders in het lichaam en resulteert in een verhoogde antitumor werking vergeleken met toediening in de bloedbaan. Ook het onderzoek beschreven in dit proefschrift is gericht op het ontwikkelen van een systeem waarmee het cytostaticum FUdR lokaal in de lever, en zelfs direct aan de tumorcellen in de lever, kan worden afgegeven. De gedachte hierbij is om een meer verfijnde manier te ontwikkelen waarmee het cytostaticum lokaal in de lever kan worden afgegeven na toediening via de bloedbaan (systemisch).

3 IOXRURGHR[\XULGLQHGLSDOPLWDDWHHQOLSRILHOHSURGUXJLQLPPXQROLSRVRPHQ Specifieke afgifte en sturing van cytostatica Het sturen van een geneesmiddel naar de plek van de ziekte (drug targeting), bijvoorbeeld naar tumorcellen, vereist de mogelijkheid van een specifieke herkenning van deze plek. Dit kan worden bewerkstelligd door gebruik te maken van antilichamen, eiwitten die normaal gesproken worden opgewekt in het lichaam tegen lichaamsvreemde structuren. Hiervan wordt bijvoorbeeld gebruik gemaakt bij vaccinatie tegen ziekteverwekkers. Antilichamen zijn in staat om heel specifiek en efficiënt bepaalde structuren (eiwitten, suikers, lipiden) te herkennen. Ze bestaan uit twee delen (zie Figuur 2), een variabel deel, Fab (fragment antigen bindend) genaamd, dat zorgt voor de specifieke binding aan de stof waartegen het antilichaam is ontwikkeld, en een constant deel, Fc (fragment constant), dat kan binden aan eiwitten (Fc-receptoren) die voorkomen op verschillende immuuncellen. Door aan de ene kant te binden aan bijvoorbeeld een ziekteverwekker en aan de andere kant aan cellen van het immuunsysteem kunnen antilichamen het immuunsysteem attenderen op de aanwezigheid van een ziekteverwekker en deze onschadelijk maken. Tumorcellen zijn lichaamseigen cellen die zich ongecontroleerd vermenigvuldigen en gedragen. Het is inderdaad mogelijk gebleken om antilichamen te produceren die hetzij specifiek binden aan tumorcellen hetzij in sterk verhoogde mate ten opzichte van normale cellen. Met behulp van antilichamen kan dus een specifieke herkenning van tumorcellen worden bewerkstelligd. Tumorcel specifieke antilichamen worden dan ook gebruikt voor het sturen van bijvoorbeeld cytostatica naar tumorcellen. Dit kan door cytostatica direct te koppelen aan het antilichaam, maar ook door antilichamen te koppelen aan een dragersysteem voor geneesmiddelen (drug carrier systeem). Dit laatste heeft onder andere als voordeel dat per antilichaam meer geneesmiddel kan worden gestuurd. Verschillende dragersystemen zijn ontwikkeld of zijn in ontwikkeling, zoals eiwitten, polymeren en liposomen. In het onderzoek beschreven in dit proefschrift worden liposomen gebruikt als dragersysteem voor cytostatica, hieraan worden antilichamen gekoppeld om specifieke sturing naar tumorcellen te verkrijgen. Liposomen Liposomen zijn blaasjes van (sub)microscopische afmetingen, opgebouwd uit een twee moleculen dikke laag bestaande uit (fosfo)lipiden en cholesterol die een watercompartiment omsluit. (Figuur 1). Liposomen kunnen in allerlei groottes worden bereid, variërend van enkele micrometers tot ongeveer 30 nanometer. Beide componenten van een liposoom kunnen gebruikt worden voor het verpakken van geneesmiddelen. Stoffen die goed wateroplosbaar (hydrofiel) zijn bevinden zich in het watercompartiment, terwijl vetoplosbare (lipofiele) stoffen in de lipide dubbellaag gaan zitten. Insluiting van cytostatica in liposomen heeft een aantal mogelijke voordelen: - Bijwerkingen worden verminderd omdat het cytostaticum niet meer zomaar overal in het lichaam kan komen. - Het cytostaticum wordt beschermd tegen vroegtijdige afbraak in de bloedbaan. - Liposomen kunnen de verdwijning van het geneesmiddel uit de bloedbaan vertragen, waardoor tumoren langer worden blootgesteld aan het cytostaticum. - Antilichamen kunnen aan liposomen worden gekoppeld voor sturing naar tumorcellen.

4 1HGHUODQGVHVDPHQYDWWLQJ lipide dubbellaag waterfase fosfolipid cholesterol PEG wateroplosbaar medicijn lipofiel medicijn Figuur 1. Schematisch overzicht van de structuur van een liposoom. Er bestaan op dit moment reeds enkele liposomale dragersystemen voor cytostatica (doxorubicine, vincristine) die in patiënten worden gebruikt. Bij deze systemen is nog geen sprake van doelgerichte sturing naar de tumorcellen door middel van antilichamen. Deze vorm van therapie is nog in ontwikkeling. Dit proefschrift beschrijft een bijdrage aan dit type onderzoek. Doel van het onderzoek Het onderzoek beschreven in dit proefschrift richt zich op de ontwikkeling van een liposomaal dragersysteem voor het cytostaticum FUdR, om dat vervolgens specifiek te sturen naar levermetastasen van darmkanker. Een dergelijk systeem moet aan de volgende eisen voldoen: - specifieke binding aan de tumorcellen - efficiënte afgifte van het geneesmiddel aan de tumorcellen - stabiliteit in het lichaam - specifieke sturing vanuit de bloedbaan naar de tumor in de lever Al deze aspecten zijn in dit proefschrift beschreven en worden hieronder samengevat weergegeven. Specifieke binding van immunoliposomen aan tumorcellen Immunoliposomen zijn liposomen waaraan antilichamen gekoppeld zijn voor specifieke sturing van een geneesmiddel naar het beoogde celtype, bijvoorbeeld tumorcellen. Het antilichaam kan op verschillende manieren aan een liposoom worden gekoppeld. In onze studies hebben we gebruikt gemaakt van twee manieren, die verschillen in de positie van het

5 IOXRURGHR[\XULGLQHGLSDOPLWDDWHHQOLSRILHOHSURGUXJLQLPPXQROLSRVRPHQ antilichaam op het liposoom. Ten eerste zijn antilichamen direct gekoppeld aan de lipide dubbellaag, type 1 immunoliposomen (zie Figuur 2). Deze koppelingswijze kan worden gecombineerd met de aanwezigheid van het polymeer poly(ethyleen glycol) (PEG) op het liposoom. Dit polymeer zorgt ervoor dat liposomen stabieler zijn en langer circuleren in de bloedbaan. Een tweede manier betreft het koppelen van antlichamen aan het uiteinde van deze polymeerketens resulterend in type 2 immunoliposomen (Figuur 2). Voor de eerste koppelingsmethode wordt het gehele antilichaam chemisch gemodificeerd, door het van extra thiol-groepen te voorzien, waarna het kan reageren met reactieve maleïmide-groepen die op het liposoom zitten. Bij deze manier van koppelen kunnen de antilichamen in verschillende posities (random) gebonden zijn aan het liposoom: via het Fc-deel, maar ook via het Fab-deel. In het laatste geval zal het antilichaam niet meer in staat zijn om de tumorcellen te herkennen. Ook zal in dit geval het Fc-deel van antilichaam geëxposeerd zijn en kunnen binden aan cellen van het immuunsysteem, hetgeen ongewenst is. Mede om deze reden is de tweede koppelingsmethode ontwikkeld. Hierin wordt alleen het Fc-deel van het antilichaam chemisch gemodificeerd door oxidatie, waardoor het kan reageren met reactieve hydrazide-groepen aan het uiteinde van de PEG-ketens op het liposoom. Met deze methode zit het antilichaam dus met zijn Fc-deel gekoppeld aan het liposoom en is het Fab-deel beschikbaar voor binding aan de tumorcel. Type 1 immunoliposomen antilichaam Fc Fab Type 2 immunoliposomen PEG Figuur 2. Twee typen immunoliposomen die verschillen in de positie van het antilichaam op het liposoom. Bij type 1 immunoliposomen is het antilichaam gekoppeld aan de lipide dubbellaag. Bij type 2 immunoliposomen zit het antilichaam aan het uiteinde van de ketens van het polymeer poly(ethyleen glycol) PEG. Tevens is aan de linkerkant een vereenvoudigd model weergegeven van een antilichaam met een variabel deel (Fab) en een constant deel (Fc). Wij hebben in ons onderzoek gebruik gemaakt van darmkankercellen, CC531 (colon carcinoom 531) genaamd, afkomstig uit ratten waarin met chemicaliën darmkanker was opgewekt. Tegen deze cellen is een antilichaam opgewekt, CC52, dat specifiek bindt aan deze cellen. Met dit antilichaam zijn type 1 en type 2 immunoliposomen gemaakt. Deze immunoliposomen werden toegevoegd aan de tumorcellen en de binding van de liposomen aan de cellen werd gemeten (Hoofdstuk 4, Figuur 1). Het koppelen van het CC52 antilichaam aan de liposomen resulteert in een sterke toename van de binding van liposomen aan CC531 cellen. Type 2 immunoliposomen binden beter aan de tumorcellen dan type 1. Dit wordt waarschijnlijk veroorzaakt doordat de antilichamen bij type 2 immunoliposomen zodanig gekoppeld zijn, namelijk via het Fc-deel, dat van alle antilichamen het Fab-deel beschikbaar is voor binding.

6 1HGHUODQGVHVDPHQYDWWLQJ Cytostatica, zoals FUdR, hebben hun effect binnen in de cel en moeten daar dus terechtkomen. Wat er gebeurt met het immunoliposoom na binding aan de cel is dan ook van groot belang voor de wijze en de efficiëntie van afgifte van een cytostaticum aan de cel. Opname van de liposomen door de cel zou een makkelijke manier zijn om het FUdR in de cel te krijgen. We hebben dit bestudeerd, ten eerste met behulp van de elektronenmicroscoop. Om de liposomen zichtbaar te maken zijn kleine gouddeeltjes ingesloten in het watercompartiment. Deze goud-immunoliposomen zijn aan de tumorcellen gevoegd en de lokalisatie van de gouddeeltjes werd bestudeerd met de microscoop. De resultaten staan beschreven in hoofdstuk 3. De liposomen blijken gebonden te zijn en te blijven aan de tumorcel en worden niet opgenomen. Behalve de gouddeeltjes die zichtbaar zijn als zwarte bolletjes zijn de liposomen zelf in de meeste gevallen ook zichtbaar (Hoofdstuk 3, Figuur 3a). De waarneming dat de liposomen vrijwel niet worden opgenomen door de CC531 tumorcellen werd bevestigd in een aantal andere typen experimenten. We toonden aan dat de liposomen gedurende een periode van 2 dagen niet worden afgebroken tijdens incubatie met de cellen (Hoofdstuk 3, Figuur 2). Indien ze zouden worden opgenomen via endocytose zouden ze door lysosomale enzymen geheel of grotendeels moeten worden afgebroken binnen deze tijd. We concludeerden dat de immunoliposomen na binding aan de CC531 tumorcellen niet worden opgenomen door deze cellen maar het celoppervlak blijven zitten. Afgifte van FUdR aan de tumorcellen FUdR is goed oplosbaar in water en kan dus worden ingesloten in het watercompartiment van het liposoom. Gebleken is echter dat het er snel weer uit lekt. Om het FUdR beter met het liposoom geassocieerd te houden is het molecuul veranderd door er twee vetzuurketens (palmitinezuur) aan te koppelen. Het aldus verkregen molecuul FUdR-dipalmitaat (FUdR-dP) is lipofiel geworden en wordt opgenomen in de lipide dubbellaag van de liposomen. Het FUdR-dP is een prodrug, d.w.z. een geneesmiddelvoorloper omdat het als zodanig niet werkzaam is maar eerst moet worden omgezet tot het actieve geneesmiddel, FUdR. De anti-tumor werking van FUdR-dP ingesloten in immunoliposomen is vergeleken met die van FUdR-dP in controle liposomen zonder antilichaam (Hoofdstuk 2). FUdR-dP was meer dan 10 maal zo efficiënt wanneer het was ingesloten in immunoliposomen. De specifieke binding van de immunoliposomen aan de tumorcellen veroorzaakt dus een sterke toename van de afgifte van het FUdR-dP in de cel. De vraag was vervolgens op welke wijze dit tot stand komt. Om het opnamemechanisme op te helderen is het FUdR-dP radioactief gemaakt en in immunoliposomen ingesloten. Hierna is op verschillende tijden bepaald hoeveel van het FUdR-dP aan de cel gebonden zit, verankerd in immunoliposomen, en hoeveel er in de cel aanwezig is. In tegenstelling tot de immunoliposomen zelf bleek het FUdR-dP heel efficiënt de cel binnen te gaan (Hoofdstuk 3). Kennelijk verlaat het dus de immunoliposomen tijdens hun interactie met de cel. Dit effect treedt niet op wanneer liposomen zonder antilichamen worden gebruikt, die dus niet aan de cel binden. Het mogelijke mechanisme waarmee het FUdR de cel binnenkomt wordt weergegeven in Figuur 3. Tijdens of als gevolg van de interactie van de immunoliposomen met de tumorcel gaat (een deel van) het FUdR-dP over

7 IOXRURGHR[\XULGLQHGLSDOPLWDDWHHQOLSRILHOHSURGUXJLQLPPXQROLSRVRPHQ van het liposoommembraan naar de celmembraan. De structuur van het FUdR-dP laat slechts beperkte inpassing in een lipide dubbellaag toe. Het liposomale FUdR-dP zal zich dus graag verdunnen over de membranen van de cellen. Het celmembraan is voortdurend betrokken in endocytotische (opname) activiteit als gevolg waarvan het FUdR-dP met stukjes celmembraan in de cellen terechtkomt, waar het in de lysosomen wordt omgezet (gedeacyleerd) tot de actieve stof FUdR in de lysosomen. Dit FUdR gaat vervolgens voor een deel naar de celkern waar het zijn toxische werking kan uitoefenen. Voor een ander deel wordt het door de cel uitgescheiden om zo, in principe, ook andere tumorcellen, die het FUdR kunnen opnemen, te kunnen doden. FUdR-dP tumorcel 6 4 endosoom lysosoom 5 celkern Figuur 3. Transport van FUdR-dP van immunoliposomen naar tumorcellen. (1) Immunoliposomen binden aan de tumorcellen. (2) Vervolgens vindt er een selectieve transfer plaats van het lipofiele FUdR-dP van de lipide dubbellaag naar de celmembraan. (3) FUdR-dP wordt opgenomen in de cel via endocytose en (4) vervolgens in de lysosomen omgezet tot het actieve cytostaticum FUdR. (5) Dit FUdR gaat voor een deel naar de celkern waar het zijn werking heeft. (6) Een ander deel van het FUdR verlaat de cel en is beschikbaar voor andere tumorcellen. Het transfermechanisme waarmee het FUdR-dP vanuit immunoliposomen de cel binnen komt vertegenwoordigt een efficiënte manier waarop het cytostaticum opgenomen kan worden door de tumorcellen zonder dat het liposoom zelf hoeft te worden opgenomen. Mogelijk is dit mechanisme evenzeer van toepassing op andere vet-oplosbare cytostatica of prodrugs van cytostatica.

8 1HGHUODQGVHVDPHQYDWWLQJ Binding aan andere cellen Wanneer liposomen in het lichaam worden gebracht worden ze herkend als vreemde deeltjes en vervolgens voor een groot deel opgenomen door macrofagen, dat zijn cellen, die onder andere als functie hebben om onbekende deeltjes, zoals bacteriën en dergelijke op te nemen en onschadelijk te maken. De macrofagen die betrokken zijn bij deze opnameprocessen bevinden zich in grote aantallen in de lever en de milt. Levermacrofagen worden ook wel Kupffer cellen genoemd. Het spreekt vanzelf dat deze opname door macrofagen ongewenst is als we liposomen toedienen met daarin een middel dat tegen tumorcellen is gericht. De opname door macrofagen kan sterk worden afgeremd door de aanwezigheid van het polymeer PEG op het oppervlak van de liposomen. Liposomen worden hierdoor onzichtbaar voor de macrofagen, ze worden ook wel stealth-liposomen genoemd. Wanneer echter vervolgens weer antilichamen aan de PEG-liposomen worden gekoppeld is het mogelijk dat de liposomen als gevolg daarvan weer herkend worden door de macrofagen. Dit kan bijvoorbeeld doordat macrofagen het Fc-deel van het antilichaam kunnen herkennen met hun Fc-receptoren. De door ons ontwikkelde immunoliposoomtypen blijken ook te kunnen worden opgenomen door macrofagen. Dit is getest met macrofagen geïsoleerd uit de lever van de rat (Hoofdstuk 4). De opname van de immunoliposomen door deze Kupffer cellen blijkt sterk afhankelijk te zijn van de hoeveelheid antilichaam op het oppervlak van de immunoliposomen. Een hoge antilichaamdichtheid leidt tot een hoge mate van opname van beide typen immunoliposomen door macrofagen. Ondanks dat type 2 immunoliposomen hun Fc-gedeelte niet exposeren worden ze toch efficiënter opgenomen door de Kupffer cellen dan type 1 immunoliposomen. Bij een lage antilichaamdichtheid neemt de opname sterk af en verdwijnt het verschil tussen de beide typen immunoliposomen. Door competitie experimenten waarin geaggregeerd antilichaam is toegevoegd hebben we laten zien dat immunoliposomen worden herkend door Fc-receptoren op de celmembraan van de macrofaag. Type 1 immunoliposomen worden, zoals verwacht, beter herkend door deze receptoren dan type 2 immunoliposomen, die niettemin wel in hogere mate worden opgenomen door macrofagen. Hierbij speelt een ander type receptor een rol, de scavenger receptor, die hoogstwaarschijnlijk het chemisch behandelde (geoxideerde) deel van het antilichaam herkent. Dit werd aannemelijk gemaakt door experimenten waarin remmers van de scavenger receptor zijn gebruikt. De aanwezigheid van PEG en/of antilichamen op het oppervlak van liposomen heeft een grote invloed op de mate van opname door macrofagen. Na opname worden de liposomen in de macrofaag afgebroken. De factoren die zo sterk de opname door macrofagen beïnvloeden blijken geen enkel effect te hebben op de snelheid van de afbraak van de liposomen in de cel (Hoofdstuk 5). Stabiliteit van de immunoliposomen in het lichaam Immunoliposomen zullen uiteindelijk in patiënten moeten worden toegepast en in de bloedbaan worden toegediend. In het bloed moeten de liposomen stabiel zijn, het FUdR-dP vast blijven houden en lang circuleren.

9 IOXRURGHR[\XULGLQHGLSDOPLWDDWHHQOLSRILHOHSURGUXJLQLPPXQROLSRVRPHQ FUdR-dP bleek zeer stevig in beide typen immunoliposomen verankerd te blijven wanneer deze zich in de bloedbaan bevinden. Dit is een belangrijk gegeven, daar het FUdR-dP de liposomen pas moet verlaten wanneer deze in de tumor zijn aangekomen. Om de tumor te bereiken moeten liposomen de bloedbaan verlaten. Bloedvaten in normaal weefsel laten geen liposomen door. Echter, bloedvaten in tumoren zijn nog in ontwikkeling en in het algemeen meer doorlaatbaar. In deze gebieden in de tumor kunnen liposomen dus de bloedbaan verlaten en de tumorcellen bereiken. Omdat de meeste tumoren slecht doorbloed zijn is een lange circulatietijd van de liposomen nodig om geleidelijk aan voldoende liposomen de tumor te laten bereiken. Dit kan worden bereikt door het polymeer PEG te koppelen aan de liposomen. In onze studies hebben we de twee typen immunoliposomen vergeleken voor wat betreft hun gedrag in het lichaam. Deze studies zijn uitgevoerd in gezonde ratten en in een diermodel voor levermetastasen, ratten waarin levermetastasen van darmkanker zijn geïnduceerd. De tijdsduur waarin de helft van de ingespoten dosis de bloedbaan heeft verlaten, de halfwaardetijd, is voor PEG-liposomen ongeveer 18 uur in gezonde ratten (Hoofdstuk 6, Tabel 1). In mensen is dit circa 48 uur. Het koppelen van antlichamen aan het liposoom leidt tot een geringe toename van de verdwijningssnelheid uit de bloedbaan (klaring). Deze bleek toe te nemen bij toenemende antilichaamdichtheid op het liposoom. In ratten met levermetastasen circuleren de liposomen minder lang, namelijk met een halfwaardetijd van ongeveer 16 uur (Hoofdstuk 6, Tabel 2). Tevens is de kinetiek van de verdwijning uit het bloed veranderd. Onmiddellijk na inspuiten wordt een deel van de liposomen zeer snel geklaard, waarna een fase volgt met een langzamere klaring (Hoofdstuk 6, Figuur 2). Deze veranderde kinetiek en snellere klaring kunnen worden verklaard door een sterke toename van het aantal macrofagen in de lever als gevolg van de vorming van de metastasen. Bij toenemende antilichaamdichtheden worden type 2 immunoliposomen in tumor dragende ratten sneller geklaard dan type 1 immunoliposomen. Van de ingespoten liposomen komt maximaal 11 % terecht in de metastasen in de lever. Ophoping van immunoliposomen in de tumor is onder meer aangetoond met immunoliposomen die voorzien zijn van een fluorescerende marker (Hoofdstuk 7, Figuur 4). Ook PEG-liposomen zonder antilichaam komen in de tumor terecht, maar in mindere mate dan immunoliposomen. Anderzijds bleek het niet uit te maken welk type antilichaam aan de liposomen is gekoppeld. Liposomen met een antilichaam, dat niet specifiek is voor de tumorcellen, hopen evenzeer op in de tumor als liposomen met het tumorcel specifieke CC52. Dit suggereert dat de ophoping van de CC52-immunoliposomen niet wordt veroorzaakt door specifieke binding aan de tumorcellen. Met behulp van goud-gemarkeerde immunoliposomen is aangetoond hoe dit komt (Hoofdstuk 7, Figuur 5). Vrijwel alle immunoliposomen die ophopen in het tumorgebied blijken opgenomen te worden door macrofagen die zich daar bevinden en binden vrijwel niet aan de tumorcellen zelf. Hierbij is waarschijnlijk weer sprake van herkenning van het Fc-deel van de antilichamen op het liposoom. Het is waarschijnlijk zelfs zo dat macrofagen in de tumor deze Fc-delen nog beter kunnen binden dan macrofagen elders in het lichaam. Een andere factor die ertoe bijdraagt dat vrijwel geen immunoliposomen associëren met tumorcellen is dat de tumorcellen in heel compacte eenheden groeien die moeilijk toegankelijk zijn voor de liposomen. De macrofagen die zich in de tumor bevinden zijn

10 1HGHUODQGVHVDPHQYDWWLQJ vergeleken daarmee veel beter toegankelijk en kunnen dus heel efficiënt de immunoliposomen opnemen. Ook ondanks deze op het eerste gezicht nadelige omstandigheden zou FUdR-dP in immunoliposomen toch mede actief kunnen zijn tegen de tumoren in de lever aangezien macrofagen in staat zijn om FUdR-dP om te zetten tot FUdR en dit vervolgens weer kunnen uitscheiden, zoals in eerdere studies in onze afdeling is aangetoond. Conclusie en toekomstperspectief De eindconclusie van het werk beschreven in dit proefschrift is dat er een liposomaal systeem is ontwikkeld dat specifiek is voor darmkankercellen en dat op efficiënte wijze het cytostaticum FUdR in de tumorcel kan afgeven. Experimenten met macrofagen hebben laten zien dat door de hoeveelheid antilichaam op het liposoom goed te doseren, de (niet gewenste) opname door macrofagen kan worden verminderd. Liposomen met antilichamen daaraan gekoppeld hopen in hogere mate op in de tumor dan liposomen zonder antilichamen. In de tumor blijken echter de meeste immunoliposomen opgenomen te worden door macrofagen en niet te binden aan de tumorcellen. De ontwikkelde immunoliposomen moeten dus verder worden geoptimaliseerd voor wat betreft hun tumorcel-bindende capaciteiten in het lichaam. Hierbij zal de meeste aandacht gericht moeten zijn op het voorkomen van herkenning en opname van de immunoliposomen door de macrofagen in het hele lichaam en in de tumor in het bijzonder. Hiervoor zou bijvoorbeeld het Fc-deel van het antilichaam kunnen worden afgehaald waarna het Fab-deel wordt gekoppeld aan het liposoom. Tevens is het tegenwoordig mogelijk om nog kleinere delen van het antilichaam te verkrijgen die nog steeds binden aan de tumorcel. Ook zijn voor verschillende celtypen zeer kleine stukjes eiwit (peptiden) ontwikkeld die specifiek kunnen binden aan bepaalde receptoren. Al deze kleinere moleculen die geen Fc-deel meer bevatten kunnen, in principe, aan liposomen worden gekoppeld. Toekomstige studies zullen moeten aantonen of deze nieuwe typen immunoliposomen nog steeds efficiënt kunnen binden aan tumorcellen en inderdaad een geringe opname door macrofagen laten zien. De bevindingen van ons onderzoek bieden ook meer algemene aanknopingspunten voor het vakgebied van de drug targeting en drug delivery. De beschreven selectieve transfer van een lipofiel geneesmiddel van immunoliposomen naar celmembranen zou ook in andere systemen kunnen worden onderzocht en toegepast. Hierbij kan gedacht worden aan andere typen cytostatica en andere tumoren maar ook aan toepassingen buiten het kankeronderzoek, bijvoorbeeld bij drug targeting naar infecties en chronische ontstekingen. Daarnaast zijn de bevindingen betreffende de opname van immunoliposomen door macrofagen van belang voor andere (drug targeting) toepassingen waarin immunoliposomen worden gebruikt. De hier gevonden resultaten geven aan dat wanneer vergelijkbare typen immunoliposomen worden gebruikt, macrofaag opname onvermijdelijk is en dat systemen ontwikkeld moeten worden die nog beter macrofagen kunnen ontwijken. Met name dit laatste moet een belangrijk aandachtspunt zijn in de ontwikkeling van immunoliposomen voor specifieke sturing van geneesmiddelen naar plaatsen in het lichaam waar een ziekteproces gaande is.

11 IOXRURGHR[\XULGLQHGLSDOPLWDDWHHQOLSRILHOHSURGUXJLQLPPXQROLSRVRPHQ

12