UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT DIERGENEESKUNDE. Academiejaar AFRIKAANSE PAARDENPEST. door. Laurien BETS

Transcriptie

1 UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT DIERGENEESKUNDE Academiejaar AFRIKAANSE PAARDENPEST door Laurien BETS Promotor: Dr. van der Meulen Karen Literatuurstudie in het kader van de Masterproef

2 De auteur en de promotor geven de toelating deze studie als geheel voor consultatie beschikbaar te stellen voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting de bron uitdrukkelijk te vermelden bij het aanhalen van gegevens uit deze studie. Het auteursrecht betreffende de gegevens vermeld in deze studie berust bij de promotor. Het auteursrecht beperkt zich tot de wijze waarop de auteur de problematiek van het onderwerp heeft benaderd en neergeschreven. De auteur respecteert daarbij het oorspronkelijke auteursrecht van de individueel geciteerde studies en eventueel bijhorende documentatie, zoals tabellen en figuren. De auteur en de promotor zijn niet verantwoordelijk voor de behandelingen en eventuele doseringen die in deze studie geciteerd en beschreven zijn.

3 WOORD VOORAF Bij het tot stand komen van deze literatuurstudie wil ik graag enkele mensen bedanken. In de eerste plaats ben ik mijn promotor Dr. Karen van der Meulen erg dankbaar voor haar inzet en snelle feedback. Ik kon steeds bij haar terecht voor opbouwend advies en boeiende gesprekken. Verder wil ik mijn vriend Maarten bedanken voor zijn geduld en het aandachtig nalezen van het werk. Ook ben ik mijn collega-studenten Jessie, Lieze en Mariel dankbaar voor hun steun in de drukke periode waarmee het schrijven van een scriptie gepaard gaat. Tenslotte wil ik mijn ouders bedanken voor hun enthousiasme en hun interesse in mijn studie.

4 INHOUDSOPGAVE SAMENVATTING... 1 INLEIDING HET VIRUS Eigenschappen Structuur EPIDEMIOLOGIE Historiek en verspreiding Transmissie Gastheren Vectoren PATHOGENESE Op dierniveau Op celniveau SYMPTOMEN EN LETSELS De peracute of pulmonaire vorm ( dunkop ) De subacute of cardiale vorm ( dikkop ) De gemengde vorm De milde tot subklinische vorm DIAGNOSE Virologische diagnose Serologische diagnose Differentiaaldiagnose BEHANDELING, BESTRIJDING EN PREVENTIE BESPREKING: BELANG VAN HET VIRUS VOOR EUROPA LITERATUURLIJST... 22

5 SAMENVATTING Afrikaanse Paardenpest (APP), ook bekend als African Horse Sickness, Equine Plague of Perdsiekte, is een virale ziekte die voorkomt bij verschillende Equidae. Het Afrikaanse Paardenpestvirus (APPV) behoort tot het genus Orbivirus. De virussen worden overgedragen door vectoren. Voor APPV zijn dit stekende insecten, waarvan Culicoides-soorten de belangrijkste zijn. De geografische verspreiding van de vectoren bepaalt in welke gebieden de ziekte voorkomt. In Afrika is APP endemisch ten zuiden van de Sahara en ten noorden van Zuid-Afrika. Epidemieën doen zich geregeld voor in Zuid-Afrika en sporadisch ook in de regio s noordwaarts van de Sahara tot in Zuid-Europa. Door de opwarming van de aarde worden in onze streken gunstige omstandigheden voor de vectoren gecreëerd, waardoor een kans bestaat dat APP in de toekomst ook in Noord-Europa zal voorkomen. Ook toegenomen internationaal transport en globalisering dragen bij tot deze verspreiding. Binnen de Equidae zijn paarden het gevoeligst voor infectie. De mortaliteit is bij deze diersoort zeer hoog in tegenstelling tot wat men ziet bij de ezel en de zebra. APP kan zich uiten in vier verschillende ziektevormen: de peracute of pulmonaire vorm, de subacute of cardiale vorm, de gemengde vorm en de milde tot subklinische vorm. Bij paarden komen vooral de eerste 3 ziektevormen voor, terwijl ezels en zebra s meestal subklinisch geïnfecteerd zijn en optreden als belangrijke reservoirgastheer. Een vermoedelijke diagnose van APP kan men stellen op basis van de typische symptomen en letsels in combinatie met epidemiologische gegevens. Voor identificatie van het virus zijn verschillende laboratoriumtechnieken beschikbaar. Een efficiënte etiologische behandeling is tot op heden nog niet beschreven. Men kan enkel trachten de ziekte zo snel mogelijk te eradiceren door het nemen van een aantal controlemaatregelen en proberen een epidemie te voorkomen door het vaccineren van paarden in risicogebieden.

6 INLEIDING Afrikaanse Paardenpest (APP) komt al eeuwen voor in Afrika. Sporadisch breidt de ziekte uit naar andere streken. Ruim 20 jaar geleden werd Zuid-Europa getroffen door een epidemie, die na enkele jaren succesvol kon gestopt worden (Rodriguez et al., 1992). Sindsdien is APP niet meer voorgekomen in Europa. In 2006 werd het Noorden van Europa echter plots opgeschrikt door een uitbraak van Blauwtong (BT). Gezien dit virus tot hetzelfde genus behoort als het Afrikaanse Paardenpestvirus (APPV) en op dezelfde wijze wordt overgedragen, is de bezorgdheid aangaande de verspreiding van APPV toegenomen (Wilson en Mellor, 2008). Door de catastrofale gevolgen die een epidemie met zich mee zou brengen, is het nodig op de hoogte te zijn van verschillende aspecten van APP zodat men in de toekomst een epidemie tijdig kan onderkennen en bestrijden. In de laatste jaren is er dan ook veel onderzoek en studie verricht naar de diagnose en de mogelijkheden om de ziekte te behandelen of eradiceren. Ook de factoren die het vóórkomen van het virus kunnen beïnvloeden, zoals vectorverspreiding, klimaatverandering en toegenomen internationaal transport, werden uitgebreid bestudeerd. Het doel van deze scriptie is om de beschikbare literatuur over APP te bundelen. Hierbij worden achtereenvolgens de eigenschappen van het virus, de epidemiologie, de pathogenese en de verschillende ziektevormen, de diagnose en de mogelijkheden van behandeling en bestrijding besproken. Ten slotte wordt in het laatste hoofdstuk een korte, kritische analyse gegeven van de factoren die het voorkomen van APPV in Europa kunnen beïnvloeden. 2

7 1 HET VIRUS 1.1 Eigenschappen Het APPV behoort tot het genus Orbivirus. Andere leden van dit genus zijn het Epizootic haemorrhagic disease virus (EHDV) en het Blauwtongvirus (BTV). Het laatste virus wordt als prototype van het genus beschouwd. De orbivirussen zijn gelijkaardig wat betreft morfologische en biochemische eigenschappen, maar hebben andere pathogenetische eigenschappen en gastheren. APPV infecteert de Equidae, BTV zorgt voor infectie bij het rund en de kleine herkauwers en EHDV veroorzaakt ziekte bij herten (Williams et al., 1998). Het APPV wordt verder ingedeeld bij de familie Reoviridae. Er zijn 9 serotypes van het virus bekend (Roy et al., 1994; Williams et al., 1998). Dieren die geïnfecteerd worden door een bepaald serotype bouwen een immuniteit op tegenover dat serotype, maar zijn nog gevoelig voor infecties met andere serotypes (Mellor, 1994). Het virus is relatief resistent aan warmte en in aanwezigheid van proteïnen neemt de warmtestabiliteit toe. Tot 4 C blijft infectiviteit aanwezig, dus gel yofiliseerde vaccins kunnen bij deze temperatuur bewaard worden. De optimale ph ligt tussen 7 en 8,5, maar het virus kan overleven bij een ph tussen 6 en 12. In een zuur milieu wordt het virus meteen geïnactiveerd. Hier moet men aan denken wanneer stalen worden genomen van een gestorven dier. Door de daling van de ph na de dood van het dier wordt het virus immers snel vernietigd (OIE, 2009). Het virus wordt ondergebracht in de lijst A van het Office International des Epizooties, aangezien het voldoet aan volgende definitie van de Wereldgezondheidsorganisatie (WHO): Overdraagbare ziekten die de potentie hebben voor zeer ernstige en snelle verspreiding, ongeacht nationale grenzen, die grote socio-economische gevolgen of gevolgen voor de volksgezondheid hebben en die van groot belang zijn in de internationale handel in dieren en dierlijke producten. (OIE, 2011). 1.2 Structuur Het APPV bestaat uit een dubbel gelaagd kapsied met 7 structurele proteïnen. Daarnaast heeft het virus ook 4 niet-structurele proteïnen. Het virale genoom bestaat uit 10 dubbelstrengige RNA segmenten. Op Figuur 1 is de algemene structuur van een Orbivirus weergegeven, zoals men die ook bij het APPV terugvindt. Het genoom kan worden ingedeeld in 3 grote segmenten (L1-L3), 3 middelmatige segmenten (M4-M6) en 4 kleine segmenten (S7-S10). Deze segmenten coderen voor de structurele of niet-structurele eiwitten (Roy et al., 1994; Williams et al., 1998). Een overzicht van deze eiwitten en de gensegmenten waardoor ze gecodeerd worden, is weergegeven in Tabel 1. 3

8 Fig. 1 Structuur van een Orbivirus (uit Mertens et al., 2005) Het buitenste kapsied heeft een icosahedrale symmetrie (Williams et al., 1998) en bevat de trimeren VP2 en VP5. Deze proteïnen bevinden zich aan het oppervlak en zijn erg immunogeen. Ze worden gebruikt voor de productie van antisera in konijnen en zijn van belang bij vaccinatie. VP2 is het voornaamste eiwit dat zich aan de oppervlakte van het viruspartikel bevindt. Het wordt gecodeerd door het L2 segment en is serotypespecifiek (Roy et al., 1994). Dit proteïne speelt een rol bij de vasthechting van het virus aan de cel van de gastheer. Het heeft hydrofiele eigenschappen (Williams et al., 1998). Het VP5 proteïne wordt gecodeerd door M6. Het is een hydrofoob eiwit en zou indirect een invloed kunnen hebben op het serotype door interactie met VP2, waardoor de structuur en serologische eigenschappen van dit eiwit veranderen (Williams et al., 1998). Het binnenste kapsied dat het genoom omgeeft, bestaat uit de 2 hoofdproteïnen VP3 en VP7 en uit 3 bijkomende proteïnen VP1, VP4 en VP6. De hoofdproteïnen bevatten beide groepspecifieke antigenische determinanten. VP3 wordt gecodeerd door L3 en is betrokken bij cruciale interacties met andere proteïnen van het binnenste kapsied. Het trimeer VP7 wordt gecodeerd door het S7 segment en vormt pentameren en hexameren met kanalen daartussen. In deze kanalen zit het VP5 verzonken (Roy et al., 1994; Williams et al., 1998). Het genoom van deze hoofdproteïnen moet stabiel zijn omdat ze zorgen voor de structuur van het virus en omdat ze interageren met de bijkomende structurele proteïnen (Williams et al., 1998). Bij het BTV zijn deze bijkomende eiwitten belangrijk voor het transcriptie-replicatieproces. Er wordt vermoed dat dit voor het APPV ook het geval is, hoewel men niet precies de functie kent van het VP6. Dit eiwit is een variant van VP5 dat ook door het segment M6 gecodeerd wordt. Het VP1 zou de functie hebben van een replicase-transcriptase en wordt gecodeerd 4

9 door L1. VP4 heeft een guanylyl transferase activiteit en wordt gecodeerd door het M4 segment (Roy et al., 1994). Voor de structuur en functie van de niet-structurele proteïnen baseert men zich op informatie die bekend is van BTV als prototype van de orbivirussen. Het NS1 eiwit wordt gevormd door het M5 segment. Het is een dimeer dat instaat voor de vorming van tubuli in geïnfecteerde cellen (zie verder bij pathogenese). De hoofdcomponent van de virale inclusielichaampjes in een geïnfecteerde cel wordt gevormd door NS2, een niet-structureel eiwit dat gecodeerd wordt door het S8 segment. Dit NS2 kan RNA binden en zorgt voor het aanbrengen ervan bij het samenstellen van het virus. De eiwitten NS3 en NS3a, die verantwoordelijk zijn voor het vrijkomen van het virus uit de cel, worden gecodeerd door segment S10 (Roy et al., 1994). Tabel 1. Overzicht van de verschillende proteïnen van APPV en de gensegmenten waardoor ze gecodeerd worden. Eiwit Gensegment Locatie Functie VP 1 L 1 Binnenste kapsied Structureel VP 2 L 2 Buitenste kapsied Structureel VP 3 L 3 Binnenste kapsied Structureel VP 4 M 4 Binnenste kapsied Structureel VP 5 M 6 Buitenste kapsied Structureel VP 6 M 6 Binnenste kapsied Structureel VP 7 S 7 Binnenste kapsied Structureel NS 1 M 5 In het viruspartikel Niet structureel NS 2 S 8 In het viruspartikel Niet structureel NS 3 / NS 3a S 10 In het viruspartikel Niet structureel 2 EPIDEMIOLOGIE 2.1 Historiek en verspreiding APP bestaat al sinds eeuwen in Afrika. Het werd voor de eerste keer onderkend in 1569 bij de verkenning van Centraal-Afrika met gevoelige paarden (Alexander et al., 1995; Barnard, 1998). Het is een endemische ziekte in het gebied dat zich uitspreidt ten zuiden van de Sahara: van Senegal in het westen tot Somalië in het oosten en tot het noordelijk deel van Zuid-Afrika (Howell, 1963). In Zuid- Afrika komen iedere 10 tot 15 jaar epidemieën voor die sterk gerelateerd zijn met de warme stroom El Niño. Dit zou te maken hebben met de combinatie van droogte en hevige regenval. In de droge periode troepen de zebra s samen bij de laatste waterbronnen, waar ook de vectoren aanwezig zijn. Door de natte periode die erop volgt neemt de populatie van vectoren toe waardoor meer virustransmissie plaats vindt. Zo komt het tot een epidemie (Bayliss et al., 1999). 5

10 Buiten het endemisch gebied komt de ziekte sporadisch voor. In 1959 was er in Saoudi-Arabië en Iran sprake van Paardenpest Koorts en uitbreiding van de ziekte gebeurde verder noordwaarts, west- en oostwaarts tot in Afghanistan en Pakistan. Het virus verspreidde zich in 1960 via de grote rivieren en handelsroutes tot Irak, Syrië, Jordanië, Libanon, Turkije, Cyprus en India. In 1961 kon de epidemie gestopt worden door vaccinatie en vector controlecampagnes. Ook omwille van ongunstige weersomstandigheden en een kleiner aantal gevoelige gastheren nam de incidentie van de ziekte af. Door de migratie van nomaden met hun ezels naar het noorden, kwam het virus in 1965 voor in Marokko, Algerië en Tunesië. Van hieruit kon APP zich naar Zuid-Europa verspreiden in 1966 (Mellor en Boorman, 1995). Na ruim 20 jaar kwam het virus opnieuw voor in Europa. In 1987 werden subklinisch besmette zebra s ingevoerd vanuit Afrika naar een safaripark in Spanje, waarna een epidemie uitbrak. Door intensieve vaccinatiecampagnes kon eradicatie snel verwezenlijkt worden. Een jaar later werden echter opnieuw gevallen gemeld van APP (Mellor et al., 1990; Rodriguez et al., 1992). De verklaring hiervoor was nog niet duidelijk, maar men vermoedde dat het virus in die tussenperiode niet helemaal verdwenen was. Door het gematigde klimaat konden vectoren er immers het hele jaar leven en het virus kon zich handhaven in de minder gevoelige ezelpopulatie. In de koudere periodes van het jaar waren er minder vectoren en hun levensduur was langer waardoor het aantal transmissies lager was. Daardoor werd de ziekte pas weer opgemerkt bij het toenemen van het aantal vectoren en daarmee eveneens het aantal klinisch zieke dieren (Mellor, 1994). Dit was niet het geval bij de recentere uitbraak van APP in 1989 in Spanje, Portugal en Marokko en in 1990 in Spanje en Marokko (Rodriguez et al., 1992). Toen kon men door middel van vaccinatie en vectorcontrole het virus wel elimineren. Sinds 1992 zijn er geen gevallen van APP meer bekend in de regio rond de Middelandse Zee (Mellor, 1994; Sánchez-Vizcaíno, 2008). 2.2 Transmissie Een overzicht van de transmissiecyclus van APP wordt gegeven door Wilson et al. (2009) (Figuur 2). Fig. 2 De transmissiecyclus van het Afrikaanse Paardenpestvirus (uit Wilson et al. 2009) Bloedzuigende vectoren zorgen voor een biologische transmissie van het virus van gastheer naar gastheer. Vanuit een geïnfecteerde gastheer wordt het virus door een vector opgenomen. Na 6

11 vermeerdering in de darm en migratie naar de speekselklier kan de vector het virus tijdens een bloedmaaltijd inoculeren bij de volgende gastheer. Daarop volgt een viremie in de gastheer waarbij het virus weer kan worden opgenomen door een volgende vector Gastheren De gevoelige gastheren behoren tot de Equidae. In Afrika bestaat deze populatie uit zebra s, ezels, muildieren en paarden. De zebra behoort tot de inheemse fauna en is de reservoirgastheer. De viremische periode duurt bij deze subklinisch geïnfecteerde dieren 27 tot 42 dagen, wat langer is dan bij de andere gastheren. Gedurende deze periode is er kans dat vectoren zich besmetten bij het nemen van een bloedmaaltijd. Een populatie zebra s moet voldoende groot zijn om het virus op lange termijn te kunnen onderhouden. Waar kleinere groepen zebra s voorkomen, zoals in Zuid-Afrika, kent de ziekte een epidemisch verloop in de paardenpopulatie (Barnard, 1998; Mellor, 1994). Bij ezels en muildieren is de ziekte weinig ernstig en de mortaliteit bedraagt ongeveer 50% (Rodriguez et al., 1992). Meiswinkel en Paweska (2003) vermelden zelfs dat er in Afrika nog maar zelden ezels zijn gestorven aan APP. Paarden daarentegen zijn zeer gevoelig en de mortaliteit bij deze diersoort kan oplopen tot boven 90%. Deze diersoort wordt dan ook beschouwd als indicator voor de ziekte (Mellor, 1994). Carnivoren zijn evenzeer gevoelig voor de infectie. Honden kunnen geïnfecteerd worden na het eten van besmet vlees (Mellor, 1994). Alexander et al. (1995) toonden aan dat Afrikaanse carnivoren zoals de leeuw, de hyena en de Afrikaanse wilde hond seroconversie kunnen vertonen tegen APP. Deze diersoorten jagen frequent op zebra s en komen aldus in contact met de organen waar het virus geconcentreerd is. Carnivoren die minder of helemaal niet op zebra s jagen, hadden respectievelijk minder tot geen antistoffen tegen het virus. Dit suggereert dat transmissie naar carnivoren voornamelijk gebeurt via orale opname van geïnfecteerd vlees en minder via bloedzuigende vectoren. Experimenteel werd aangetoond dat de bruine hondenteek (Rhipicephalus sanguineus) het virus ook kan overdragen van honden naar paarden. Er zijn echter nog bijkomende studies nodig om uit te maken of het virus onder natuurlijke omstandigheden via hematofage vectoren kan worden overgedragen naar andere dieren of dat de hond een eindgastheer is zonder verdere overdracht (Alexander et al., 1995) Vectoren De belangrijkste vectoren voor het APPV zijn bijtende muggen van het geslacht Culicoides (Mellor, 1994). Ze zijn in grote aantallen aanwezig in gebieden met een hoge vochtigheid en hun populatie bereikt een hoogtepunt op het einde van de zomer (Rodriguez et al., 1992). Temperatuur is een belangrijke parameter die de mate van transmissie door Culicoides bepaalt. Dit werd duidelijk aangetoond in een experiment van Mellor et al. (1998) waarbij geïnfecteerde muggen bij verschillende temperaturen werden geïncubeerd (Figuur 3 en 4). 7

12 Fig. 3 Culicoides variipennis overlevingsratio bij 10, 15, 20, 25 en 28 C (uit Mellor et al., 1998) Fig. 4 Orale infectieratio van APPV serotype 9 in Culicoides variipennis bij verschillende temperaturen (uit Mellor et al., 1998) Er kon geconcludeerd worden dat transmissie efficiënter verloopt bij temperaturen boven 20 C. Bij 25 C is de overlevingstijd van de muggen wel korter, maar de virusvermeerdering verloopt sneller waardoor de meeste muggen toch infectieus virus kunnen overdragen. Wanneer de temperatuur daalt, zal de virusvermeerdering afnemen, zelfs in die mate dat men bij muggen die 13 dagen verbleven in een omgeving van 10 C geen virus meer kon terugvind en. De muggen waren echter niet helemaal virusvrij, want na verplaatsing naar een warmere omgeving vond opnieuw virusvermeerdering plaats. Door de langere overlevingsduur van de muggen bij lagere temperaturen zou het virus in staat zijn een koude periode te overleven in de afwezigheid van gastheren (Mellor et al., 1998). Wittmann (2000) suggereerde echter dat bij lage temperaturen weinig muggen lang genoeg leven om het virus te kunnen overdragen. Verschillende soorten Culicoides kunnen optreden als vector voor APP. In Afrika zijn Culicoides bolitinos en Culicoides imicola de best gekende en meest voorkomende vectoren. De eerste komt 8

13 voor ten zuiden van de Sahara, vooral in bergachtig gebied met strenge winters en sneeuwval. De larven ontwikkelen zich in de mest van vee, de buffel en de gnoe, waardoor de populatiegrootte afhankelijk is van de hoeveelheid mest die voorhanden is. Culicoides imicola heeft een veel groter verspreidingsgebied. Deze mug komt voor in Afrika, in het zuiden van Europa en in het oosten tot China en Vietnam. De larven ontwikkelen zich in vochtige, organisch verrijkte bodems met gras of zonder vegetatie. In vochtige periodes zijn er meer geschikte broedplaatsen aanwezig waardoor de populatie dan in grootte toeneemt (Meiswinkel en Paweska, 2003). Nog meer naar het noorden, zelfs tot Noord-Europa, komt Culicoides nubeculosus voor. Bij 25 C zijn deze muggen niet heel gevoelig voor de infectie. Als de immature stadia van de mug echter blootgesteld worden aan C, kan virusvermeerdering plaatsvinden en wor den voldoende hoge titers bereikt om transmissie te laten plaatsvinden. Door de toename van de temperatuur vindt de ontwikkeling van de mug versneld plaats waardoor kleine, fragielere muggen ontstaan. Bij deze muggen komt het leaky gut fenomeen voor. Het opgenomen virus lekt als het ware door de darm zonder eerst in de darmcellen te vermeerderen. In het haemocoel vindt de vermeerdering gemakkelijk plaats en van daaruit bereikt het virus de speekselklier. Ook Culicoides obsoletus en Culicoides pulicaris zijn gevoelig voor het lekkende darm fenomeen. Het verspreidingsgebied van deze muggen ligt eveneens noordelijker dan dat van C. imicola. Ze werden voor het eerst geïsoleerd bij de epidemie in Spanje in 1988 (Mellor et al., 1998). In Noord-Amerika is Culicoides variipennis capabel om het virus over te dragen (Mellor et al., 1990; Mellor, 1994). In de verschillende Culicoides-soorten is geen ovariële overdracht beschreven (Mellor, 1994). Er zijn nog andere hematofage insecten die mogelijks een rol kunnen spelen in de virusoverdracht. Gedurende de epidemie van 1988 in Spanje werd het virus teruggevonden in Aedes muggen. Deze muggen hadden echter net een bloedmaaltijd gehad, dus het is niet duidelijk of ze werkelijk geïnfecteerd kunnen worden en in staat zijn om als biologische vector te functioneren. Door het feit dat ze het virus kunnen opnemen, bestaat wel de mogelijkheid dat ze zouden optreden als mechanische vectoren (Mellor et al., 1990). Ook experimenteel geïnfecteerde Anopheles stephensi en Culex pipiens konden het virus overdragen op gevoelige paarden. Uit teken waarbij het bloedmaal al verteerd was, kon het virus geïsoleerd worden (Mellor, 1994). Dit sluit aan bij de bevindingen dat de bruine hondenteek het virus zou kunnen overdragen van honden naar paarden, zoals eerder vermeld. 3 PATHOGENESE 3.1 Op dierniveau APPV wordt overgedragen door stekende insecten en komt aldus in de bloedbaan terecht. De primaire vermeerdering vindt waarschijnlijk plaats in de regionale lymfeklieren en mogelijk ook in de milt en de longen. Hierna volgt een viremie waarbij het APPV verbonden is met erythrocyten. 9

14 Endotheliale cellen en monocyten/macrofagen van voornamelijk de longen, het hart en ook de milt vormen de secundaire vermeerderingsplaats (Burrage en Laegreid, 1994). Er zijn zowel gastheer- als virusfactoren voorop gesteld die het verloop van de infectie kunnen bepalen. Wat de gastheer betreft, speelt vooral de genetische achtergrond een rol. Binnen de eenhoevigen is er een duidelijk verschil in gevoeligheid. Paarden vertonen erge symptomen en sterfte, bij zebra s en ezels is de ziekte mild tot subklinisch. Zelfs binnen de paardenpopulatie zijn er duidelijke verschillen: paarden die in een endemisch gebied leven, hebben resistentie ontwikkeld als gevolg van natuurlijke selectie. Paart men echter een Europese hengst met een dergelijke merrie, dan is de graad van gevoeligheid van de nakomeling veel hoger. De immuniteitsstatus van de gastheer heeft eveneens invloed op het verloop van de ziekte, maar over de precieze rol ervan bestaat nog onzekerheid in de literatuur. De factoren leeftijd, geslacht en conditie bepalen het verloop van de ziekte niet. Voor wat de virusgerelateerde factoren betreft, kan men stellen dat er een diversiteit bestaat in isolaten van APPV. Naargelang het weefseltropisme dat ze vertonen, zou men kunnen spreken van pneumotrope en lymfotrope subpopulaties die aanleiding geven tot verschillende ziektevormen. Hierbij heeft men opgemerkt dat de hoog virulente isolaten typisch de pulmonaire vorm van de ziekte veroorzaken en de avirulente isolaten aanleiding geven tot de subklinische vorm (Burrage en Laegreid, 1994). 3.2 Op celniveau Na interactie tussen de proteïnen van het buitenste kapsied van het virus en de receptoren van de cel dringt het virus de gastheercel binnen. Het virus wordt opgenomen in lysosoom-achtige structuren in het cytoplasma, waar de vermeerdering plaats vindt. Door de virusreplicatie treden verschillende veranderingen op in en rondom geïnfecteerde cellen (Lecatsas en Erasmus, 1967; Roy et al., 1994). Reeds twee uur na de infectie vinden in de endotheliale cellen de eerste veranderingen plaats. Het ruw endoplasmatisch reticulum (RER) zwelt op en in de nucleus zijn veel polymorfe nucleoli zichtbaar. In het cytoplasma worden filamenten en tubuli van verschillende dikte gevormd. Vanaf 4 uur na de infectie worden er dense inclusielichaampjes in de mitochondriën gevonden als gevolg van de reactie van de cel op de virusvermeerdering. Het Golgi-complex zwelt op en is op dit stadium geassocieerd met dense ronde structuren die gevormd worden door immature viruspartikels. Deze bestaan uit enkel lege kapsieden. Het RER valt uiteen in grote vesikels die verspreid voorkomen in de cel. Door de proliferatie van deze twee laatste organellen vergroot de cel in sterke mate, waardoor ze het lumen van de capillairen bijna volledig kan obstrueren. Na 20 uur zijn de eerste mature viruspartikels aanwezig. Deze zijn rond en hebben een diameter van nanometer. Ze komen geïsoleerd voor in het cytoplasma van de cel. Acht uur later zijn ze gegroepeerd en vormen dense massa s van granulair materiaal. De cel ondergaat degeneratieve veranderingen zoals condensatie van de nucleus en het vormen van clusters van ribosomen en begint te vervallen. Een grote hoeveelheid viruspartikels verlaat de cel in een soort envelop, een bedekking verkregen van de cel. Naast endotheliale cellen 10

15 kunnen ook fibroblasten en macrofagen geïnfecteerd worden (Lecatsas en Erasmus, 1967; Carrasco et al., 1999; Gómez-Villamandos et al., 1999). Rondom de endotheliale cellen vinden eveneens veranderingen plaats. De intercellulaire verbindingen verliezen geleidelijk hun structuur waardoor in het ergste geval de cellen loslaten van elkaar. Hierdoor komen celafval, fibrine en zelfs erythrocyten subendotheliaal terecht. Bij verlies van de endotheliale cellen komt de basaalmembraan bloot te liggen wat aanleiding geeft tot aggregatie van thrombocyten en vorming van een fibrine netwerk. De aldus op gang gebrachte stolling zorgt voor het opgebruiken van stollingsfactoren. Het zou aanleiding kunnen geven tot diffuse intravasculaire coagulatie, hoewel dit maar zelden gezien wordt. Het verlies van de structuur van de capillairen zorgt voor een verhoogde vasculaire permeabiliteit en diapedese van erythrocyten uit de bloedvaten. Om de schade aan de bloedvatwand te beperken vormen de nog normale endotheliale cellen cytoplasma-uitlopers die tussen de basaalmembraan en de beschadigde cellen komen te liggen. Deze uitlopers vernauwen echter wel het lumen van de capillairen en kunnen eventueel erythrocyten omvatten (Figuur 5). Het opruimen van Fig. 5 Myocard: Erythrocyt die omgeven wordt door een cytoplasma-uitloper (Staaf = 700 nm) (uit Gómez-Villamandos et al., 1999) celafval en reeds gevormde fibrine gebeurt door monocyten en macrofagen (Lecatsas en Erasmus, 1967; Carrasco et al., 1999; Gómez-Villamandos et al., 1999). Uit een studie van Carrasco et al. (1999) bleek dat de zogenaamde Pulmonaire Intravasculaire Macrofaag (PIM) een belangrijke rol speelt in de pathogenese van APP in de longbloedvaten. PIM s zijn cellen die altijd aanwezig zijn in de longbloedvaten en verbonden zijn met het endotheel. Hoewel de PIM geïnfecteerd kan worden, is het vooral zijn activatie die een rol speelt in het ontstaan van de letsels. De PIM wordt geactiveerd door 3 mechanismen: door contact met de basaalmembraan na blootstelling ervan, door opname van celafval en door inflammatoire mediatoren. Een gestimuleerde PIM is te herkennen aan het toegenomen aantal lysosomen en fagosomen waardoor de cel vergroot is. De cellen bevatten gedegenereerde neutrofielen en thrombocyten en kunnen het lumen van de capillairen vernauwen. Ze produceren zelf ook inflammatoire mediatoren die heel wat veranderingen teweeg brengen. Neutrofielen worden aangetrokken door leukotriëne B4 en door cytokines zoals interleukine-1 en tumor necrosis factor α. Deze cytokines zorgen voor veranderingen ter hoogte van het endotheel zoals verandering van de celvorm en het vergroten van de intercellulaire ruimte. Ze zetten de endotheelcellen aan tot productie van coagulerende stoffen en activeren andere aanwezige macrofagen. Thromboxane A2 wordt eveneens gesecreteerd door geactiveerde PIM s en zorgt voor aggregatie van de thrombocyten. De massaal aangetrokken neutrofielen en geaggregeerde thrombocyten zorgen voor een verdikking van de alveolaire membraan. 11

16 Met behulp van immunoperoxidasereacties combinatie met lichtmicroscopie kon bevestigd worden dat de endotheliale cellen van de capillairen en de monocytenmacrofagen populatie de belangrijkste doelwitcellen zijn. in Virusgeïnfecteerde cellen werden voornamelijk gevonden in het hart (Figuur 6), de longen en de milt, gevolgd door lever, nier, cervicale spieren en gastro-intestinale tractus. In lymfeknopen werden weinig virusgeïnfecteerde cellen teruggevonden ondanks dat dit de primaire vermeerderingsplaats is. Dit is echter te wijten aan het feit dat er al lymfoïde depletie was opgetreden op het moment waarop de stalen genomen werden (Clift en Penrith, 2010). Fig. 6 Hart: Het cytoplasma van een endotheliale cel kleurt positief (IHC) (pijlhoofden). De nucleus is gefragmenteerd (pijl) (Vergroting: 400x) (uit Clift en Penrith, 2010) 4 SYMPTOMEN EN LETSELS Naargelang de optredende symptomen en letsels kan APP ingedeeld worden in 4 vormen, namelijk de pulmonaire vorm, de cardiale vorm, de gemengde vorm en de subklinische of milde vorm. Zelden treedt een ziektevorm op waarbij zenuwsymptomen het klinisch beeld domineren (OIE, 2009). Sommige symptomen of macroscopisch zichtbare letsels komen echter bij meerdere vormen voor, zodat de classificatie niet altijd aangehouden kan worden (Newsholme, 1983). 4.1 De peracute of pulmonaire vorm ( dunkop ) De pulmonaire vorm is gekenmerkt door een kort ziekteverloop en snelle sterfte. Na een incubatieperiode van 4-5 dagen (Newsholme, 1983) ontwikkelen de dieren plotseling hoge koorts tot 42 C en vertonen depressie en anorexie, gevolgd doo r erge respiratoire problemen (Burrage en Laegreid, 1994). Deze worden gekenmerkt door een progressief toenemende dyspnee, abdominale ademhaling, hoestaanvallen en een schuimige uitvloei uit de neus (Figuur 7). De dieren staan met wijd gespreide voorbenen en de nek en het hoofd gestrekt. Met de neusgaten ver opengesperd proberen ze het ademen te vergemakkelijken. Naar het einde van het ziekteproces gaan ze herhaaldelijk sternaal liggen en ze sterven in laterale decubitus ten gevolge van anoxie. Sterfte treedt op binnen de week maar meestal bezwijken ze al enkele minuten tot uren na het verschijnen van de symptomen. (Rodriguez et al., 1992; Kazeem et al., 2008; USAHA, 2008; OIE, 2009). De mortaliteit van deze ziektevorm benadert 100% (Burrage en Laegreid, 1994). 12

17 Fig. 7 Schuimige neusvloei (uit Kazeem et al., 2008) De symptomen zijn het gevolg van diffuus pulmonair oedeem dat veroorzaakt wordt door de schade aan het endotheel (Rodriguez et al., 1992). Soms gaat dit gepaard met pleurale effusie of hydrothorax (Burrage en Laegreid, 1994). Bij autopsie vindt men zware en grote longen. Er is oedeem van het mediastinum en de mediastinale lymfeknopen. Subpleuraal zijn petechiën en ecchymosen zichtbaar. Deze bloedingen komen ook subepicardiaal voor in de coronairgroeven en het linker ventrikel, subendocardiaal en ter hoogte van de serosae van de abdominale organen (Newsholme, 1983; Meiswinkel en Paweska, 2003). Oedeem en stuwing ontstaan als gevolg van verhoogde vaatwandpermeabiliteit en worden niet alleen gezien in de longen maar ook ter hoogte van verschillende mucosae, supra- en periorbitaal (Kazeem et al., 2008), ter hoogte van de larynx en aan de serosale zijde van de dunne darm. In veel gewrichten is er een toename van de hoeveelheid gewrichtsvocht (Newsholme, 1983). 4.2 De subacute of cardiale vorm ( dikkop ) Deze vorm kent een iets milder verloop dan de pulmonaire vorm. De mortaliteit is ook lager en bedraagt 50-70%. De symptomen treden op na een incubatieperiode van 7-14 dagen. Er ontstaat koorts van C en zwelling van het hoofd. Dit i s vooral duidelijk ter hoogte van de fossa supraorbitalis door het oedemateus worden van het onderliggend vetweefsel (Figuur 8), de palpebrale conjunctivae en de intermandibulaire ruimte (Burrage en Laegreid, 1994). Het oedeem breidt zich uit naar de nek en de thorax, maar komt niet voor ventraal van het abdomen of ter hoogte van de benen (USAHA, 2008). De ademhalingsfrequentie neemt progressief toe en de dieren gaan meer abdominaal ademen. Sterfte treedt eventueel op 4-8 dagen na het begin van de klinische symptomen en wordt voorafgegaan door een plotse toename in 13 Fig. 8 Bilateraal oedeem van de fossa supraorbitalis (uit USAHA, 2008) ademhalingsfrequentie met tremoren en zweten (Rodriguez et al., 1992; Burrage en Laegreid, 1994). Naast vochtinfiltratie in de ligamenten en spieren ter hoogte van het hoofd en de nek (Figuur 9) bestaan de typische letsels uit petechiën en ecchymosen van het epi- en endocard en er is hydropericard aanwezig. Hierdoor is de hartslag op auscultatie onhoorbaar en de perifere pols

18 nauwelijks te palperen (Burrage en Laegreid, 1994; Hamblin et al., 1998; Meiswinkel en Paweska, 2003). Bij autopsie zijn er bloedingen te zien in de nier, de miltnierband en het peritoneaal vetweefsel, alsook op de darmen en in de mesenteriale lymfeknopen (Hamblin et al., 1998). Longoedeem is niet aanwezig of is zeer mild en er is geen hydrothorax (USAHA, 2008). 4.3 De gemengde vorm Fig. 9 Oedeem van de intermusculaire fascie in de nek (uit USAHA, 2008) Bij de gemengde vorm van APP komt een combinatie voor van symptomen en letsels die gezien worden bij de 2 voorgaande vormen. Bij de meeste gevallen van APP komt deze ziektevorm voor. De incubatieperiode bedraagt 5-7 dagen (Newholme, 1983). De ziektevorm uit zich meestal door het plots ontstaan van dyspnee en andere respiratoire symptomen nadat er zich een subklinische cardiale vorm heeft voorgedaan. Het kan echter ook andersom: de dieren vertonen ademhalingssymptomen die niet verergeren maar gevolgd worden door oedemateuze zwellingen. Sterfte treedt op als gevolg van hartfalen (USAHA, 2008). De mortaliteit van deze vorm bedraagt 70-80% (OIE, 2009). Bij autopsie vindt men typisch subcutaan oedeem en oedemateuze longen, hydrothorax (Figuur 10) of pleurale effusie en hydropericard (Figuur 11) evenals bloedingen ter hoogte van het hart (Burrage en Laegreid, 1994). Fig. 10 Pulmonair oedeem en hydrothorax (uit USAHA, 2008) Fig. 11 Hydropericard (uit USAHA, 2008) 4.4 De milde tot subklinische vorm Zebra s en ezels vertonen meestal de subklinische ziektevorm. Ook bij immune paarden die geïnfecteerd worden met een homoloog serotype verloopt de ziekte subklinisch. Wanneer ze echter geïnfecteerd worden met een heteroloog serotype, kan de milde of koortsvorm voorkomen. De incubatieperiode varieert van 4 tot 14 dagen. Gedurende 1 à 2 dagen ontstaat koorts met een temperatuur tot 40 C, eventueel depressie en anorex ie. Een lichte dyspnee kan aanwezig zijn, samen met een lichte stijging van de hartfrequentie. Stuwing van de conjunctivae en andere mucosae is mogelijk. Alle dieren genezen spontaan en snel (Rodriguez et al., 1992; Burrage en Laegreid, 1994; USAHA, 2008). 14

19 5 DIAGNOSE Een vermoedelijke diagnose van APP kan gesteld worden op basis van de klinische symptomen en de letsels die gevonden worden bij autopsie (Rodriguez et al., 1992). Sommige symptomen, zoals de supra-orbitale zwelling bij de cardiale ziektevorm, zijn typisch voor APP. Samen met epidemiologische gegevens en een voorgeschiedenis waarbij contact met de vector mogelijk was, kan dit al leiden tot een waarschijnlijkheidsdiagnose. Bij een uitbraak van APP is het echter nodig om snel en met grote zekerheid een juiste diagnose te stellen zodat gepaste maatregelen kunnen genomen worden. Hiervoor is laboratoriumdiagnose essentieel. Ook voor het differentiëren met andere paardenziekten die gelijkaardige symptomen geven, zijn bijkomende onderzoeken aangewezen (Laegreid, 1994; Sánchez-Vizcaíno, 2008). 5.1 Virologische diagnose Bij levende paarden neemt men een bloedstaal wanneer de dieren een koortsperiode doormaken. Tijdens deze periode is er een viremie waarbij het virus geassocieerd is met de erythrocyten. Een anticoagulans zoals heparine moet worden toegevoegd. Bij gestorven dieren moet weefsel verzameld worden van milt, longen, lymfeknopen en, indien mogelijk, van hart en lever. De stalen moeten bewaard worden bij een temperatuur van maximum 4 C (Hamblin et al., 1992; Laegreid, 1994; Sánchez-Vizcaíno, 2008; OIE, 2009). Volgens de United States Animal Health Association worden de weefselstalen zelfs best op ijs bewaard. Virusisolatie kan op verschillende manieren gebeuren. Meestal gebruikt men hiervoor celculturen van zoogdiercellijnen. Twee tot tien dagen na inoculatie van verdachte weefselsuspensies kan men een cytopathogeen effect (CPE) waarnemen. Eventueel moeten er enkele blinde passages gebeuren voor dit duidelijk wordt. Een staal wordt pas als negatief beschouwd nadat er na 3 blinde passages nog geen CPE is opgetreden. Het is eveneens mogelijk om het virus te isoleren in insectencellen, maar in deze cellen treedt dit CPE niet op waardoor het virus alsnog moet overgedragen worden naar zoogdiercellen (Laegreid, 1994; Sánchez-Vizcaíno, 2008). Intraveneuze inoculatie van het virus in geëmbryoneerde kippeneieren en intracerebrale inoculatie bij neonatale muizen behoren ook tot de mogelijkheden (Bremer et al., 1990; Laegreid, 1994). Als laatste mogelijkheid kan men bloed- of miltstalen nemen van gestorven dieren en deze inoculeren bij gevoelige paarden. Deze methode wordt echter niet meer toegepast omwille van de hoge kosten die ermee gepaard gaan en het risico op verspreiden van de ziekte (Rodriguez et al., 1992). Identificeren en bepalen van het serotype van het virus kan men vervolgens doen met de virusneutralisatietest. De uitvoering van deze test neemt 5 dagen in beslag en levend virus is hiervoor vereist. De test was lang de gouden standaard, maar door de nood aan een snellere diagnose wordt hij stilaan vervangen door andere testen (Bremer et al., 1990; USAHA, 2008; OIE, 2009). Verschillende soorten Enzym Linked ImmunoSorbent Assays (ELISA) en Polymerase Chain Reaction testen (PCR) zijn hiervoor ontwikkeld. Deze testen zijn ook veiliger omdat hiervoor geen levend virus vereist is (Stone-Marschat et al., 1994). 15

20 Bij het uitvoeren van een ELISA zijn de resultaten beschikbaar binnen 2 tot 4 uur. Men maakt gebruik van antistoffen tegen de proteïnen van het APPV. Deze antistoffen kunnen polyclonaal zijn of monoclonaal, specifiek gericht tegen het VP7. De ELISA kan virus detecteren in homogenaten van de milt en in supernatant van celculturen met een hoge sensitiviteit en specificiteit (Ranz et al., 1992; Laegreid, 1994; Sánchez-Vizcaíno, 2008; OIE, 2009). In een studie van Hamblin et al. in 1992 werden pony s experimenteel geïnfecteerd met verzwakte virusisolaten van het APPV. Met een ELISA toonden ze de aanwezigheid van het APPV-antigeen aan in milt, long en lever, terwijl geen infectieus virus kon worden teruggevonden. Een ELISA-test biedt dus meerdere voordelen tegenover virusisolatie. Voor gebruik bij bloedstalen is de sensitiviteit lager, waardoor negatieve resultaten best onderworpen worden aan een bijkomende test (Hamblin et al., 1992; Ranz et al., 1992; Laegreid, 1994; Rubio et al., 1998). Het virus kan ook opgespoord worden door detectie van zijn RNA in een PCR. Deze kan uitgevoerd worden met bloed gecollecteerd in Ethyleen Diamine Tetra Acetaat (EDTA), met gehomogeniseerd weefsel van paarden of muizen (na inoculatie in de hersenen) en met celcultuurvloeistof. Er zijn reverse-transcriptase (RT) PCR-testen beschikbaar voor de vermeerdering van bepaalde targetsequenties in de segmenten L3, M5, S8, S9 of S10. Deze segmenten zijn erg geconserveerd binnen de serogroepen van het APPV, maar verschillen met de sequenties van andere orbivirussen. Hierdoor heeft de test een hoge specificiteit en kan het APPV onderscheiden worden van onder andere het Equine Encephalosisvirus (Viljoen en Huismans, 1989). De sensitiviteit van de test is eveneens meermaals bewezen en de resultaten kunnen verkregen worden in minder dan 24 uur (Bremer et al., 1990; Laegreid, 1994; Stone-Marschat et al., 1994; Quan et al., 2010). Recenter werden real-time PCR-testen ontwikkeld. Deze testen hebben een nog hogere sensitiviteit en minder risico op contaminatie. In minder dan 4 uur zijn de resultaten al beschikbaar. Fernández-Pinero et al. (2009) ontwikkelden een primer voor een geconserveerde regio van segment 7 en diezelfde primer werd ook gebruikt voor standaardisatie van een RT-PCR, als alternatief voor laboratioria die niet kunnen beschikken over real-time PCR. In 2010 werd nog een real-time PCR ontwikkeld die zich tegelijk richt op de segmenten 8 en 9 en daardoor de sensitiviteit verhoogt. De test heeft een zeer lage detectielimiet en is daardoor goed bruikbaar op bloedstalen (Quan et al., 2010). De PCR-testen kunnen ook gebruikt worden voor de identificatie van het serotype (Sánchez-Vizcaíno, 2008). 5.2 Serologische diagnose Indien de dieren de acute fase overleven ontwikkelen ze antistoffen na 8 tot 12 dagen. Het detecteren van deze antistoffen is nuttig om de ziekte bij ezels in endemische gebieden op te sporen en voor de regeling van internationale handel en transport van paarden. Virusneutralisatie, immunofluorescentie, immunoblotting, agar gel immunodiffusie, haemagglutinatie inhibitie, complementfixatie en verschillende ELISA s zijn beschikbaar voor de detectie van antistoffen (Laegreid 1994; Sánchez- Vizcaíno, 2008; OIE 2009). De agar gel immunodiffusie werd vaak gebruikt, maar wordt tegenwoordig vervangen door indirecte en competitieve ELISA s die een grotere sensitiviteit en specificiteit hebben. Ook de complementfixatietest raakt in onbruik om deze reden en omdat er in sommige sera anticomplementactiviteit aanwezig is. De test kan wel nog gebruikt worden om een onderscheid te 16

21 maken tussen een recente infectie en een infectie die al enige tijd geleden werd opgelopen. Eén maand na de infectie beginnen complementfixatietiters immers te dalen terwijl neutraliserende antistoffen aanwezig blijven (Hamblin et al., 1990; Laegreid, 1994; Sánchez-Vizcaíno, 2008). Voor bepaling van het serotype waaraan het dier blootgesteld was, kan men gebruik maken van de virusneutralisatietest of hemagglutinatie inhibitie (Laegreid, 1994). Indien mogelijk moeten meerdere testen gebruikt worden voor de definitieve diagnose. Eerst kiest men voor een test waarbij de resultaten snel beschikbaar zijn, waardoor men al kan vaccineren met een polyvalent vaccin. Daarna kan bijvoorbeeld virusisolatie in celculturen volgen en serotypering door virusneutralisatie waardoor monovalente vaccins kunnen gebruikt worden die de immuniteit beter stimuleren omdat er geen interferentie optreedt tussen de verschillende serotypes (Rubio et al., 1998; Sánchez-Vizcaíno, 2008). 5.3 Differentiaaldiagnose Andere ziekten bij paarden die een gelijkaardig klinisch beeld geven zijn equine infectieuze anemie, equine virale arteritis, purpura hemorrhagica, equine encephalosis, babesiose, piroplasmose, trypanosomiase, miltvuur, anthrax en hendra virus (Laegreid, 1994; Sánchez-Vizcaíno, 2008; OIE, 2009). 6 BEHANDELING, BESTRIJDING EN PREVENTIE Er is geen efficiënte etiologische behandeling voor APP. Men kan enkel symptomatisch proberen te behandelen, maar afhankelijk van de ziektevorm blijft de prognose veelal slecht (Guthrie et al., 2009; OIE, 2009). Tal van maatregelen moeten genomen worden om een uitbraak van APP te stoppen en om ervoor te zorgen dat er niet opnieuw uitbraken kunnen ontstaan. Na de epidemie die zich in Spanje heeft voorgedaan in 1987 heeft Portugal een eradicatieprogramma uitgewerkt dat succesvol werd toegepast bij de uitbraak in 1989 en dat kan dienen als model voor andere uitbraken (Portas et al., 1999). Een overzicht van de maatregelen in dit eradicatieprogramma, samen met nog bijkomende maatregelen die men kan nemen, wordt hieronder gegeven. - Quarantaine / verbod op invoer. In regio s waar APP niet voorkomt, vormt de import van dieren die subklinisch besmet zijn een belangrijk risico voor het binnenbrengen van de ziekte. Geïmporteerde dieren vanuit een verdacht gebied moeten daarom een quarantaineperiode ondergaan waarbij ze worden ondergebracht in stallen die vrij zijn van insecten (USAHA, 2008). Dieren die recent al ingevoerd zijn, moeten geïdentificeerd worden en serologisch worden onderzocht. Een verbod op 17

22 invoer vanuit een verdacht of besmet gebied kan men ook doen gelden, zoals men heeft toegepast in Portugal tijdens de uitbraken van APP in Spanje (Portas et al., 1999). - Indeling in zones. Wanneer er in een gebied gevallen van APP voorkomen, wordt dit gebied geklasseerd als geïnfecteerde zone. Het gebied dat deze zone omringt, wordt risicozone. Daarrond komt een veiligheidszone en de rest van het land of gebied wordt waakzaamheidszone. Door deze indeling wordt het makkelijker om bepaalde maatregelen toe te passen in functie van de verschillende zones (Portas et al., 1999). - Communicatie. Het verspreiden van informatie aan dierenartsen, paardeneigenaren en het grote publiek vormt de basis van het succes van een eradicatiecampagne en resulteert in een goede samenwerking tussen de verschillende partijen (Portas et al., 1999). - Opvolging van gezonde paarden. Paarden in de geïnfecteerde zone en de risicozone moeten worden gehuisvest in insect-vrije stallen. Op regelmatige tijdstippen moet de rectale temperatuur gemeten worden zodat koorts vroegtijdig ontdekt wordt. Deze dieren worden ook serologisch opgevolgd. - Verbod op transport. Om verspreiding van de ziekte te voorkomen, worden alle evenementen geschorst en transport van paarden moet gestopt worden (Portas et al., 1999; USAHA, 2008; OIE, 2009). - Vectorcontrole. Om de kans op transmissie door de vector te verlagen, kan men enkele belangrijke maatregelen nemen. Het vernietigen van de broedplaatsen van Culicoides, het aanbrengen van repellents op de paarden en het gebruikt van insecticiden en larviciden rond de stallen zijn hierbij erg belangrijk. - Stamping-out. In de geïnfecteerde zone en de risicozone worden paarden die symptomen vertonen meteen geslacht zonder laboratoriumresultaten af te wachten. Ook bij paarden die blootgesteld zijn maar nog geen symptomen vertonen kan men euthanasie overwegen. De eigenaren worden vergoed voor de verliezen (Portas et al., 1999; OIE, 2009). - Identificatie. Identificatie van het virus en bepaling van het serotype moet zo vroeg mogelijk tijdens een uitbraak gebeuren zodat met kan starten met vaccinatie van alle dieren (OIE, 2009). De beschikbare vaccins en hun efficaciteit worden hieronder verder besproken. Omdat vaccinatie in combinatie met de opkomst van koud weer de epidemie wel kan stoppen maar het virus zelf niet noodzakelijk elimineert, kan men gebruik maken van verklikkerdieren. Deze nietgevaccineerde dieren kunnen verspreid worden in een regio waar zich voorheen een uitbraak van APP heeft voorgedaan. Ze worden vervolgens klinisch en serologisch opgevolgd om het opnieuw aanwezig zijn van het virus tijdig te kunnen detecteren (Portas et al., 1999). Verschillende vaccins werden reeds ontwikkeld maar men is nog steeds op zoek naar het ideale vaccin dat goedkoop is, gemakkelijk kan geproduceerd worden, effectief en veilig is en toelaat gevaccineerde dieren van geïnfecteerde dieren te onderscheiden. Levend geattenueerde vaccins werden voor het eerst ontwikkeld in 1930 en worden nog steeds gebruikt in Afrika. Vroeger werd het virus verzwakt door passage in hersenen van muizen en cavia s, wat soms leidde tot encephalitis bij de gevaccineerde paarden. Recenter worden passages van het 18

23 virus uitgevoerd in celculturen. De vaccins zijn goedkoop, effectief en veroorzaken geen ziekte bij het paard, maar hebben ook enkele belangrijke nadelen. Ze veroorzaken een viremie in de paarden, waardoor vector transmissie mogelijk wordt en export van gevaccineerde paarden verboden is (Laviada et al., 1995). Daarnaast kan er reversie tot virulentie optreden, evenals reassortering van de gensegmenten met wildtype virus. Tenslotte geven ze een variabele immuniteit. Het is onmogelijk om gevaccineerde van geïnfecteerde paarden te onderscheiden. Dit laatste kan men eventueel oplossen door bij vaccinatie een brandmerk te plaatsen op een weinig zichtbare plaats zoals onder de manen (Portas et al., 1999). Vaccinatie met monovalent vaccin stimuleert de immuniteit levenslang tegen het homologe serotype. Bij polyvalente vaccins kan interferentie optreden tussen de serotypes waardoor jaarlijks een herhaling van de vaccinatie nodig is. Het polyvalent vaccin wordt in twee delen toegediend. De eerste component bevat de serotypes 1, 3 en 4; de tweede component, die drie weken later gegeven wordt, bevat de serotypes 2, 6, 7 en 8. Serotype 5 is niet aanwezig omwille van teveel neveneffecten. Ook serotype 9 is niet opgenomen in het vaccin omdat dit serotype maar weinig voorkomt. Door kruisbescherming wordt toch een immuniteit tegen alle negen serotypes bekomen (Burrage en Laegreid, 1994; Roy et al., 1996; House, 1998; MacLachlan et al., 2007; Sánchez- Vizcaíno, 2008; Guthrie et al., 2009; Von Teichman et al., 2010). Geïnactiveerde vaccins werden ontwikkeld om de nadelen van de levende vaccins te omzeilen. Na een enkele dosis beschermen ze de dieren tegen de ziekte, maar niet tegen viremie. Een dubbele dosis geeft volledige bescherming tegen ziekte en viremie. Een jaarlijkse hervaccinatie is nodig. Geïnactiveerde vaccins werden enkel geproduceerd en gebruikt gedurende de uitbraken in Spanje en Portugal (Burrage en Laegreid, 1994; Sánchez-Vizcaíno, 2008; Guthrie et al., 2009). Tegenwoordig wordt meer en meer aandacht besteed aan sub-unit vaccins. Deze zijn gemaakt met recombinante, gezuiverde proteïnen en zijn zeer veilig. Roy et al. (1996) toonden aan dat VP2 op zichzelf bescherming kan opwekken ondanks de lage titers aan neutraliserende antistoffen die gevormd worden na de eerste vaccinatie. De sub-unit vaccins moeten minstens VP2 bevatten aangezien dit eiwit de neutraliserende epitopen draagt. Het kan echter zijn dat door het productieproces een verkeerde opvouwing van VP2 ontstaat, waardoor niet de juiste epitopen gepresenteerd worden. Toevoeging van VP5 aan het vaccin zorgt ervoor dat de correcte conformatie van VP2 behouden blijft. Wanneer VP7 ook nog toegevoegd wordt, vergroot de immunogeniciteit van het vaccin. Bij gebruik van niet-gezuiverde eiwitten in plaats van gezuiverde eiwitten, worden hogere titers van neutraliserende antistoffen bekomen die de paarden volledig beschermen tegen de ziekte en een viremie voorkomen. Ondanks de veiligheid en efficaciteit van deze vaccins zijn ze nog niet commercieel beschikbaar door de hoge productiekost en de moeilijkheden met stabiliteit op lange termijn. Door deze sub-unit vaccins te gebruiken wordt het wel mogelijk om gevaccineerde van geïnfecteerde dieren te onderscheiden (Burrage et al., 1993; Burrage en Laegreid, 1994; Martínez- Torrecuadrada et al., 1996; Roy et al., 1996; Guthrie et al., 2009). Ook DNA-vaccins, waarbij DNA geïntegreerd wordt in een plasmide dat intramusculair of subcutaan geïnjecteerd wordt, krijgen tegenwoordig meer en meer aandacht in de zoektocht naar een ideaal vaccin. Meerdere onderzoeken moeten echter nog uitgevoerd worden vooraleer deze vaccins op punt zullen staan (MacLachlan et al., 2007). 19