Citation for published version (APA): Burzynski, G. M. (2006). Hirschsprung disease - genetics and development. s.n.

Transcriptie

1 University of Groningen Hirschsprung disease - genetics and development Burzynski, Grzegorz Maciej IMPORTANT NOTE: You are advised to consult the publisher's version (publisher's PDF) if you wish to cite from it. Please check the document version below. Document Version Publisher's PDF, also known as Version of record Publication date: 2006 Link to publication in University of Groningen/UMCG research database Citation for published version (APA): Burzynski, G. M. (2006). Hirschsprung disease - genetics and development. s.n. Copyright Other than for strictly personal use, it is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of the author(s) and/or copyright holder(s), unless the work is under an open content license (like Creative Commons). Take-down policy If you believe that this document breaches copyright please contact us providing details, and we will remove access to the work immediately and investigate your claim. Downloaded from the University of Groningen/UMCG research database (Pure): For technical reasons the number of authors shown on this cover page is limited to 10 maximum. Download date:

2 Dit proefschrift beschrijft de rol van genetische factoren in het ontstaan van de ziekte van Hirschsprung (ook wel afgekort als HSCR). HSCR is een aangeboren afwijking gekenmerkt door de afwezigheid van zenuwcellen in de darm (aganglionoses), met name in het laatste (distale) deel van de dikke darm. Door de afwezigheid van zenuwcellen ontbreekt de darmperistaltiek waardoor de darm vernauwt. Dat maakt dat voedsel niet kan passeren en zich ophoopt voor het aganglionaire gedeelte van de darm. Patiënten zijn dan ook gewoonlijk dusdanig ernstig geconstipeerd dat operatief moet worden ingegrepen. Er zijn een aantal genen bekend die, als ze gemuteerd zijn bijdragen aan of de oorzaak zijn van het ontstaan van HSCR. Het belangrijkste gen is RET. Ik heb in dit promotie onderzoek gekeken naar de rol van RET in patiënten bij wie geen mutatie werd gevonden in de coderende sequentie van het gen. (Appendices 1 en 2). Verder is gezocht naar nieuwe (onbekende) genen die bij zouden kunnen dragen aan het ontstaan van HSCR (Appendices 3 en 4). Dit proefschrift begint met een overzicht van de huidige literatuur over HSCR (Hoofdstukken 1-3). Het eerste hoofdstuk van dit overzicht bespreekt de genetische aspecten van de aandoening: het familiair voorkomen, de verschillende fenotypes (definities, classificatie), de epidemiologie (verspreiding, sekseverhouding, variaties in lengte van het aangedane darmsegment) genetische heterogeniteit, het feit dat mutaties in verschillende genen tot een zelfde fenotypisch beeld aanleiding kunnen geven, en het model van overerving. Nadruk wordt gelegd op de meest recente ontwikkelingen, namelijk de vaststelling van het voorkomen van zeer sterke associaties met niet coderende varianten op het RET locus. Varianten die bijdragen aan het fenotype in vrijwel alle patiënten. Hun eigenschappen en bijdrage aan HSCR worden vergeleken met coderende RET mutaties voor de verschillende risicocategorieën in de Nederlandse HSCR 173

3 populatie. Het tweede hoofdstuk van dit overzicht gaat over de ontwikkelingsaspecten van HSCR. Er wordt een korte beschrijving gegeven van de verschillende fasen van de ontwikkeling van het zenuwstelsel van de darm, het enteric nervous system (ENS) alsook van cellen en weefsels die betrokken zijn bij dit proces. Vervolgens worden de belangrijkste signaal transductie routes in het ontwikkelingsproces van het ENS beschreven, te weten de RET en de EDNRB signaal transductie routes, evenals hun wisselwerkingen gedurende de ENS ontwikkeling. Het derde hoofdstuk van het overzicht is een poging om onze kennis van de moleculaire genetica, van de ontwikkelingsaspecten en van de celbiologie met elkaar te verbinden. Appendix 1 laat zien dat in de Nederlandse populatie van HSCR patiënten een gemeenschappelijk ziekte-gerelateerd haplotype voorkomt, wat betekent dat het in deze patiëntengroep om één (dan wel meerdere aan elkaar gekoppelde) veel voorkomende ziekte mutatie gaat. Het haplotype (of wel de mutatie) bleek aanwezig bij 56% van onze patiënten, terwijl dit bij de controlegroep slechts bij 16% bleek te zijn. Bovendien waren bijna alle patiënten homozygoot voor het haplotype (d.w.z. dat op beide chromosomen de mutatie voorkwam) en bleek dat de kans om de ziekte te ontwikkelen sterk afhing van het homozygoot zijn voor het haplotype (OR>20 voor homozygoten, OR>2 voor heterozygoten). Dit suggereert een dosis-afhankelijke werking van de mutatie(s) in dit hapoltype. Het gemeenschappelijk haplotype strekt zich uit over het 5 gebied van de RET locus en is 27 Kb groot (4 Kb 5 UTR en 23 Kb intron 1). Het in Appendix 2 beschreven werk is een vervolg op het onderzoek dat in Appendix 1 is beschreven. Om het met HSCR geassocieerde gebied beter te definiëren en (een) kandidaat ziekte gerelateerde variant(en) te identificeren, is de basen volgorde bepaald van het gemeenschappelijk gedeelde gebied (vanaf 10kb 5 van RET tot en met exon 2, in totaal 33 kb). 174

4 Dit is gedaan in een patiënt homozygoot voor het risico haplotype en in een controle persoon homozygoot oor het niet-risico haplotype. Uit vergelijking van deze sequenties kwamen 84 verschillen. Acht van deze variaties bleken te liggen in gebieden die evolutionair geconserveerd zijn gebleven tussen verschillende gewervelde dieren (chimpansee, rat, muis en kip) en die bindingsplaatsen voor transcriptie factoren bevatten. Wij hebben daarom deze acht beschouwd als kandidaat ziekte-gerelateerde varianten. Haploytypering van deze acht varianten liet zien dat zes van de acht sterke associatie met de ziekte lieten zien. Slechts één van die zes variaties was gelegen in een gebied dat geconserveerd was tot in de kip. Dit maakte deze variant dan ook tot de meest aannemelijke kandidaat. In het onderzoek dat is beschreven in Appendix 3, uitgevoerd in samenwerking met de groep van Prof. Dr. B. Oostra (Rotterdam) hebben we een genoomwijd koppelingsonderzoek uitgevoerd in een familie waarin HSCR zich in meerdere takken van de familie voordoet. We melden de vondst van een veelbelovende koppeling met het gebied 4q31-q32 (LOD 2,7). Het gebied omvat 12.2 Mb en vele genen. Geen van de bekende HSCR genen is in dit gebied gelegen. Daar de ziekte-penetratie in de bestudeerde familie laag is veronderstelden we dat dit gebied nodig zou kunnen zijn, maar niet voldoende is voor het ontwikkelen van het HSCR fenotype. Appendix 4 beschrijft het maken en analyseren van een gen-expressie profiel van gekweekte Neural Crest Stem Cells (NCSCs). Deze NCSCs zijn geïsoleerd uit darmen van muizenembryo s van 11 tot 14 dagen oud. Na kweek in een selectief medium, zijn ze onder verschillende condities verder gekweekt. Eén populatie van NCSCs werd gestimuleerd met de RET ligand GDNF en vervolgens vergeleken met cellen waarin RET niet was geactiveerd. Om genen te identificeren die verschillend tot expressie komen na RET stimulatie, zijn expressiearray analyses uitgevoerd met Agilent whole mouse genome arrays. De gevonden verschillen 175

5 worden beschreven en er worden verklaringen voor gezocht. Met deze benadering kan mogelijk inzicht worden verkregen in de eiwitten die belangrijk zijn voor de ontwikkeling van het ENS, alsook in de etiologie van HSCR 176

6 177

7 178