Intracellular molecular diffusion probed with nonlinear optical microscopy Potma, Eric Olaf

Transcriptie

1 University of Groningen Intracellular molecular diffusion probed with nonlinear optical microscopy Potma, Eric Olaf IMPORTANT NOTE: You are advised to consult the publisher's version (publisher's PDF) if you wish to cite from it. Please check the document version below. Document Version Publisher's PDF, also known as Version of record Publication date: 2001 Link to publication in University of Groningen/UMCG research database Citation for published version (APA): Potma, E. O. (2001). Intracellular molecular diffusion probed with nonlinear optical microscopy Groningen: s.n. Copyright Other than for strictly personal use, it is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of the author(s) and/or copyright holder(s), unless the work is under an open content license (like Creative Commons). Take-down policy If you believe that this document breaches copyright please contact us providing details, and we will remove access to the work immediately and investigate your claim. Downloaded from the University of Groningen/UMCG research database (Pure): For technical reasons the number of authors shown on this cover page is limited to 10 maximum. Download date:

2 Samenvatting De cel bevat alle biochemische ingrediënten die nodig zijn om de kleinste vorm van leven mogelijk te maken. In de cel vinden continu een enorm aantal interacties plaats tussen allerlei soorten moleculen. Voortdurend worden er verbindingen gemaakt en verbroken, worden er nieuwe moleculen gevormd en andere afgebroken. Het is deze complexe distributie van moleculaire interacties die ten grondslag ligt aan de levende natuur. Om te begrijpen hoe een cel werkt is het van belang de moleculen te identificeren die betrokken zijn bij cellulaire processen. Het verband leggen tussen moleculaire structuren en een specifiek proces vertelt echter niet alles over het verloop van een interactie. De dynamica van veel chemische reacties wordt gedeeltelijk of geheel bepaald door de tijd die nodig is om twee reactanten bij elkaar te brengen. Een belangrijke factor voor een dergelijke interactie is dus de snelheid waarmee de moleculen door de intracellulaire ruimte kunnen bewegen. Hoe gemakkelijker de deeltjes zich verplaatsen hoe sneller de reactie zich voltrekt. Zulke processen worden diffusiegelimiteerde reacties genoemd. Om inzicht te krijgen in de dynamica van deze interacties moet dus een goed beeld verkregen worden van de diffusie van de betreffende biochemische componenten. Een groot aantal van de diffusiegelimiteerde reacties vindt plaats in het cytoplasma van de cel. Dit is een waterachtige oplossing met een hoge concentratie eiwitten, suikers, zouten en andere moleculen. In het cytoplasma van niet-bacteriële cellen bevindt zich ook een ingewikkeld netwerk van filamenten die onder andere stevigheid geeft aan de cel: het cytoskelet. Daarnaast bevat de cel een verscheidenheid aan organellen die worden omsloten door een membraan, zoals de kern, de mitochondria en het endoplasmatisch reticulum. Het is duidelijk dat een molecuul dat zich in het cytoplasma van de cel voortbeweegt een andere omgeving ervaart dan hetzelfde deeltje in zuiver water. De moleculaire diffusie in de cel zou daarom heel goed kunnen verschillen van diffusie in zuiver water of in een sterk verdunde waterachtige oplossing. In dit proefschrift wordt de diffusie van twee type moleculen, die essentieel zijn voor de cel, kwantitatief onderzocht. Het eerste molecuul dat wordt bestudeerd is water. Water is het primaire oplosmiddel waarin biochemische reacties plaats hebben. De bewegelijkheid van het water molecuul heeft een verband met de stroperigheid van het waterbad. Diffusie van opgeloste deeltjes wordt in de eerste plaats bepaald door de fysische eigenschappen van het celwater. Karakterisatie van deze eigenschappen geeft dus ook informatie over de intrinsieke bewegelijkheid van andere moleculen in de cel. De tweede type chemische structuur die in dit onderzoek wordt bekeken is het eiwit molecuul. Eiwitten spelen een cruciale rol in vrijwel alle functionele processen in de cel. Er bestaat een rijk scala aan eiwitstructuren die ieder specifieke biochemische mechanismen katalyseren of structureel ondersteunen. De diffusieeigenschappen van deze moleculaire machines hebben dus direct betrekking op de uiteindelijke dynamica van de cel. Omdat de afmetingen van eiwitten vele malen groter zijn dan die van het watermolecuul, spelen andere diffusiemechanismen een rol. Zo mag op basis van het dimensieverschil verwacht worden dat eiwitten meer hinder ondervinden van bijvoorbeeld het cytoskelet. De studies in dit proefschrift pogen een beeld te schetsen 189

3 van zowel het effect van het oplosmiddel als ook de invloed van het cytoskelet op de moleculaire bewegelijkheid in de levende cel. Omdat de architectuur en de chemie van de cel moeilijk gesimuleerd kunnen worden door middel van geprepareerde oplossingen, zal een diffusie meting direct in de cel plaats moeten vinden. Dit brengt enkele complicaties met zich mee. Om diffusie in de cel te kunnen meten is een techniek vereist met een hoge ruimtelijke resolutie, typisch in de orde van een (sub-)micrometer. Bovendien moet de meetmethode niet schadelijk zijn voor de levende cel. Optische microscopie is een van de weinige meettechnieken die aan deze beide eisen voldoet. Het is deze methode die in dit proefschrift gebruikt zal worden om moleculaire diffusie in cellen te onderzoeken. Het registreren van water met behulp van licht is echter niet triviaal. Water is transparant voor zichtbaar licht en dit impliceert dat er geen gebruik gemaakt kan worden van reguliere absorptie en fluorescentie methoden. Een oplossing voor dit probleem wordt geboden door de toepassing van zogenaamde niet-lineaire optische technieken. In reguliere microscopische methoden wordt de interactie van licht en het studieobject gekarakteriseerd door een één-op-één wisselwerking van een lichtdeeltje (foton) en het materiaal. In niet-lineaire technieken daarentegen, wordt de optische interactie gekenmerkt door een wisselwerking van het materiaal met meerdere fotonen tegelijk. Door deze meervoudige interactie kunnen andere eigenschappen van het sample worden gemeten dan doorgaans mogelijk is met de één-foton technieken. Met behulp van de niet-lineaire technologie is het wél mogelijk om enkele eigenschappen van water in een lichtmicroscoop te bekijken. Om deze technologie in een microscoop toe te kunnen passen is een specifieke lichtbron vereist. De lage waarschijnlijkheid van niet-lineaire processen vraagt om hoge licht intensiteiten. Het kwetsbare biologische sample is echter gebaat bij een zo laag mogelijke belichtingssterkte. Door gebruik te maken van gepulst licht kan aan deze voorwaarden worden voldaan. Met gepulst licht is de intensiteit van de puls hoog terwijl het gemiddelde vermogen laag gehouden kan worden. Niet-lineaire processen kunnen zo in een levende cel worden opgewekt. Voor de diffusiestudies beschreven in dit proefschrift is een speciale lichtbron ontworpen die uitstekend geschikt is voor nietlineaire microscopie. Gebruikmakend van optische parametrische lichtgeneratie levert deze lichtbron coherente lichtflitsen met een pulsduur van 30 femtoseconden. Een optische schakelaar maakt het voorts mogelijk de herhaalfrequentie van de lichtpulsen variabel in te stellen. Voor een betrouwbare toepassing van niet-lineaire optische methoden is het belangrijk te weten hoe het signaal in het microscopische focale punt tot stand komt. Naast een grondige karakterisatie van de focusseer eigenschappen van de microscoop objectieven, is het van belang het mechanisme dat ten grondslag ligt aan de signaalopbouw in focus, in kaart te brengen. De niet-lineaire technieken die gebruikt worden in dit proefschrift worden geclassificeerd als coherente methoden. Uit theoretische en experimentele gegevens blijkt dat de coherente methoden andere signaal profielen opleveren dan de gebruikelijke incoherente technieken. In de coherente nietlineaire microscoop is het gemeten signaal een ingewikkeld samenspel van de vorm van het object en het coherente opbouwmechanisme van het signaal veld. Een eenduidige definitie van de ruimtelijke resolutie van het optische systeem, zoals die gegeven kan worden voor de reguliere microscoop, wordt hierdoor bemoeilijkt. Experimenten tonen 190

4 verder aan dat de beste resultaten met de coherente microscoop worden bereikt als deze wordt toegepast op objecten met een geringe dikte en een minimale lichtverstrooiende activiteit. Na het meetsysteem goed te hebben gekarakteriseerd, kan deze worden ingezet om moleculaire diffusie in niet-bacteriële cellen te onderzoeken. In een eerste serie experimenten is de diffusie van celwater bestudeerd op een sub-seconde tijdschaal. De water distributies worden gevisualiseerd door middel van een multi-foton interactie waarbij een vibrationele toestand van het H 2 O (water) molecuul selectief wordt aangesproken (coherent anti-stokes Raman scattering). Met deze instelling van de nietlineaire microscoop is het mogelijk om H 2 O te onderscheiden van het water-isotoop D 2 O (zwaar water) op basis van het verschil in de vibrationele energie toestanden van de structuren. Door nu de cellen in een waterachtige omgeving te spoelen met een zwaar water oplossing, kan het proces van H 2 O/D 2 O uitwisseling in een cel live worden gevolgd. De snelheid van deze uitwisseling is een maat voor de diffusie van het water in de cel. Uit de metingen blijkt dat aan de randen van de cel (Dictyostelium discoideum) de vrije translatie van water ernstig wordt bemoeilijkt, met diffusiesnelheden die meer dan honderd keer langzamer zijn dan in een verdunde oplossing. Wellicht dat een geconcentreerde samenballing van cytoskeletfragmenten in dit gebied een extra barrière opwerpen voor de effectieve verplaatsing van het water. In het overgrote gedeelte van de cel echter lijken de translatie bewegingen van het water vrij snel te zijn, hooguit een paar keer langzamer dan in zuiver water. Om meer inzicht te krijgen in de fysica van het waterbad is tevens onderzoek verricht naar de waterbewegingen op een hele korte tijdschaal. Voor deze metingen is een nieuw soort microscoop gebouwd die de ultrasnelle bewegingen van het water molecuul kan registreren met een femtoseconde tijdsresolutie. Omdat op deze korte tijdschalen de individuele moleculen geen tijd hebben om zich te verplaatsen, is de ontwikkelde techniek (optical Kerr effect microspectroscopy) voornamelijk gevoelig voor rotationele diffusiebewegingen. De metingen geven aan dat de rotationele moleculaire bewegingen van het celwater bijna twee keer zo langzaam zijn als de overeenkomstige dynamica van zuiver water. Dit geeft aan dat, in vergelijking met een zuiver water, het water in het grootste gedeelte van de cel ongeveer twee keer zo stroperig is. Volgens deze resultaten zouden andere opgeloste moleculen in het cytoplasma dus maximaal met een factor twee door het waterbad worden vertraagd. Ook eiwitten zouden deze hinder moeten ondervinden. Uit fluorescentie metingen (fluorescence recovery after photobleaching) aan het fluorescerende test eiwit GFP (green fluorescent protein) komt inderdaad naar voren dat de celvloeistof de bewegingsvrijheid van het eiwitdeeltje met ongeveer een factor twee reduceert. Daarnaast kunnen allerlei intracellulaire structuren de bewegingsvrijheid van het eiwit beperken. De meest prominente barrière wordt gevormd door het actine cytoskelet. In amoebes van D. discoideum zorgen niet-specifieke interacties met het cytoskelet ervoor dat het GFP molecuul bijna twee keer zo langzaam door de cel diffundeert. Het gezamenlijke resultaat van de limiterende mechanismen heeft tot effect dat de totale mobiliteit van het GFP eiwit in de cel met een factor 3.6 is afgenomen ten opzichte van de bewegelijkheid in water. Opmerkelijk is hierbij dat een andere verdeling van de actine filamenten in de cel direct zijn weerslag heeft op de moleculaire diffusie. Zo geeft de opeenstapeling van actine fibers nabij de voor- en achterkant van sterk gepolariseerde 191

5 Dictyostelium cellen aanleiding tot een snellere diffusie van GFP in de overige delen van de cel. In deze overige gebieden is de concentratie actine filamenten minder hoog zodat de translatiebewegingen van het eiwitmolecuul minder worden gehinderd. De feitelijke distributie van de actine filamenten is dus van grote invloed op de eiwittranslatiebewegingen op verschillende posities in de cel. Samengevat, de resultaten die met de nieuwe optische meettechnieken in dit proefschrift zijn verzameld suggereren dat er twee belangrijke mechanismen zijn voor moleculaire diffusie in de levende cel. Ten eerste is er de stroperigheid van de celvloeistof zelf. Deze geeft aanleiding tot een ongeveer twee maal zo lage diffusiesnelheid van deeltjes in het cytoplasma. Daarnaast is er het effect van het cytoskelet. Vooral grotere moleculen zoals eiwitten ondervinden hiervan hinder. Vergeleken met de beweging in water dwingt het cytoskelet een molecuul ter grootte van GFP een bijna twee keer zo langzame diffusiesnelheid aan te nemen. Zowel de celvloeistof als het cytoskelet zorgen ervoor dat diffusiegelimiteerde biochemische reacties in de cel een aantal maal trager verlopen dan dezelfde reacties in een testkolfje gevuld met een verdunde wateroplossing. Voor het modelleren van de reactiedynamica in de biologische cel zal dus met deze factoren rekening gehouden moeten worden. De diffusiewaarden die in dit proefschrift worden gerapporteerd kunnen daarom van pas komen om de dynamische biochemie en biofysica van cellen beter in kaart te brengen. 192