Nederlandse Samenvatting

Transcriptie

1 144

2 Nederlandse Samenvatting 145

3 Plasticiteit is een belangrijke eigenschap van het brein om zijn neuronale verbindingen aan te passen onder de invloed van zintuiglijke ervaringen. Vooral zintuiglijke ervaringen gedurende een sensitieve periode tijdens de ontwikkeling zijn vormend voor de structurele en functionele veranderingen van neuronale verbindingen. Tijdens de sensitieve periode voor binoculaire plasticiteit in de visuele schors zorgt veranderde visuele ervaring door monoculaire deprivatie (MD) voor een verlies van het oplossend vermogen van het gedepriveerde oog. Daarnaast zorgt deze deprivatie van het ene oog in een toegenomen responsiviteit ten opzichte van het andere oog. Deze competitieve verschuiving wordt een oculaire dominantie (OD) verschuiving genoemd. Als deze plasticiteit afneemt richting het einde van de sensitieve periode zal het visuele systeem veel minder de capaciteit hebben om zich te aan te passen en te herstellen van de effecten van MD. Het meest gebruikte model om te onderzoeken hoe deze OD plasticiteit tijdens de sensitieve periode tot stand komt, en welke genen daarbij betrokken zijn, is de visuele schors van de muis. De sensitieve periode voor OD plasticiteit in de muis begint rond de P20 (20 dagen na geboorte), piekt rond P28 en neemt drastisch af na P35. Het gevolg is dat OD plasticiteit minder sterk is in volwassen dieren. Verscheidene farmacologische en therapeutische benaderingen zijn succesvol gebleken in het langer in stand houden of heropenen van de sensitieve periode in volwassen muizen. De afgelopen decennia is er veel werk verzet om de mechanismen te begrijpen die ten grondslag liggen aan OD plasticiteit tijdens de sensitieve periode. Een van de belangrijkste ontdekkingen was dat het tot stand komen van de inhibitoire innervatie van belang is voor het begin van de sensitieve periode voor OD plasticiteit. Er wordt aangenomen dat in het bijzonder de α1 subunit van de GABA A receptor belangrijk is voor de start van de sensitieve periode. In dit proefschrift hebben we aandacht besteed aan de moleculaire mechanismen die aan de basis liggen van plasticiteit in de sensitieve periode. Met behulp van een genetische methode hebben we nieuwe kandidaatgenen voor OD plasticiteit geïdentificeerd We hebben het functionele fenotype van een cohort BXD muizen vastgesteld om een genetische eigenschap te vinden door middel van genetische kennis van elke muislijn. We hebben de functionele data gecorreleerd met een on-line expressie databank en vervolgens de gecorreleerde genen gebruikt in een meta-analyse om op een meer specifieke wijze kandidaatgenen te vinden. Daarnaast hebben we onderzocht wat de rol van de GABA A receptor α1 subunit is in de start van de sensitieve periode. We hebben de vraag gesteld of het belang van deze subunit afhankelijk is van zijn overvloedige expressie in de visuele schors, of omdat het een specifieke functionele eigenschap bezit. Hoofdstuk 2 Het identificeren van belangrijke moleculaire en cellulaire mechanismen in OD plasticiteit heeft voordeel gehad van reeds bestaande muis modellen die deficiënt zijn voor genen die betrokken zijn bij deze plasticiteit. Het ontdekken van deze 146

4 Nederlandse Samenvatting mechanismen volgens de omgekeerde genetische methoden is echter een tijdrovende benadering en heeft tevens het risico dat sommige belangrijke genen niet ontdekt worden. In hoofdstuk 2 hebben we gebruik gemaakt van de genetische en fenotypische verschillen tussen inteelt muislijnen uit een kruising van C57BL/6J en DBA/2J muizen. We hebben de visuele responsen en OD plasticiteit in de visuele schors geanalyseerd door het optisch meten van het intrinsieke signaal. Omdat beide ouder muislijnen zijn gesequenced en van elke BXD muislijn gedetailleerde genetische kennis beschikbaar is waren we in staat om specifieke genetische loci te correleren aan de functionele expressie van visuele eigenschappen, zoals OD, response sterkte en OD plasticiteit. Verdere analyse van de loci kunnen nieuwe kandidaatgenen OD plasticiteit leveren. Een opmerkelijke ontdekking was die van een locus met 13 genen voor het verlies van responsesterkte tijdens OD plasticiteit, in vergelijking met het component voor toegenomen responsesterkte, waarvoor geen locus werd gevonden. We hebben op deze locus één gen geïdentificeerd, genaamd Stch, waarvan de expressie niveaus sterk correleerde met het verlies van responsen van het gedepriveerde oog. Het ligt voor de hand om OD plasticiteit verder te onderzoeken in dieren die gemodificeerd zijn voor Stch maar hier zijn tot op heden geen muis modellen voor beschikbaar. Een andere visuele eigenschap waarvoor we een locus hebben gevonden was niet gepubliceerd in hoofdstuk 2. Deze locus was geassocieerd met de relatieve anatomische positie van de visuele schors ten opzichte van enkele anatomische kenmerken. Het gen op de locus codeert voor het eiwit cadherin-13 (Cdh13). Dit eiwit is betrokken bij morfologische processen en cel-cel contacten. Eveneens is het geïmpliceerd betrokken te zjn bij ADHD gerelateerde plasticiteit mechanismen. Er is reeds begonnen met het terugkruisen van het Cdh13 allel op een DAB/2J genetische achtergrond. In vivo optische metingen moeten verhelderen of Cdh13 inderdaad betrokken is bij de positionering van de visuele schors tijdens de ontwikkeling. Van toegevoegde waarde was de ontdekking dat het verlies van responses voor het gedepriveerde oog en de toegenomen responses van het niet gedepriveerde oog niet één enkele genetische eigenschap zijn. Het verlies van responses van het gedepriveerde oog loopt voor op de toename van de responses. Dit wordt gedeeltelijke uitgelegd in de 3-fase theorie waar de OD verschuiving afhankelijk is van depressie, metaplasticiteit en potentiatie van respectievelijk responseverlies, intermediaire responses en responsetoename. Echter, verschillende pogingen om depressie en potentiatie te verstoren in de visuele schors van de muis hebben slaagden er niet om specifieke componenten van de OD verschuiving te verminderen. Het lijkt er meer op dat OD plasticiteit en depressie en potentiatie bepaalde mechanistische componenten delen. We hebben ook data gepresenteerd over de overerfelijkheid van visuele en plasticiteit gerelateerde eigenschappen. We rapporteerden een sterke overerfelijkheid voor responsesterkte maar konden niet een specifieke locus voor deze eigenschap identificeren. Dit kan afhankelijk zijn van verschillende factoren die de responsesterkte en het intrinsieke signaal beïnvloeden zoals de neuronale 147

5 excitatie, de hemodynamica, de dikte van de schedel en de fototransductie. We vonden wel een sterke overerfelijkheid voor de effecten op OD plasticiteit na MD. De inductie van OD plasticiteit na MD is een model voor het niet aan oogziekte gerelateerde verlies van het visueel oplossend vermogen in de wereldpopulatie. Het opvallende verschil in OD plasticiteit in het cohort van BXD inteeltlijnen die we hebben geanalyseerd heeft bewustzijn gecreëerd over het belang van de genetische achtergrond van transgene muizen die gebruikt worden in experimenten. De genetische achtergrond van twee verschillende muislijnen kan van invloed zijn op het optreden of effectsterkte van een fenotype. Om eerder verschenen publicaties of gerapporteerde fenotypes te kunnen herhalen is het belangrijk dat genetisch gemodificeerde muizen zijn gefokt op dezelfde genetische achtergrond. Het is dan ook eveneens belangrijk om nestgenoten van proefdieren te gebruiken als controle dieren in tegenstelling tot apart gefokte lijnen ter voorkoming van genetische drift. Hoofdstuk 3 Zoals gezegd is er veel onderzoek gedaan naar het vinden van mechanismen die de sensitieve periode reguleren. Muizen die genetisch deficiënt zijn voor genen waarvan bekend zijn dat ze een rol spelen in plasticiteit zijn gebruikt om te testen of deze genen eveneens betrokken zijn bij OD plasticiteit. Een andere benadering om kandidaatgenen voor OD plasticiteit te vinden is om te screenen voor veranderingen in genexpressie tijdens het begin of einde van de sensitieve periode of tijden de inductie van OD plasticiteit. Een 3e mogelijkheid is de voorwaartse genetische methode waarbij een fenotype wordt onderzocht om de genetische achtergrond te vinden zoals bij de BXD inteelt muislijnen hierboven beschreven. In hoofdstuk 2 hebben we een neocortex genexpressie databank gecorreleerd met drie componenten van OD plasticiteit. Voor de validatie van deze benadering hebben we de hypothese gevormd dat van de genen, waarvoor de de genexpressie correleerde met één van de 3 eigenschappen van OD plasticiteit, al eerder bekend was dat ze betrokken waren bij OD plasticiteit. We hebben deze validatie uitgevoerd met een lijst van 14 genen die gevonden zijn door deficiënte muismodellen. Drie van deze 14 genen lieten een correlatie zien van de genexpressie databank met één van de eigenschappen van OD plasticiteit. We konden echter deze genen alleen vinden als de genexpressieniveaus voldoende verschilden tussen de verschillende BXD inteeltlijnen. Anderzijds, geen van de expressieniveaus van genen waarvan bekend is dat ze geen effect hebben op OD plasticiteit correleerde met een eigenschap van OD plasticiteit. We hebben verschillende redenen geopperd waarom niet alle genen zijn gevonden waarvan bekend zijn dat ze een rol spelen bij OD plasticiteit. Eén belangrijke keerzijde aan deze benadering is dat we geen gebruik konden maken van een genexpressie databank van dieren met exact dezelfde leeftijd en specifieke voor de visuele schors. Vaak komen expressieniveaus tussen verschillende leeftijden en corticale gebieden 148

6 Nederlandse Samenvatting overeen, maar dit hoeft niet altijd zo te zijn voor gene die betrokken zijn bij de regulatie van OD plasticiteit of de sensitieve periode. Een andere interessante mogelijkheid dat we niet alle genen hebben kunnen vinden is omdat ze wellicht niet-limiterend zijn. Tussen verschillende BXD inteeltlijnen kunnen de expressieniveaus van deze niet-limiterende genen verschillend zijn, maar geen effect uit oefenen op OD plasticiteit. Terwijl de gehele genetische verwijdering van zo n gen wel tot een fenotype zou leiden. Het identificeren van meer van dit soort verscholen kandidaten vraagt om een andere benadering dan het correleren van expressieniveaus met eigenschappen van OD plasticiteit. Na de validatie van onze methode hebben we een lijst gemaakt van alle genen waarvan de expressie correleerde met een eigenschap in een Correlatie lijst. Dit gaf een uitgebreide lijst van genen die we wilden specificeren met twee extra lijsten. De eerste lijst bestond uit genen die ontologisch in verband werden gebracht met mechanismen die geïmpliceerd zijn in OD plasticiteit (Implicatie lijst). De tweede lijst bestond uit genen uit een mrna micro-array studie waarin genen warden gezocht waarvan de expressie gereguleerd was na MD en ontwikkeling in het donker (Regulatie lijst). Het kruisen van de drie lijsten (Correlatie, Implicatie en Regulatie) resulteerde in een bescheiden lijst van 32 kandidaatgenen voor OD plasticiteit die in alle drie de lijsten voorkwamen. Vijf genen op deze lijst zijn betrokken bij het inhibitoire systeem. Dit is niet geheel verrassend aangezien we al eerder vermelden dat de ontwikkeling van het inhibitoire systeem betrokken is bij het begin van de sensitieve periode. Zes van de 32 genen zijn waarschijnlijke kandidaten die nader moeten worden onderzocht naar hun rol in OD plasticiteit. Alle andere kandidaten zijn nieuw en geven nieuwe startpunten voor meer onderzoek naar hun betrokkenheid in OD plasticiteit in vivo. Hoofdstuk 4 Er is gesuggereerd dat het begin van de sensitieve periode wordt gereguleerd door de activiteit afhankelijke ontwikkeling van parvalbumine positieve (PV+) inhibitoire synapsen. De expressie van PV is niet beperkt tot de synaptische boutons en varieert met de ontwikkeling en met visuele ervaringen. PV zelf is dus geen betrouwbare marker voor inhibitoire synapsen die betrokken zijn bij de start van de sensitieve periode. In hoofdstuk 4 beschrijven we synaptotagmin-2 (Syt2) als een marker voor inhibitoire PV+ boutons. We hebben gerapporteerd dat Syt2 labeling in de jonge en adulte muis rondom de soma lokaliseren in een punctum patroon. Deze puncta waren positief voor zowel de inhibitoire synapse marker VGAT als PV. Syt2 lokaliseerde niet met calbindin, calretinine of somatostatine. In de visuele schors komt Syt2 dus specifiek tot expressie in PV+ boutons. We vonden eveneens dat Syt2 al duidelijk zichtbaar is op P12 and hoge expressie heeft op P18, ruim voor het begin van PV expressie. Van PV is ook bekend dat het afneemt nadat dieren in het donker opgroeien. Een vergelijkbare reductie zagen we niet voor Syt2. Mogelijk resulteert het opgroeien in het donker in een afname van PV en niet zozeer in een structurele aanpassing. 149

7 Hoofdstuk 5 Zoals we hebben gezien is inhibitoire innervatie één van de belangrijkste regulaire mechanisme van de start van de sensitieve periode voor OD plasticiteit. Het is gesuggereerd dat specifiek synapsen die de α1 subunit bevattende GABA A receptors hebben betrokken zijn bij deze rol voor inhibitie. Deze receptoren kunnen farmacologisch geactiveerd worden met door middel van benzodiazepines. Behandeling met benzodiazepines kan een vroegtijdige sensitieve periode starten. Deze vroege start blijkt afhankelijk van α1 subunit aangezien mutaties in de benzodiazepine site van de α1 subunit geen vroegtijdige sensitieve periode laten zien. Dit effect niet aanwezig bij een vergelijkbare mutatie bij α2 en α3 subunits. GABA A R receptors met α1 zijn voornamelijk gelocaliseerd in synapses die worden gevormd door PV+ synapsen. Wij wilden graag onderzoeken of de GABA A R α1 subunit specifieke eigenschappen bevat die het belangrijk maken in deze rol, of dat gebaseerd is op zijn relatieve overvloedige expressie in de visuele schors, in vergelijking met andere subunits. In hoofdstuk 5 laten we zien dat de GABA A R α1 subunit niet belangrijk is voor de vorming van PV+ innervatie. In de absentie van GABA A R α1, in GABA A R α1 deficiënte muizen, is er een toegenomen expressie van de GABA A R α3 subunit. Ook is de ontwikkeling van het visueel oplossende vermogen, wat wordt gedacht parallel te lopen met de sensitieve periode, onaangedaan in deze dieren, evenals de start van de sensitieve periode zelf. Echter het effect van OD plasticiteit na 7 dagen van MD is licht verminderd in GABA A R α1 deficiënte muizen. Een mogelijke oorzaak van deze verminderde verschuiving kan zijn dat GABA A R α1 receptoren andere kinetische eigenschappen hebben dan andere GABA A R receptoren. De zogenaamde IPSCs in GABA A R α1 deficiënte muizen duren langer dan in normale dieren. Dit zou een effect kunnen hebben op de timing van activiteit van excitatoire neuronen. Wanneer we echter GABA A R α1 selectief verwijderden in excitatoire neuronen ontstond er geen verschil in OD plasticiteit vergeleken met normale muizen. Dit suggereerde dat de GABA A R α1 subunit belangrijk is in een andere synapse dan die van PV+ inhibitoire neuronen op excitatoire neuronen. Mogelijke rol in OD plasticiteit voor GABA A R α1 in andere interneuronen Hierboven concludeerden we dat GABA A R α1 wellicht een rol speelt in een andere type inhibtoire interneuronen. In de hippocampus komt de GABA A R α1 subunit sterk tot expressie in verschillende GABAerge interneuronen die inhibitie krijgen van PV+ neuronen. De meest voor de hand liggende kandidaat is het PV interneuron zelf. In deze cellen is de GABA A R α1 subunit betrokken bij reciproque inhibitie van PV+ cel tot PV+ cel. Wanneer echter probeerden om GABA A R α1 subunit selectief te verwijderen uit PV+ neuronen ondervonden we dat dit niet mogelijk is op de leeftijd dat we de sensitieve periode onderzoeken (Hoofdstuk 6, Figuur 1). 150

8 Nederlandse Samenvatting In de toekomst zou het eventueel een uitkomst bieden om de selectieve deficiëntie voor GABA A R α1 te bewerkstelligen met behulp van muizen waarbij selectieve recombinatie plaats heeft onder invloed van Syt2, dat eveneens specifiek is voor PV+ neuronen, maar vroeger in de ontwikkeling tot expressie komt. Een andere mogelijkheid is om GABA A R α1 selectief in alle typen inhibitoire interneuronen te verwijderen. Experimenten met deze muizen zullen op termijn beginnen. Een complete analyse van de expressie van de GABA A R α1 subunit in de subtypen interneuronen in de visuele schors is daarvoor wenselijk. Een mogelijke rol voor GABA A R α1 in de visuele thalamus In intrigerend alternatief wat we in hoofdstuk 5 voorstelde is dat de rol van de GABA A R α1 subunit in OD plasticiteit plaats heeft in de thalamus. GABA A R α1 komt tot expressie in thalamocorticale projectie neuronen in de visuele thalamus. De innerverende werking van dit type neuronen vindt plaats in laag 4 van de visuele schors. Eventueel kan een deficiëntie van de GABA A R α1 subunit in deze cellen eveneens een veranderde IPSC veroorzaken. De output van thalamocorticale cellen kan hierdoor dermate veranderen dat het een effect kan hebben op OD plasticiteit in de visuele schors. Conclusie Het werk in dit proefschrift draagt bij tot een beter begrip van functionele plasticiteit en de moleculaire mechanismen van dit soort plasticiteit. Uiteindelijk zal deze kennis te gebruiken zijn in therapieën voor bijvoorbeeld amblyopie en andere plasticiteit gerelateerde neurologische aandoeningen. Toekomstige onderzoeken zullen een rol zoeken in de regulatie van de sensitieve periode en OD plasticiteit voor de genen en mechanismen die we beschreven hebben. Het zal interessant zijn te bekijken of Cdh13 of Stch betrokken zijn bij specifieke visuele eigenschappen. Het is een kwestie van tijd voordat de in vivo experimenten in de interneuron specifieke en thalamocorticale specifieke GABA A R α1 deficiënte muizen van start kunnen gaan. Hopelijk zullen deze meer inzicht en conclusies leveren over de rol van de GABA A R α1 in de regulatie van de sensitieve periode en OD plasticiteit. De farmacologische benadering met Indiplon die we in hoofdstuk 5 beschrijven zal ons verder helpen om te kijken welke synaps betrokken is bij de aanzet tot een vroegtijdige sensitieve periode. Deze resultaten zullen ook nieuwe inzichten geven in de risico s die er zijn bij farmacologische behandelingen bij jonge kinderen. In de toekomst zal het waardevol zijn om de bepalen waarom er verschillen zijn tussen muizen en hogere zoogdieren, zoals de mens, wat betreft het verschil tussen plasticiteit in de sensitieve periode en in adulte individuen. Therapeutische behandelingen kunnen duidelijk niet van soort tot soort vertaald worden. Dit zal zo 151

9 blijven totdat we een volledig beeld hebben kunnen vormen van de onderliggende mechanismen die we activeren of moduleren met zulke behandelingen. Het is uiteindelijk uiterst belangrijk vast te stellen dat nieuwe therapeutische strategieën niet de reeds vastgestelde neuronale verbindingen verstoren die niet betrokken zijn bij de primaire aandoening. 152

10 Nederlandse Samenvatting 153

11 Publications Sommeijer JP, Heimel JA, Hermans JM, Neuro-Bsik Mouse Phenomics consortium, Levelt CN. The Role of the GABA A R α1 Subunit in Ocular Dominance Plasticity Manuscript in preparation Van Versendaal D, Rajendran R, Saiepour MH, Klooster J, Smit-Rigter L, Sommeijer JP, De Zeeuw CI, Hofer SB, Heimel JA, Levelt CN. Elimination of inhibitory synapses is a major component of adult ocular dominance plasticity. Neuron Apr 26;74(2): Sommeijer JP, Levelt CN. Synaptotagmin-2 is a reliable marker for parvalbumin positive inhibitory boutons in the mouse visual cortex. PLoS One. 2012;7(4):e Rietman ML, Sommeijer JP; Neuro-Bsik Mouse Phenomics Consortium, Levelt CN, Heimel JA. Candidate genes in ocular dominance plasticity. Front Neurosci. 2012;6:11. Genetic control of experience-dependent plasticity in the visual cortex. Heimel JA, Hermans JM, Sommeijer JP; Neuro-Bsik Mouse Phenomics consortium, Levelt CN. Genes Brain Behav Nov;7(8):

12 155

13 Curriculum Vitae Jean-Pierre Sommeijer was born on the 27th of November 1981 in Eindhoven. In 1993 he attended the Were Di College (formerly known as Hertog Jan College) in Valkenswaard, where he graduated in In the same year he started the study Biomedical Sciences at Utrecht University. After finishing the first 3 years of his bachelor he continued in the Prestige labeled Master Neuroscience and Cognition at Utrecht University in the Clinical and Experimental Neuroscience program. In 2004 he enrolled in an internship at the Rudolf Magnus Institute for Neurosciences at the Utrecht University Medical Centre under the supervision of Dr. Saskia van der Hel in the group of Dr. Pierre de Graan. There he developed skills in immunohistochemistry and neuroscience while working on the enzyme glutamine synthetase in the hippocampus of the epileptic brain. He developed a strong interest in the fundamental aspects of brain development up to the cellular and molecular level. This interest was underlined by an internship in 2005 at Yale University in New Haven, Connecticut USA, in the lab of Prof. Elke Stein at the Department of Molecular, Cellular and Developmental Biology. There he worked on the functional characterization of DSCAM-L1, a protein involved in axon guidance and pathfinding. In 2006 he graduated with a master s thesis named, Specifying the Synapse on synaptic tagging, supervised by Dr. Ronald van Kesteren at the Free University in Amsterdam. In the summer of 2006 he started a PhD candidacy in the group of Dr. Christiaan Levelt at the Netherlands Institute for Neurosciences working on Molecular Visual Plasticity. In 2013 this resulted in the work described in this thesis: Mechanisms of Ocular Dominance Plasticity in the Mouse Visual Cortex 156