door W. F. Keijzer 15 riiksdienst voor de iisselmeeruolders

Transcriptie

1 De spectrofotometrische bepa ling van fosfaat in citroenzuur 0 extracten van grond volgens de molybdeenblaauwkleuring met verschillende reductiemiddelen door W. F. Keijzer 15 riiksdienst voor de iisselmeeruolders

2 BIBLIOTHEEK RlJKSDlENST VOOR OE USSECMEEHPOLDERS I RIJKSDIENST VOOR DE IJSSELMEERPOLDERS L E L Y S T A D Smedinghuis R.1J.P.rapport Bbw De spectrofotometrische bepaling van fosfaat in citroenzuurextracten van grond volgens de molybdeenblaauwkleuring met verschillende reductiemiddelen door W.F. Keijzer

3 Inleiding Fosfaat is een belangrijke voedingsstof voor de plant... Om een iqdruk te hebben van de hoeveelheid fosfaat die voor de plant 6eschikbaar is, wordt aan de Subafdeling Laboratoria van de R.1J.P. de grond geextraheerd met 0.a. citroenzuur 1%. In de extracten wordt het fosfaat spectrofotometrisch bepaald. Zijn naast deze gegevens bo vendien proefveldresultaten op vergelijkbare grond beschikbaar, dan kan een vrij betrouwbaar beeld van de fosfaattoestand worden verkregen. Bij de spectrofotometrische bepaling van fosfaat volgens de molybdeen. ~ blauwkleuring wordt van drie reductiemiddelen (amidol, met01 en ascor binezuur) gebruik gemaakt (Hofstee en Fien, 1971). Momenteel worden voor de bepaling van fosfaat in citroenzuurextracten van grond amidol en met01 gebruikt. De.activiteit van ~, amidol is minder groot dan die van...., metol. De intensiteit van de met fosfaat gevormde blauwgekleurde ver binding is in beide gevallen afhankelijk van de tijd gedurende welke de vloeistof in contact is met de reagentia. Bovendien is de tempera 0 tuur als meetconditie aan nanwe grenzen gebonden (20 C + of 1'~). In tegenstelling met met01 werkt bij gebruik van amidol citroenzuur niet storend. Het kan worden gebruikt voor een directe kleuring van citroenzuurextracten, mits de extracten niet te sterk door uit de grond opgeloste organisch@'stoffen zijn gekleurd. Is dit we1 het geval, dan moeten deze stoffen eerst met H SO en KMN04 worden geoxydeerd. Hier 2 4 bij wordt tevens het citroenzuur geoxydeerd, zodat daarna we1 met01 kan worden gebruikt. Bij met01 beinvloeden ijzer111ionen de intensiteit van de blauwkleu ring en kunnen, in grote hoeveelheden aanwezig, oorzaak zijn van blauw groene, geelgroene of geelbruine verkleuringen. Deze storing kan worden opgeheven door reductie tot ijzer11ionen. Ten o~zichte van amidol en metol is de molybdeenblauwkleuring met as corbinezuur als reductiemiddel een veel gevoeliger methode (John, 1968). De kleur is na 30 min. o~tirnaal en blijft daarna gedurende 24 uur con 0 stant. Temperatuurschommelingen tussen 10 en ~OOC beinvloeden de kleur

4 ontwikkeling niet. Door de grotere gevoeligheid kan een kleine hoeveelheid extract in gebruik worden genomen. Het voordeel hiervan is, dat in de meetoplossing minder storende componenten aanwezig zijn. De kans dat de kleuring wordt behvloed door b.v. ijzer111ionen, is dan gering. Om tot een uniforme werkwijze te komen en om kleine hoeveelheden fosfaat nauwkeuriger te kunnen bepalen is, als vervolg op eerder verricht onderzoek betreffende de fosfaatbepaling (Hofstee, 1951; Keijzer, 1975), nagegaan of ook voor de bepaling van fosfaat in citroenzuurextracten de gevoelige molybdeenblauwkleuring met reductie door ascorbinezuur kan worden toegepast. Werkwij ze De bepalingen zijn verricht volgens Hofstee en Fien, Deze voor schriften zijn als bijlagen I en I1 aan dit verslag toegevoegd. De ge volgde werkwijzen luiden in het kort: Bereiden van het citroenzuurextract. 5 g luchtdroge grond gedurende 48 uur extraheren met 50 ml citroenzuur 1%. (Voor het in de grond aanwezige CaCO een equivalente hoeveelheid 3 citroenzuur toevoegen). Filtreren. In het filtraat fosfaat bepalen vol gens de molybdeenblauwkleuring met als reductiemiddelen amidol, met01 en ascorbinezuur. Amidol 5 ml filtraat pipetteren in maatkolf 100 ml. Toevoegen 50 m1.h 0 ged. 2 I0 ml ammoniummolybdaat (oplossir~~ I) en daarna 10 ml amidol (oplossing 11). Aanvullen tot 100 ml. EGn uur na het toevoegen van oplossing I1 meten bij 720 nm. Metol 10 ml filtraat pipetteren in bekerglas. Oxyderen met H SO ~ N O ~. 2 4 Overbrengen in maatkolf I00 ml. Toevoegen 10 ml met01 (oplossing I), daarna 10 ml amoniumolybdaat (oplossing 11) en na 15 minuten 20 ml natriumacetaat (oplossing 111). Aanvullen tot 100 ml. Na 30 minuten staan meten bij 720 nm. Ascorbinezuu~ 1 mlfiltraat pipetteren in maatkolf 100 ml. Toevoegen 20 ml ascorbine zuurmengsel. Aanvullen tot 100 ml. Na minstens 30 minuten staan meten bij 882 nm.

5 Uitvoering en resultaten DPspectrofotometrie is gebeerd op de wet van LambertBeer: T = transmissie I = intensiteit van het opvallende licht 0 I = intensiteit.van het doorgelaten licht t a = extinctiecoeff icient b = optischeweglengte van de cuvet c = concentratie van de ~ absorberende... stof. Het tegengestelde, exponentizle verband tussen de transmissie en de concentratie is voor de kwantitatieve analyse ongemakkelijk. Daarom is de grootheid extinctie (E) ingevoerd: E = log T = abc. Uit deze be trekking kan worden afgeleid dat de relatieve fout in de concentratie in het extinctiebereik tussen 0,100 en 1,'500 weinig verandert, maar sterk toeneemt bij hogere en lagere extincties (De Galan, 1972). Bij voorkeur moet dus in dit optimale gebied worden gewerkt waar de nauw keurigheid van de spectrofotometrische absorptiebepaling ongeveer 1%.. is..., Vodr kleuringsmethoden kunnen ijklijnen worden opgesteld met behulp van een reeks standaarden, waarna de onbekende gehalten aan de hand van deze ijklijnen worden bepaald. Aangezien het bereiden van een stan daardreeks tijdrovend is, wordt slechts gemeten in het gebied waar het verband tussen concentratie en extinctie lineair is, d.w.z. het gebied dat voldoet aan de wet van LambertBeer. Voor de Bausch en Lomb Spec tronic 70 spectrofotometer, die bij dit onderzoek is gebruikt, eindigt dit meetgebied voor het molybdeenblauw (720 nm) met amidol als reduc tiemiddel bij E = 0,250, met met01 bij E = 0,270 en met ascorbinezuur (882 nm) bij E = 0,520. Naast dit veel grotere meetgebied met ascorbinezuur, is ook de extinctie coefficient van de hiermee 'gevormde verbinding veel groter dan van die welke met amidol en metol worden gevormd. Met ascorbinezuur kunnen hierdoor lage fosfaatgehalten met een grotere nauwkeurigheid worden bepaald dan met amidol en metol. In tabel 1 staan enkele gegevens betreffende de voor dit onderzoek ge bruikte gronden. Bij vergelijking van de verschillende methoden is zo veel mogelijk uitgegaan van dezelfde extracten. In een gedeelte van

6 deze extracten ontwikkelden zich bij de molybdeenblauwkleuring met ami do1 afwijkende kleuren, ondanks de in het voorschrift beschreven maatre gelen ter voorkoming.hiervan. Door echter de juiste golflengte (720 nm) te kiezen en doordat de monochromator van de spectrofotometer in staat is een zeer klein golflengtegebied te selecteren, is de storende in vloed van deze afwijkende kleuren gering. Hierdoor heeft ook de eigen kleur van het extract nagenoeg geen invloed. Bij de bepalingen met met01 en ascorbinezuur traden geen kleurafwijkingen op. Met01 kan evenwel slechts als reductiemiddel worden toegepast, indien het citroenzuur, dat vertragend werkt op de kleurontwikkeling is afgebroken. Bij het afbreken, ofwel oxyderen, van dit citroenzuur worden tevens de opgeloste verbindingen afgebroken, waardoor organisch gebonden fosfaat kan vrij komen. Dit verklaart waarom met metol hogere fosfaatgehalten zijn ge vonden (gemiddeld 45,,9 tegen 43,6, tabel 2) dan met amidol. De oxydatie van citroenzuur is tijdrovend. Daarom wordt slechts in door organische verbindingen sterk gekleurde extracten fosfaat bepaald met metol. Bij gebruik van ascorbine'zuur stoort citroenzuur niet (tabel 3). Het niveau van de fosfaatgehalten met ascorbinezuur als reductiemiddel is vrijwel hetzelfde als dat met metol. Bovendien blijkt ascorbinezuur het organisch gebonden fosfaatz~ndervoorafgaande destructie van de opgelos te organische verbindingen te kunnen reduceren (tabel 4). Meer dan 2 ml extract kan niet in gebruik worden genomen, aangezien dan de storende invloed van bepaalde componenten (arsenaten, nitraten en ferriionen) merkbaar wordt (tabel 5). Door de grote gevoeligheid van ascorbinezuur is echter 1 ml extract a1 voldoende voor een optimale extinctie. Het maskeren van storende componenten is daardoor overbodig. Uit een onder. zoek aan 40 monsters, waarin het fosfaat oplosbaar in citroenzuur werd bepaald via de molybdeenblauwkleuring met amidol en met ascorbinezuur als reductiemiddelen, bleek dat de kleuring met ascorbinezuur een gro tere nauwkeurigheid heeft dan die met amidol: de standaardafwijking was respectievelijk 1,O en 2,l. Het niveau van de gehalten met ascor binezuur lag echter 5% hoger dan dat met amidol. Om na te gaan welke gehalten de meest juiste zijn, zouden deze relatieve bepalingsmethoden moeten worden vergeleken met een methode, waarbij de onbekende gehalten niet aan de hand van een reeks standaarden worden bepaald. Een derge lijke absolute referentiemethode voor fosfaat ontbreekt echter. We1 zijn ter orientatie in I1 monsters (gehalten varigrend van 9 tot 81 mg

7 P205 per 100 g) de toegepaste spectrofotometrische methoden vergeleken met de gravimetrische methode volgens Lorenz (tabel 2). Daaruit is berekend met de tekentoets dat de spectrofotometrisch be paalde gehalten met met01 en die met ascorbinezuur (gemiddelde inmg P205 perl0o.g grond van zowel met01 als van ascorbinezuur: 40,2),even als de spectrofotometrisch bepaalde gehalten met amidol en de gravime trisch bepaalde gehalten (gemiddelde in mg P 0 per 100 g grond van 2 5 amidol: 38,2 en gravimetrisch: 37,8) niet significant verschillen. Het systematische verschil tussen enerzijds de gehalten via de spectrofoto ketrische methode met amidol en die via de gravimetrische methode en anderzijds die via de ~~ectrofotometrische methoden met met01 en met ascorbinezuur is echter we1 significant. De verklaring hiervoor kan zijn dat zowel spectrofotometrisch met amidol als langs gravimetrische weg geen en via beide andere genoemde methoden w5l organisch fosfaat wordt bepaald. Van het in citroenzuur oplosbare fosfaat zal naast het anorganisch, ook het organisch gebonden deel voor de plant opneembaar zijn. De spectro fotometrische bepalingsmethode met met01 of met ascorbinezuur geeft dan dus de meest juiste informatie omtrent de hoeveelheid voor de plant beschikbaar fosfaat in de grond.

8 Samenvatting Fosfaat in grond is na extractie met citroenzuur 1% spectrofotometrisch bepaald volgens de molybdeenblauwkleuring met verschillende reductie middelen. Uit dit onderzoek is gebleken dat de kleuring met ascorbine zuur als reductiemiddel door zijn grotere gevoeligheid een grotere nauw keurigheid bezit dan die met amidol (standaardafwijking respectievelijk 1,O en 2,l). Het niveau van de gehalten volgens de molybdeenmethode met ascorbinezuur als reductiemiddel is gelijk aan datmet met01 en hoger dan dat met amidol en dat via de gravimetrische methode volgens Lorenz. Met ascorbinezuur kan maskeren van storende componenten achterwege blij ven. Door deze vereenvoudiging en door zijn grotere nauwkeurigheid heeft de molybdeenblauwkleuring met ascorbinezuur als reductiemiddel de voor keur boven die met amidol en metol. Daarnaast geven de gehalten via de ascorbinezuurmethode waarschijnlijk een meer juiste informatie omtrent de fosfaattoestand van de grond dan de iets lagere gehalten die via de amidol en via de gravimetrische me thode worden gevonden. Het desbetreffende voorschrift is als bijlage 111 aan dit verslag toe gevoegd. +.. Lelystad, januari 1976

9 Galan, L. de 1972 Analytische spectrornetrie Kofstee, J Vergelijkend onderzoek Meto1, Amidol Mofstee, J. en H.J. Fien John, M.K. Keijzer, W.F. I, en Lorenzmethode ter bepaling van het in citroenzuur oplosbare fosfaat in CaCO houdende grondmonsters. 3 R.1J.P. R Analysemethoden voor grond, gewas en bodem vocht, R.IJ.P., Lelystad 1971 Toelichting op de analysemethoden voor grond, gewas, water en bodemvocht. R.IJ.P., Lelystad Colorimetric determination of phosphorus in soil and plant materials with ascorbic acid. Soil Science, april De spectrofotometrische bepaling van to taal fosfaat in grond volgens verschillen de kleuringsmethoden 1975 De spectrofotometrische bepaling van totaal fosfaat in gewas volgens verschillende kleuringsmethoden.

10 Tabel 1. Enkele gegevens van de gebruikte monsters monster nr.. laag in. cm plek nr. Omschri jving de stoofdroge grond bevat in % CaCO humuse lutum , ,630/ '4446,9 6246,963, ,680, ,6102, /2433, , ,O ,O47/ / ,l85, ,9104, ' II rijpingsterreinen Z. Flevoland; 11,3 kavel NZ23; Ym/zu rijpingsterreinen Z. Flevoland; zu 10,8 rijpingsterreinen Z. Flevoland; ala 7,3 rijpingsterreinen Z. Flevoland; alal/ala 2 7,6 rijpingsterreinen Z. Flevoland;ala2 9,6 rijpingsterreinen Z. Flevoland; 7, rijpingsterreinen Z. Flevoland 13,6 ' kavel OZ60; zu rijpingsterreinen Z. Flevoland; alal/ala 2 7,3 rijpingsterreinen Z. Flevoland;ala2 8,4 rijpingsterreinen Z. Flevoland; 6,6 ala 2+3 rijpingsterreinen Z. Flevoland; 5,0 ala 2+3 rijpingsterreinen Z. Flevoland; 4,6 ala 2+3 bosgebieden langs Dronter en Velu 2,l wemeer bosgebieden langs Dronter en Velu 0,6 wemeer bosgebieden langs Dronter en Velu 3,2 meer rijpingsterreinen Z. Flevoland II 11 8,2 8, 19 10,4 (1 II 9,l rt 11 7,7 rijpingsterreinen Z. Flevoland N.O.P.; kavel S 57 Zu I1 8,4 8,5 3,l 3,4 4,O 5,5 7,l 9,l 3,l 4,4 7,4 10,8 12,9 15,l 16,3 32,9~ 11,O 50,6 4,2 6,0, 3,4 4,4 5,6 3,l I ,9 26,3 33,O 27,7 3O,4 33,8

11 Tabel 2. Fosfaat in grond, oplosbaar in citroenzuur I%, bepaald via verschillende methoden. monsternr gemiddeld mg P 0 per 100 g stoofdroge grond. 2 5 spectrbfotometrisch via molybdeenblauwkleuring amidol 36,l 35,8 21,8 35,5 66,2 52,3 38,l 18,8 34,3 74,8 83,3 81,3 met01 37,l 37,2 22,7 36,s 69,4 54,8 40,7 19,3 35,2 78,8 87,4 86,5 ascorbinezuur 37,6 37,6 22,6 37,8 70,l 55,3 40,7 19,8 36,4 79,6 88,5 85,7 8,s 11,6 935 i'!, 18,2 19,l 18,6 12,6 16,7 48,2 63,l 37,3 39,2 72,5 65,6 13,l 17,7 51,2 66,6 38,9 39,8 75,8 69,O 12,7 17,3 51,2 67,O 39,3 41,l 75,7 68,6 43,6 45,9 46,O. gravimetrisch volgens Lorenz 34,5 21,8 36,l 51,8 18,O. 80,6 : 9,O 12,3 47,9 39,O 64,3

12 Tabel 3. Invloed van citroenzuur bij de spectrofotometrische bepaling r van fosfaat in grond, oplosbaar in citroenzuur 1%. I mg 0 per 100 g stoofdroge grond via molyb! 2 5 monsternr. : deenblauwkleuring met ascorbinezuur I 1 ml extract 2 ml extract 2 ml extract + 2 ml~citroenzuur 1% 70,l 69,O 69, 'I ,3 79,6 88,5 85,7 67,O 75,7 68,6 54,5 78,3 87,4 85,7 66,4 74,4 67,5 53,7 78,l 87,3 85,8 66,4 73,7 67,l gemiddeld 73,8 72,9 72,7

13 Tabel 4. Fosfaat in grond, oplosbaar in citroenzuur I%, spectrofotometrisch bepaald na verschillende voorbehandeling monsternr. mg P205 per 100 g stoofdroge grond via molybdeenblauwkleuring citroenzuur gedestrueerd citroenzuur met01 ascorbinezuur niet gedestruee ascorbinezuur ,O 36,7 36, ,l 21,O 20, ,9 68,6 54,6 36,2 69,8 54,7 36,4 70,9 55, ,4 18,8 39,2 19,3 39,2 19,O ,7 35,7 35, ,3 86,6 65,5 36,3 39,5 74,8 67,7 79,7 87,8 66,4 36,5 39,9 76,l 68,3 80,O 87,l 64,7 36,2 39,6 75,6 67,6 gemiddeld 50,6 51,2 51,O

14 Tabel 5. Fosfaat in grond, oplosbaar in citroenzuur I%, spectrofotometrisch bepaald met verschillende hoeveelheden extract in gebruik. monsternr. mg P205 per 100 g stoofdroge grond via molybdeenblauwkleuring met ascorbinezuur 1 ml extract 2 ml extract 4 ml extract 37,6 37,6 22,6 37,8 40,7 19,s 36,4 9,5 18,6 12,7 17,3 51,2 39,3 41,l 30,2 38,5 37,6 22,7 37,1 40,4 19,9 36,l IO,O 18,4 13,3 17,l 50,4 39,l 40,7 30,l 37,l 34,2 18,2 27,l 34,6 14,6 23,7 9,2 18,l 13,l 17,O 43,3 35,4 33,O 25,6

15 P OPLOSBAAR IN C~H~OH(COOH)~ I%(PCITR.). (Amidolmethode) COLORIMETRISCH APPARATUUR REAGENTIA ) MAATKOLF, 50,O ml, geijkt op uit SPECTROFOTOMETER AMIDOL, oplossing I en I1 gieten CITROENZUUR, 5% en 1% THERMOSTAAT, instelbaar op OC WERKWIJZE FOSFAAT, standaard, 1,O ml 2 0,050 mg Een serie bestaat uit 45 bepalingen. In iedere serie een blanco bepaling en een standaardmonster meenemen. 5,000 g luchtdroge grond afwegen in erlenmeyer 100 ml. Toevoegen bij grond met een CaCO gehalte < 1%: 50,O ml C H OH(COOH)3 1%; bij grond met een CaCO gehalte > 1%: (10 + 1,28 x % CaCO op luchtdroge 3 3 grond) ml C H OH(COOH)3 5%, aangevuld met H20 ged. tot 50,O ml in een op 3 4 uitgieten geijkte maatkolf. Erlenmeyer omschudden en afsluiten met niet te vast sluitende stop. Gedurende 48 uur plaatsen in thennostaat bij 20 C. Overdag omschudden met tussenpozen van een uur. Filtreren over hard vouwfilter in erlen meyer 100 ml. 5,O ml filtraat (van blancobepaling 4x 5,O ml) pipetteren in maat kolf 100,O ml. De hierna te gebruiken vloeistoffen op 20'~ brengen. Aan 2 blancobepalingen toevoegen 10,O ml Pstandaard. Toevoegen 50 ml H20 ged., 10 ml Amidoloplossing I en daarna 10 ml oplossing 11. Na iedere toevoeging mengen. Aanvullen met H 0 ged. tot 100,O ml. 1 uur ng toe 2 voegen van oplossing 11, blauwe kleur meten in spectrofotometer bij 720 nm t.0.v. de blancobepaling. '2'5 ~ereiding reagentia: 'Hofstee en Fien, 1971.

16 P OPLOSBAAR IN C3H40H(COOH)3 I%(PCITR.). COLORIMETRISCH (Metolmethode) APPARATUUR REAGENTIA 1) MAATKOLF, 50,O ml, geijkt op uitgieten. CITROENZUUR, 5% en I%. SPECTROFOTOMETER. FOSFAAT, standaard, 1,O ml 2 0,050 THERMOSTAAT, instelbaar op OC. KALIUMPERMANGANAAT, 2%. WERKWIJZE mg '2'5 METOL, oplossing I, I1 en 111. OXAALZUUR, 0, I n. ZWAVELZUUR, 40%. Een serie bestaat uit 45 bepalingen. In iedere serie een blanco bepaling en een standaardmonster meenemen. 5,000 g luchtdroge grond'afwegen in erlenmeyer 100 ml. Toevoegen bij grond met een CaCO gehalte r 1%: 50,O ml C3H40H(COOH)3 1%; 3 bij grond met een CaCO gehalte > 1%: (10 + 1,28 x % CaC03 op lucht 3 droge grond) ml C H OH(COOH)3,:,5%, aangevuld meth20 ged. tot 50,O ml 3 4 in een op uitgieten geijkte. maatkolf... Erlenmeyer omschudden en afsluiten met niet te vast sluitende stop. Gedurende 48 uur plaatsen in thermostaat bij 20'~. Overdag omschudden met tussenpozen van een uur. Filtreren over hard vouwfilter in erlen meyer 100 ml. 10,O ml filtraat (van blancobepaling 4x 10,O ml) pipetteren in bekerglas 100 ml. Toevoegen 1; ml H SO 40%, 10 ml KMn04 2% en enige 2 4 kooksteentjes. Oxyderen op kleine vlam. Toevoegen KMnO 2% tot blijven 4 de kleuring of blijvende MnO afscheiding. Overmaat KMnO wegnemen met 2 4 H C 0 0,1 n (geen overmaat H C 0 toevoegen) Overspoelen met H 0 ged. in maatkolf 100,O ml tot een volume van ml. Afkoelen tot 20%. De hierna te gebruiken vloeistoffen op 20 C brengen. Aan 2 blancobepalingen toevoegen 10,O ml Pstandaard. Toevoe gen 10 ml Metoloplossing I, daarna 10 ml oplossing I1 en na 15 min. 20 ml oplossing 111. Na iedere toevoeging mengen. Aanvullen met H20 ged. tot 100,O ml. Mengen. Na 30 min. staan, blauwe kleur meten in spectrofotometer bij 720 nm t.0.v. de blancobepaling. Bereiding reagentia: Hofstee en Fien, 1971

17 P OPLOSBAAR IN C3H40H(COOH)3 1% (PCITR.). SPECTROFOTOMETRISCH Ascorbinezuurmethode APPARATUUR REAGENTIA' ) Maatkolf, 50,O ml, geijkt op uitgieten Spectrofotometer Thermostaat instelbaar 0' op C. Ascorbinezuur, reagensmengsel Citroenzuur, 5% en 1% Fosfaat, standaard, 1,O ml 0,004 mg '2'5 Een serie bestaat uit 45 bepalingen. In iedere serie een blancobepaling en een standaardmonster meenemen. 5,000 g luchtdroge grond afwegen in,erlenmeyer 100 ml. Toevoegen bij grond met een CaCO gehalte < 1%: 50,d ml C H OH(COOH)3 I%; bij grond met een CaCO gehalte > 1%: (10 + 1,28 x % CaCO op luchtdroge 3 3 grond) ml C3H40H(COOH)3 5%, aangevuld met H20 ged. tot 50,O ml in een op uitgieten geijkte maatkolf. Erlenmeyer omschudden en afsluiten met niet te vast sluitende stop. Gedurende 48 uur plaatsen in thermostaat bij 20'~. Overdag omschudden met tussenpozen van een uur..filtreren over hard vouwfilter in erlenmeyer 100 ml. 1,O filtraat (van blancobepaling 4 x 1,O ml) pipetteren in maatkolf 100,O ml. Aan 2 blancobepalingen toevoegen 15,O ml Pstandaard. Toevoegen 20,O ml ascorbinezuurlreagensmengsel. Aanvullen met H20 ged;.: tot 100,O ml. Mengen. Na minstens 30 minuten staan, blauwe kleur meten in spectrofotometer bij 882 nm. Bereiding reagentia: Hofstee en Fien, 1971.