Normal operating range of the microbial community under potato Inceolu, Özgul

Transcriptie

1 Normal operating range of the microbial community under potato Inceolu, Özgul IMPORTANT NOTE: You are advised to consult the publisher's version (publisher's PDF) if you wish to cite from it. Please check the document version below. Document Version Publisher's PDF, also known as Version of record Publication date: 2011 Link to publication in University of Groningen/UMCG research database Citation for published version (APA): Inceolu, Ö. (2011). Normal operating range of the microbial community under potato Groningen: s.n. Copyright Other than for strictly personal use, it is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of the author(s) and/or copyright holder(s), unless the work is under an open content license (like Creative Commons). Take-down policy If you believe that this document breaches copyright please contact us providing details, and we will remove access to the work immediately and investigate your claim. Downloaded from the University of Groningen/UMCG research database (Pure): For technical reasons the number of authors shown on this cover page is limited to 10 maximum. Download date:

2 Samenvatting Populaties van micro-organismen worden onder andere beïnvloed door plantenwortels via de uitscheiding van organische stoffen in het exudaat. Op deze manier trekken planten dus selectief micro-organismen aan in hun rhizosfeer, die vervolgens bepaalde uitgescheide stoffen consumeren. Omdat verschillende plantensoorten en verschillende groeistadia van de plant leiden tot andere patronen van wortelexudaten, is het logisch dat dit verschil ook tot uiting komt in het effect op de microbiële populaties. Echter, het is nog niet bekend in hoeverre zulke veranderingen in de populaties kunnen voorkomen, over de dynamiek hiervan en hoe deze veranderingen het functioneren van het systeem beïnvloeden. Als de invloed van genetisch gemodificeerde planten bepaald wordt, is het dus belangrijk om eerst de samenstelling van de microbiële populatie te bepalen, zowel als de individuele microbiële populaties en fluctuaties hierin. Hiervoor is het belangrijk, dat er eenvoudige methoden voorhanden zijn voor het monitoren van microbiële populaties en veranderingen in de tijd. Deze data vormen dan de baseline voor de populatie onder landbouwgewassen in een bepaalde bodem, waartegen vervolgens de data van genetisch gemodificeerde planten gewogen kunnen worden, in dit gevals voor de aardappel. Tot dusverre, was een dergelijke baseline nog niet voldoende gedefinieerd, vooral vanwege het feit dat ecosystemen in de bodem een dynamisch karakter hebben en snel kunnen veranderen als gevolg van seizoensinvloeden of landbouwkundige bewerkingen. Omdat dit de normale operationele condities van het systeem vertegenwoordigt, is deze seizoensgebonden variatie van populaties micro-organismen in de bodem onder normale agrarische activiteit, hetgeen dan gebruikt moet worden voor het vaststellen van de baseline. De grenzen hiervan worden bepaald door de extremen van deze fluctuaties en bepalen op deze manier de normale operationele condities. Dit zal de richtlijn vormen voor de risicoanalyse van het gebruik van genetisch gemodificeerde planten met betrekking tot de effecten op de bodem. Omdat minder dan 1% van micro-organismen in de bodem in cultuur gebracht kan worden buiten de natuurlijke omgeving, zijn er moderne, meer gevoelige methodes nodig om de structuur en functie van het ecosysteem in de bodem te bepalen. Echter, bij alle moderne methoden, gebaseerd op analyse van het DNA in de bodem, kunnen de meetgegevens al bij de extractie van het DNA uit de bodem vertekend worden. Daarom wordt in hoofd stuk 2 van dit proefschrift een vergelijking gemaakt tussen vier verschillende DNA extractie-methoden, waarvan twee op basis van een commercieel verkrijgbare kit (MoBio Ultraclean en Powersoil), en twee op basis van niet-commercieel verkrijgbare methoden (Smalla et al en CIAT). Deze methoden werden vergeleken met betrekking tot de effectiviteit in het verkrijgen van DNA uit drie agrarische bodems van verschillende samenstelling en gehalte aan organische stof. Bij de analyse werd gekeken naar kwaliteit en kwantiteit van het geëxtraheerde DNA, in combinatie met analyses met behulp van PCR-DGGE naar de samenstelling van populaties van aanwezige soorten bacteriën, archaea, β-proteobacteriën, ammonium oxiderende β-proteobacteriën, pseudomonaden en actinobacteriën. Van deze groepen werden duidelijke verschillen aangetoond tussen de verschillende DNA extractiemethoden met betrekking tot de gemeten soortenrijkdom en samenstelling van de groepen. Dus: verschillende DNA extractiemethoden toegepast op hetzelfde bodemmonster geven een verschillend beeld van de aanwezige micro-organismen. Op basis van de resultaten 166

3 werd ervoor gekozen om tijdens de rest van het onderzoek te werken met Powersoil, vanwege de effectiviteit, hoge opbrengst en de zuiverheid van het DNA. In hoofdstuk 3 worden de effecten beschreven die het cultivar van een gewas, het groeistadium en het type bodem hebben op de micro-organismen die leven in de nabijheid van de aardappelplant. De cultivars Aveka, Aventra, Karnico, Modena, Premiere en Désiree werden onderzocht in twee verschillende aardappelvelden, beiden op een zandgrond, maar één veld met lage gehaltes organische stof en het andere veld met hoge gehaltes organische stof. Metingen werden gedaan tijdens de verschillende groeistadia jonge plant, bloeistadium en verouderende plant. Hiervan werden de structuur van de populatie bacteriën en β-proteobacteriën in de rhizosfeer geanalyseerd met PCR-DGGE. Deze analyse toonde aan dat alle cultivars in beide velden een zogeheten rhizosfeer effect uitoefende op zowel de totale bacterie-populatie als op de β-proteobacteriële bacteriepopulatie. Daarnaast bleek dat het groeistadium van de plant een sterk effect heeft op de β-proteobacteriële bacteriepopulaties in beide velden. Uiteindelijk bleek de samenstelling van de populaties ook te worden beïnvloed door verschillende cultivars, die van elkaar verschilden in groeisnelheid, ontwikkeling van het wortelsysteem en het gemiddelde zetmeelgehalte in de aardappel. Omdat sulfonaatverbindingen in de bodem vrij immobiel zijn, maar wel van belang als nutriënt voor de plant, met name in zwavelarme bodems, werd er ook gekeken naar Variovorax paradoxus. Kwantificeren van het functionele gen asfa, betrokken bij desulfonering, gaf duidelijk aan dat er een rhizosfeer effect van de aardappelplant optreedt in de abundance. Het was vooral interessant dat zowel het cultivar type als ook het groeistadium van de plant de populatie beïnvloedde onder bepaalde omstandigheden. Voor verdere analyse was pyrosequencing van het DNA gebruikt om de structuur van de bacterie-populaties te bepalen, zoals beschreven in hoofdstuk 4. De monsters van het veld met het lagere organische stof gehalte werden gebruikt voor het bepalen van de trend van de belangrijke phyla en klassen. De per cultivar (zie boven) gecombineerde rhizosfeermonsters werden voor elk groeistadium (jonge plant, bloeifase en verouderende plant) onderzocht, net als de corresponderende bulkgrondmonsters. Dit leverde ongeveer sequenties op (5.700 tot per monster). Voor alle verschillende monsters werd de distributie van de soorten het best beschreven met het power law model. Dit wijst erop dat de populatie voornamelijk bestaat uit enkele zeer dominante soorten, met daarnaast zeer veel weinig voorkomende soorten. De dominerende sequenties kwamen voornamelijk van de Actinobacteriën en Alfaproteobacteriën, met verder tot nu toe ongeklassificeerde bacteriën. Andere groepen die in alle monsters werden gevonden, zij het in veel lagere hoeveelheden, waren Beta-, Gamma- en Delta-proteobacteriën en Acidobacteriën. Hoofdcomponentenanalyse toonde aan dat er een significant rhizosfeereffect optrad voor alle groeistadia. Verder bleek er een cultivar effect op te treden in het jonge plant stadium, hoewel dit niet meer significant was tijdens latere groeistadia van de plant. Ook bleek een effect op te treden met betrekking tot het moment van het seizoen, zowel in de rhizosfeermonsters als in de bulkgrondmonsters. Zoals blijkt uit de ecologische indicatoren floreren de copiotrofe Pseudomonaden, Beta-, Alfa- and Deltaproteobacteriën op verschillende tijdstippen in het seizoen in vergelijking met de vermoedelijk oligotrofe Acidobacteriën. Het doel van hoofdstuk 5 is het bepalen van de effecten van de bodem en verschillende cultivars op de structuur van de substraat-gevoelige populaties. De populatiestructuur van rhizosfeer-monsters van vijf verschillende aardappelcultivars van een lemige zandgrond en twee van een zandige veengrond werden geanalyseerd, samen met die van 167

4 bulkgrondmonsters van beide bodems. Naast PCR-DDGGE analyse van het bacteriële 16S rrna-gen, werden de populaties ook bestudeerd in fenotypische micro-arrays, waarbij het gebruik van verschillende koostof-, zwavel- en fosfor-bronnen in kaart werd gebracht. Verder werden sommige van de micro-array-wells verder geanalyseerd met PCR-DGGE om de structuur van de substraat-gevoelige populaties nader te bepalen. Er waren duidelijke effecten van bodemtype, rhizosfeer en cultivar type op de microbiële populatiestructuur en diversiteit. Het bodemtype was de meest bepalende factor die de populaties vormgaf, waar rhizosfeer en cultivar de populatie in kleinere mate beïnvloedden. In hoofdstuk 6 wordt het effect van verschillende concentraties lineaire alkylbenzeensulfonaten (LAS) bestudeerd, vanwege de vermoedelijke rol van aromatische sulfonaten in de bodem als belangrijke zwavelbron voor de plant. Voor deze studie werd een microcosmos experiment opgezet met twee aardappelcultivars, Aveka (hoog zetmeelgehalte in de knol) en Premiere (laag zetmeelgehalte in de knol). Om de effecten van cultivar, groeistadium en LAS te bepalen op de bulk en de rhizosfeer populaties, werden een bacteriële en betaproteobacteriële PCR-DGGE-analyse en een qpcr-analyse specifiek voor asfa gedaan. Hieruit bleek dat groeistadium en behandeling met LAS duidelijke effecten had op de samenstelling van de populatie, hoewel geen significant effect kon worden gevonden voor de totale bacteriële populatie. Behandeling met LAS vertoonde geen significant effect op de aanwezigheid van het asfa-gen van Variovoras paradoxus. Vanwege incompleet verbruik van de beschikbare sulfaten is mogelijk het desulfoneringsproces onvoldoende geactiveerd gedurende de tijdspanne van het experiment. Ter controle werden clone libraries geconstrueerd van betaproteobacteriën. Een significant effect op de populatie werd gevonden in de behandeling 50 mg sulfaat/kg droge grond en 50 mg LAS/kg droge grond met cultivar Premiere, en verder in het initiële bulkgrondmonster. Een mogelijke verklaring is dat bepaalde phylotypes de LAS gebruiken voor desulfonering en/of koolstofmineralisatie processen. Verdere experimenten met sulfaat-arme bodems zijn nodig om een goed beeld te geven van het belang van het desulfoneringsproces in landbouwgronden. Het in kaart brengen van de onderlinge dynamiek van microbiële populaties is niet alleen belangrijk om deze complexe biologische systemen te karakteriseren, maar ook om de effecten te begrijpen die veranderende microbiële populaties kunnen hebben op ecosystemen op het land. Daarom wordt in hoofdstuk 7 het effect onderzocht van het gebruik van de bodem voor landbouw op microbiële populaties in die bodem. Een rotatieschema van aardappel gerst aardappel werd bestudeerd, met inbegrip van het gebruik van een genetisch gemodificeerd aardappelcultivar. Omdat dit systeem model staat voor de standaard operationele activiteiten, kan de variatie van de bodempopulaties voor dit rotatieschema worden gebruikt als baseline. Zoals is gebleken uit de voorgaande analyses, werd de bacteriële populatie in de rhizosfeer beïnvloed door het groeistadium. Verder hebben clone libraries en DGGE analyse aangetoond dat de microbiële populaties in de bulkgrond niet constant waren over de drie groeiseizoenen. Dit resultaat geeft aan dat de combinatie van temperatuur, landbewerking, en de aanwezigheid van planten een effect hebben op de bacteriële populatie in de bodem. Hoofdstuk 8 omvat de discussie van de resultaten van de voorgaande hoofdstukken. Ook worden suggesties gedaan voor vervolgonderzoek. De gebruikte methoden kunnen op bepaalde punten nog geoptimaliseerd worden. Verder is het belangrijk dat verschillende methoden zo samen gekozen worden dat ze vertekening van de verkregen resultaten zoveel mogelijk uitsluiten. Uit het DNA dat met de meest geschikte methode werd geëxtraheerd, 168

5 bleek dat de bacteriële populatie significant veranderde op basis van verschillen in bodem type en plant cultivar. Echter, er was geen enkele aanwijzing dat het genetisch gemodificeerde aardappelcultivar microbiële populaties op een andere manier beïnvloedt dan de andere cultivars: het effect van het genetisch gemodificeerde cultivar past volkomen binnen de grenzen van de baseline. Het is belangrijk om te bedenken, dat wanneer het effect van DNA van genetisch gemodificeerde gewassen wordt bestudeerd, de hoeveelheid DNA van genetisch gemodificeerde gewassen zeer klein is ten opzichte van het DNA van nietgemodificeerde planten dat vrijkomt, zelfs als genetisch gemodificeerde gewassen op grote schaal zouden worden geplant. Verder hebben ook landbouw-activiteiten als bemesting en bewerking van de landbouwgrond een grote impact op de microbiële populaties in de bodem. Op basis van de uitgevoerde onderzoeken, kan worden gesteld dat het belangrijk is dat per type gewas en op basis van de uitgevoerde modificatie, indicator-organismen worden gedefinieerd die geschikt zijn voor een risico-analyse. In dit geval, een modificatie die verandering aanbracht in het zetmeelgehalte van de aardappel, bleek de populatie van betaproteobacteriën geschikt te zijn als gevoelige indicator van eventuele neveneffecten. 169