Cover Page. The handle holds various files of this Leiden University dissertation

Transcriptie

1 Cover Page The handle holds various files of this Leiden University dissertation Author: Velstra, Berit Title: Mass spectrometry based protein profiling : taking the steps towards clinical application Issue Date:

2 8 Nederlandse samenvatting

3

4 Nederlandse samenvatting 151 Nederlandse samenvatting Kanker is één van de grootste gezondheidsproblemen in de Westerse wereld. In 2050 zal het aantal patiënten met kanker verdubbeld zijn als gevolg van vergrijzing, groei van de wereldbevolking en door toename van kankerveroorzakend gedrag, zoals roken, slechte eetgewoontes en veelvuldig zonnebaden. Verschillende onderzoeksvelden richten zich op verbetering van de oncologische zorg. Dit kan zijn voordat er klinische symptomen zichtbaar zijn, zoals op het gebied van erfelijke aspecten en vroegdetectie, of nadat er klinische symptomen zijn. In dit laatste geval richt onderzoek zich op prognose, ziekte-monitoring en beoordeling van therapie (effectiviteit en toxiciteit). De meeste onderzoeksgroepen leggen de nadruk op behandeling, echter de verwachting is dat in de nabije toekomst behandeling en de follow-up van de alsmaar groeiende populatie met kanker financieel niet meer haalbaar zal zijn. In plaats van zich te richten op behandeling is het wellicht efficiënter te focussen op wat we al weten en meer te investeren in het voorkómen en in het vroeger opsporen van kanker. Screening is een belangrijk middel waarmee sterfte door kanker verminderd kan worden. Helaas schieten de huidige screeningsmethoden nog tekort. Borstkanker is de meest voorkomende maligniteit bij vrouwen en gaat gepaard met een hoge mortaliteit. Volgens de meest recente cijfers krijgt één van elke acht vrouwen in haar leven borstkanker. Het stadium van de tumor bij ontdekking is de belangrijkste uitkomstparameter. Met name tumorgrootte en het wel-of-niet hebben van uitzaaiingen in de lymfeklieren zijn risicofactoren voor het krijgen van een recidief. Dit betekent dat idealiter de tumor opgespoord moet worden voordat deze gevoeld kan worden of klachten geeft. Screening is hiervoor de aangewezen methode. Bij borstkanker is mammografie de gouden standaard voor screening en (vroeg)detectie. Deze methode gaat gepaard met beperkingen omdat het vaak als onaangenaam wordt ervaren en vooral in de hoge risicogroep (BRCA1 of BRCA2 mutatiedraagsters) ontbreekt de sensitiviteit en specificiteit. 7 Een andere tumor waarbij winst te behalen valt voor de screeningsmethoden is alvleesklierkanker. Patiënten met alvleesklierkanker hebben een extreem slechte prognose omdat de tumor vaak in een laat stadium klachten geeft en dan niet meer curatief te behandelen is. Het betreft een tumor met een lage incidentie van 8 op de mannen en 5 op de vrouwen. Desalniettemin is het de vierde en respectievelijk vijfde oorzaak van sterfte door kanker in ontwikkelde landen. Screening op alvleesklierkanker van de totale bevolking is geen optie vanwege deze lage incidentie. Bij personen met een verhoogd risico op alvleesklierkanker (zoals bij het Peutz Jeghers syndroom, familiaire atypische multiple mole melanoma (FAMMM), BRCA2 mutatie dragers) kan

5 152 Chapter 8 screening wel effectief zijn. Op dit moment is het gebruik van MRI de gangbare methode voor de detectie van alvleesklierkanker. Het nadeel van deze methode is de beperkte specificiteit en de hoge kosten. Daarom is er naast de huidige screeningsmethoden een dringende behoefte aan nieuwe moleculaire markers met hoge sensitiviteit en specificiteit. Voor zowel borstkanker als alvleesklierkanker zijn nog geen geschikte biomarkers beschikbaar voor vroegdetectie. In dit proefschrift wordt onderzocht of eiwitprofielen verkregen met behulp van massaspectrometrie kunnen fungeren als biomarker voor de vroege opsporing van borstkanker of alvleesklierkanker. Massaspectrometrie is een krachtige techniek voor de detectie, kwantificering en identificatie van eiwitten in verschillende lichaamsvloeistoffen, zoals serum verkregen uit bloedmonsters. Echter, voordat een meting in de massaspectrometer kan plaatsvinden, dient serum volgens een strikt protocol gezuiverd en verwerkt te worden. Eén manier van zuiveren (ook wel fractioneren genoemd) is vastefase extractie met behulp van gefunctionaliseerde magnetische, microscopisch kleine bolletjes. Deze bolletjes zijn gecoat met een materiaal met een specifieke affiniteit voor eiwitten. Wanneer de eiwitten in het serum gebonden zijn aan de bollen, kunnen deze met een magneet worden vastgehouden tijdens verschillende wasstappen. Vervolgens worden de eiwitten op een plaatje aangebracht, dat hierna in de massaspectrometer geplaatst wordt. Deze massaspectrometer bestaat uit een ionenbron, een vluchtbuis en een detector. In de ionenbron worden met behulp van een laser de eiwitten geïoniseerd. Aldus verkregen eiwitionen worden in de vluchtbuis in hoogvacuüm gescheiden op basis van massa. Hoe zwaarder het eiwition, hoe later het bij de detector aankomt. Dit wordt Time-of-Flight (TOF), vluchttijd, genoemd. Een massaspectrum, ook wel profiel, bestaat uit een x-as waar de massa wordt weergegeven met op de y-as de bijbehorende intensiteit. Een eiwitprofiel kan gezien worden als een vingerafdruk van de klinische toestand van een persoon. De in dit proefschift beschreven massaspectrometrische methoden zijn TOF gecombineerd met MALDI (matrix-assisted laser desorption/ ionization) of SELDI (surface enhanced laser desorption/ionization). De resultaten van de studies van dit proefschrift worden in twee delen beschreven: Allereerst wordt de stand van zaken van borstkanker screening met behulp van eiwitprofielen besproken. Wat zijn de tot nog toe bereikte resultaten? Wat is er nog nodig om deze technieken in de praktijk toe te passen? In het tweede deel wordt het gebruik van de nieuwe eiwitprofielen als screeningsmethode voor alvleesklierkanker geëvalueerd. Verder worden toekomstige studies voorgesteld die nodig zijn om deze veelbelovende biomarker te vertalen naar een klinische setting. Het gebruik van eiwit biomarkers in

6 Nederlandse samenvatting 153 een serum test is immers een minimaal invasieve, sensitieve en specifieke methode zoals beschreven in de verschillende hoofdstukken. 1. Borstkanker screening door middel van serum eiwit profielen: stand van zaken In de literatuur zijn verschillende studies beschreven waarin een SELDI- of MALDI-TOF massaspectrometrie methode wordt gebruikt om ziekte-specifieke peptide en eiwit vingerafdrukken of profielen te creëren. Deze studies zijn voortgekomen uit het aanvankelijke succes van de groep van Petricoin die in 2002 een serumprofiel genereerde met behulp van SELDI-TOF massaspectrometrie. Met dit profiel kon onderscheid gemaakt worden tussen vrouwen met ovariumkanker en gezonde vrouwen. Hoofdstuk 2 bestaat uit een review over de verschillende biomarkerstudies gebaseerd op SELDI-TOF of MALDI-TOF massaspectrometrie voor de vroege diagnose van borstkanker. De eerste studies lieten veelbelovende resultaten zien met een hoge sensitiviteit en specificiteit variërend van 80% tot 100%. In vervolgstudies bleek echter dat deze resultaten niet gereproduceerd konden worden. Eén van de verklaringen hiervoor is het verschil in de gehanteerde onderzoeksprotocollen. In een eerdere LUMC-studie (De Noo 2005) is het effect van het aantal vries-dooi cycli, en de periode tussen verzamelen en serum centrifugatie op serum eiwitprofielen uitgebreid bestudeerd. Om verschillende studies te kunnen vergelijken en eerder bereikte resultaten te valideren, is het van cruciaal belang om identieke pre-analytische omstandigheden te creëren. Met andere woorden: de workflows moeten worden gestandaardiseerd. Een andere verklaring voor het niet kunnen reproduceren kan zijn dat het aantal mensen in de onderzochte groepen relatief klein was en vaak gezonde mensen werden gecategoriseerd als controle terwijl deze niet representatief zijn voor de algemene bevolking met verschillende comorbiditeiten. Er wordt veel gezocht naar die specifieke eiwitpiek of dat kleine aantal classificerende eiwitten als biomarker, maar zoals in hoofdstuk 3 wordt gesteld, kan het volledige profiel van eiwitten en peptiden een krachtiger en specifieker onderscheid maken. In een grote case-controlegroep werd aangetoond dat MALDI-TOF peptide en eiwitprofielen gebruikt kunnen worden om borstkanker patiënten te onderscheiden van gezonde vrijwilligers met goede sensitiviteit en specificiteit. Hiervoor werd een opschoningsmethode gebruikt met twee verschillende magnetische bollen voor vaste-fase extractie, namelijk één met een affiniteit voor reversed phase (RP) C18 en één met een affiniteit voor weak cation exchange (WCX). Het goede onderscheidende resultaat werd bereikt met behulp van een volledig geautomatiseerde work-up welke zorgde voor een gestandaardiseerde en robuuste eiwit en peptide isolatieprocedure. Door het combineren van de gegevens die uit deze twee complementaire procedures volgden, verbeterde de classificatie resultaten. Beide methoden leverden verschillende 7

7 154 Chapter 8 peptiden van hetzelfde eiwit en daarmee kan de analyse worden geïnterpreteerd als twee onafhankelijke metingen. Om hun biologische rol en de mogelijke betrokkenheid bij ziekteprocessen te begrijpen, is het belangrijk om serumpeptiden te typeren. Vervolgens konden de meest onderscheidende RPC18 peptidepieken, ook wel eiwitfragmenten of eiwit degradoom genoemd, in het profiel geïdentificeerd worden als fragmenten van FGA-keten, complement C3 en ITIH4. Dit zijn fragmenten van grotere eiwitten die veel voorkomen in het serum (hierna: high-abundant eiwitten) en voornamelijk een functie hebben bij de stolling en immuunhuishouding. Het lijkt erop dat de biomarkers die werden ontdekt met op massaspectrometrie-gebaseerde technieken niet uit tumor-specifieke eiwitten, maar tumorspecifieke eiwitfragmenten bestaan. Dit kan het gevolg zijn van tumorspecifieke proteasen die deze high-abundant serum eiwitten anders splitsen dan gewone proteasen. Deze door tumorcellen uitgescheiden unieke proteasen kunnen bijdragen aan subtiele veranderingen die zichtbaar zijn in proteomics vingerafdrukken. Hierdoor zou het serum eiwit degradoom belangrijke informatie kunnen bevatten die direct klinisch bruikbaar is als biomarker voor de detectie en classificatie van bepaalde tumoren. Borstkankerscreening door middel van serum eiwitprofielen: toekomstige stappen Voor een goede implementatie van massaspectrometrie-gebaseerde eiwitprofielen in borstkanker screeningsprotocollen is een uitstekende reproduceerbaarheid van de discriminerende profielen in diverse nieuwe case-controle groepen noodzakelijk. Dit wordt validatie genoemd. Waarom is dit moeilijk voor borstkanker? Een verklaring hiervoor zou de heterogeniteit van borstkanker en de micro-omgeving kunnen zijn. Klinisch kan borstkanker worden onderverdeeld in drie fundamentele therapeutische groepen: 1) de oestrogeen receptor positieve groep met respons op endocriene adjuvante behandeling; 2) de Her2 / Neu groep met een effectieve adjuvante therapeutische optie; 3) de triple negatieve groep, met slechts chemotherapeutische adjuvante behandelopties en een slechte prognose. Daarnaast kunnen borsttumoren worden ingedeeld in subtypes op basis van verschillen in genexpressie: luminale A en B, HER2 verrijkt, basallike, laag claudin en normaal. Deze subtypen onderscheiden zich door verschillen in agressiviteit en de respons op de behandeling. Wellicht is het noodzakelijk om diverse discriminerende profielen op deze subgroepen van borstkanker te ontwikkelen en te valideren. Een volgende stap zou kunnen zijn om een onderscheidende eiwit- en peptideprofiel te ontwikkelen voor goedaardige borsttumoren en dat te vergelijken met het kwaadaardige profiel waarmee de specificiteit van de diagnostische serumtesten verbeterd wordt. Vervolgens dient het ontwikkelde serum eiwitprofiel te worden getest op de normale bevolking die in aanmerking komt voor borstkanker screening, namelijk vrou-

8 Nederlandse samenvatting 155 wen in de leeftijd van jaar, en uiteraard de patiënten met een hoog risico. In deze patiëntengroep is mammografie minder betrouwbaar vanwege het compacte (dichte) borstweefsel. Omdat BRCA1 tumoren agressiever zijn, is vroege opsporing van cruciaal belang voor vrouwen die afzien van profylactische ablatie van hun borsten. Bovendien is bij het screenen op jonge leeftijd een verhoogd risico op stralingsgeïnduceerde tumoren. Vroege opsporing van borstkanker in hoog risicogroepen met behulp van serum eiwitprofielen wordt nu geëvalueerd in een lopende TESTBREAST studie. Verder is het beschikbaar zijn van gedocumenteerde serum biobanken (zoals in het LUMC) belangrijk. In deze biobank bevinden zich serummonsters van vrouwen uit de normale screenings populatie, van borstkankerpatiënten, maar ook van patiënten met ontstekingen en goedaardige knobbels en van hoog-risico patiënten. Hierdoor kunnen de benodigde studies voor het uiteindelijk klinisch toepasbaar maken van de discriminerende eiwitprofielen op de juiste manier uitgevoerd worden. Deze profielen zullen niet de mammografie gaan vervangen. Ze kunnen wel worden gebruikt als selectiecriterium voor de meer pijnlijke en tijdrovend mammografie. 2. Alvleesklierkanker screening door middel van serumeiwit profielen: stand van zaken Verschillende onderzoeksgroepen hebben in de afgelopen tien jaar studies uitgevoerd naar eiwitprofielen met behulp van verschillende soorten massaspectrometrie en verschillende soorten fractioneringstechnieken met als doel het ontwikkelen van diagnostische biomarkers voor alvleesklierkanker. Door middel van verschillende technieken en protocollen werden veelbelovende sensitiviteiten van % en specificiteiten van 75-98% bereikt. Bovendien werden meerdere onderscheidende peptiden reeds geïdentificeerd, zoals Platelet Factor 4 (3884 Da), Apolipoproteine CI, Apolipoproteine AI, Apolipoproteine A-II en transthyretine. 7 Het protocol voor serumsampling, -handling en -verwerking dat in het LUMC ontwikkeld is met behulp van een geautomatiseerd platform dat high-throughput analyses faciliteert, werd gebruikt voor verschillende klinische case-controle validatie studies. De resultaten worden besproken in de hoofdstukken 4-6. Er werden serummonsters van alvleesklierkanker patiënten en gezonde personen verzameld, eiwitten geïsoleerd met WCX magnetische bollen en profielen verkregen met behulp van MALDI-TOF massaspectrometer. Een onderscheidend profiel met goede prestaties werd aangetoond. Deze resultaten konden worden gevalideerd met een sensitiviteit van 74% en een specificiteit van 91% in een aparte case-controle set die een jaar later werd gemeten op hetzelfde platform (hoofdstuk 4).

9 156 Chapter 8 Deze veelbelovende uitkomsten waren de aanleiding voor de verdere exploratie van massaspectrometrie-gebaseerde eiwitten en peptiden profilering van serummonsters van patiënten met alvleesklierkanker. Tegenwoordig is de nadruk in biomarker onderzoek verlegd naar piekidentificatie. Een gevolg van lage resolutie massaspectrometrie eiwitprofielen, zoals na WCX magnetische bollen fractionering gecombineerd met de MALDI-TOF, is dat (poly) peptiden en eiwitten worden gemeten als brede pieken, hetgeen leidt tot problemen met piekidentificatie. Daarom is een tweede alvleesklierkanker case-controle studie met RPC18 magnetische bollen uitgevoerd (hoofdstuk 5). Deze fractionering levert peptiden en kleine eiwitten op. Structuurkarakterisering van deze peptiden is eenvoudiger dan bij grotere eiwitten. Om de identificatie van discriminerende eiwitten verder uit te diepen, is het beter om eerst het diagnostische vermogen van kandidaatmarkers te bepalen voor identificatiestudies. Tevens moet verder onderzoek naar hun rol in biologische ziekteprocessen worden verricht. Het peptideprofiel dat werd verkregen na RCP18 magnetische bol extractie kon alvleesklierkanker patiënten discrimineren van gezonde controles met een sensitiviteit van 76% en specificiteit van 91% (AUC van 92%). Dit onderscheidend profiel werd getest op een nieuwe casecontrolegroep en presteerde nog beter met een sensitiviteit van 93% en een specificiteit van 100% (AUC van 98%). Verder werden de resultaten van de peptideprofielen naast de standaard beeldvorming en (routine) CA19-9 waarden geplaatst. Zo werd voor elke individuele patiënt een complementair voordeel van peptideprofilering gezien. In een tweede statistische analyse werden de beste tien discriminerende pieken geselecteerd. Deze konden worden geïdentificeerd met behulp van bestaande peptide databases als fragmenten van eiwitten die betrokken zijn bij het stollingsproces, acute fase en immunologische reacties. Er moet opgemerkt worden dat de weinig voorkomende (hierna: Low-abundant) eiwitten en peptiden niet kunnen worden waargenomen in een eiwitprofiel. Bij een oplossend vermogen van circa kan één piek nog steeds bestaan uit meerdere in massa-overlappende peptiden. Daarom werd het oplossend vermogen van de profielen verhoogd met een MALDI Fourier transform ion cyclotron resonantie (FTICR) massaspectrometrie platform voorzien van een 15 tesla magneet. Hiermee werden peptiden zichtbaar gemaakt tot Da. In hoofdstuk 6 wordt, een high-throughput, snel en volledig geautomatiseerde profilerings-workflow beschreven als een robuuste aanpak voor het verkrijgen van biomarkers. Dit hoog-resolutie platform werd toegepast op serummonsters die waren verkregen van alvleesklierkankerpatiënten en controle individuen. Hiermee werd een discriminerend profiel gevonden dat qua sensitiviteit en specificiteit vergelijkbaar was met eerder gerapporteerde resultaten. De hoge resolutie van de data vereenvoudigde de interpretatie en evaluatie van het gegenereerde profiel. Tevens maakte deze verfijnde methode een meer gedetailleerde

10 Nederlandse samenvatting 157 beschrijving mogelijk van de high-abundant eiwitten, waardoor 34 nieuwe peptiden in deze profielen geïdentificeerd konden worden. Alvleesklierkanker screening met behulp van serum eiwit profielen: toekomstige stappen De resultaten van de eerder beschreven profileringsstudies op alvleesklierkanker in combinatie met de resultaten van de studies in dit proefschrift zijn veelbelovend. Wat is nog nodig voor de verdere vertaling en mogelijke klinische uitvoering van het discriminerende profiel? De eerstvolgende stap is het valideren van de profielen op patiënten met een inflammatoire aandoening zoals pancreatitis. Pancreatitis kan alvleesklierkanker klinisch nabootsen op beeldvormende technieken zoals de CT-scan met als gevolg dat nauwkeurige pre-operatieve diagnose lastiger is. Bovendien bleken de tot dusver geïdentificeerde peptiden onderdelen van eiwitten die verband houden met de stollingscascade of de immunologische acute fase cascade. Dit kan mogelijk verklaard worden doordat de geïdentificeerde eiwitten afkomstig zijn van de pancreatitis die aanwezig is rondom een groeiend alvleesklierkankerproces. Verder is bekend dat de gebruikte profileringsmethode voornamelijk resulteert in de detectie van high-abundant eiwitten en hun proteolytische fragmenten. Mogelijk zal uitbreiding van de fractioneringstechnieken meer informatie opleveren over low-abundant peptiden en eiwitten. Een betrouwbare vergelijking van alvleesklierkanker markers vereist het gebruik van een groot aantal pancreatitis controles waarvoor momenteel monsters verzameld worden. Al in 2009 vergeleken Liu en collega s alvleesklierkanker patiënten met patiënten met een goedaardige ziekte van de pancreas. Ze konden onderscheid maken tussen deze groepen met een sensitiviteit van 90% en een specificiteit van 80%. In 2010 gebruikte een onderzoeksgroep uit Spanje geïmmobiliseerde koper ion chromatografie met MALDI om een profiel samen te stellen uit het serum van alvleesklierkanker -patiënten, gezonde controlepersonen en patiënten met pancreatitis. 7 Door de lage incidentie van alvleesklierkanker zal het screenen van een totale populatie niet kosteneffectief zijn. Individuen met een verhoogd risico op het ontwikkelen van alvleesklierkanker kunnen echter profiteren van een zeer sensitieve en specifieke serum biomarker. In hoofdstuk 5 wordt aangetoond dat alle patiënten met een hoog risico alvleesklierkanker correct werden geclassificeerd met ons RPC18 peptideprofiel. Op dit moment is het discriminerende profiel nog niet gevalideerd voor deze groep patiënten, maar het verzamelen van het serum tijdens huidige screening met MRI van deze hoog risico groep is opgestart. Het laatste decennium is aangetoond dat op massaspectrometrie gebaseerde serumeiwit en -peptide profielen klinisch nuttig zijn voor patiënten met alvleesklierkanker. In

11 158 Chapter 8 onze studies is ook de nadruk gelegd op het openen van de black-box. Hierbij werden verschillende nieuwe onderscheidende peptiden geïdentificeerd. De vingerafdruk methoden beschreven in dit proefschrift maken detectie van high-abundant eiwitten en hun proteolytische fragmenten zoals fibrinopeptide en apolipoproteïne mogelijk. Er wordt verondersteld dat andere meer ziekte specifieke biomarkers aanwezig zijn in de low-abundance range. Identificatie van peptiden en eiwitten bij zeer lage concentraties is wellicht mogelijk door uitbreiding of het combineren van fractioneringstechnieken. Verder kan een goed uitgerust geautomatiseerd platform met een 15 tesla magneet (FTICR) massaspectrometrie een uitgangswaarde zijn om een analytische robuustheid te creeëren die noodzakelijk is bij klinische toepassing. Concluderend zijn er al verschillende verbeteringen doorgevoerd waardoor klinische proteomics groeit van een embryonale fase naar de kinderschoenen. In dit proefschrift is geprobeerd een beschrijving te geven van de hindernissen die overwonnen moeten worden om de vertaling van klinische proteomics van bench to bedside te maken.

12

13