Activity-based probes for retaining -glucosidases: Novel tools for research and diagnostics Kallemeijn, Wouter

Transcriptie

1 UvA-DARE (Digital Academic Repository) Activity-based probes for retaining -glucosidases: Novel tools for research and diagnostics Kallemeijn, Wouter Link to publication Citation for published version (APA): Kallemeijn, W. W. (2014). Activity-based probes for retaining -glucosidases: Novel tools for research and diagnostics General rights It is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of the author(s) and/or copyright holder(s), other than for strictly personal, individual use, unless the work is under an open content license (like Creative Commons). Disclaimer/Complaints regulations If you believe that digital publication of certain material infringes any of your rights or (privacy) interests, please let the Library know, stating your reasons. In case of a legitimate complaint, the Library will make the material inaccessible and/or remove it from the website. Please send a message to: UBAcoach or a letter to: Library of the University of Amsterdam, Secretariat, Singel 425, 1012 WP Amsterdam, The Netherlands. You will be contacted as soon as possible. UvA-DARE is a service provided by the library of the University of Amsterdam ( Download date: 07 jan. 2017

2 De lysosomale glycosylhydrolase glucocerebrosidase (GBA) catalyseert de hydrolytische afbraak van glucosylceramide, een van de eenvoudigste glycosfingolipiden. Deficiëntie van GBA veroorzaakt stapeling van glucosylceramide in met name de lysosomen van macrofagen, wat leidt tot de ziekte van Gaucher. Het spectrum en de severiteit van ziektesymptomen is opvallend variabel tussen Gaucher patiënten, en er is zelfs heterogeniteit tussen identieke tweelingen gerapporteerd. Bovendien is de correlatie tussen de ernst van de ziekte en de in vitro GBA activiteit zwak, wat duidt op aanwezigheid van aanvullende factoren die de in situ activiteit van GBA beïnvloeden. Geregistreerde behandelingen voor de ziekte van Gaucher zijn enzym supplementatie therapie, door middel van exogeen recombinant GBA, en substraat reductie therapie via remmers voor het glucosylceramide synthase enzym. Onlangs heeft het gebruik van competitieve remmers, die als chaperones de vouwing en stabiliteit van mutant GBA in situ zouden kunnen stabiliseren, grote aandacht gekregen. Het onderzoek beschreven in dit proefschrift richt zich op het gebrek aan geschikte methoden om (actieve) GBA-moleculen in situ te visualiseren, aangezien dit een cruciale factor is voor fundamenteel onderzoek naar GBA, de ziekte van Gaucher, de hieruit vloeiende ontwikkeling van nieuwe behandelingen zoals chaperone therapie, maar ook het creeëren van een technologische basis voor soortgelijke methoden voor aanverwante enzymen en de daarbij geassocieerde ziekten. Na de General introduction, geeft Introduction, part I een literatuuroverzicht van de verschillende typen van activity-based probes (ABPs) ontwikkeld voor glycosylhydrolases, met als focus de glycosidases die glycosfingolipiden cataboliseren. Introduction, part II geeft een overzicht van de literatuur over de ziekte van Gaucher en Fabry, met het accent op de diagnose, biomarkers en behandeling. Chapter 1 beschrijft het ontwerp, de ontwikkeling en karakterisatie van activity-based probes (ABPs) die zeer selectief aan GBA binden. Als kern van de ABPs is cyclophellitol β- epoxide gebruikt, een honderd-maal krachtiger remmer dan conduritol β-epoxide, een klassieke GBA-remmer. Door een groen of rood fluorescerende BODIPY-groep via een spacer aan de cyclitol-kern te verbinden, werden nog krachtiger, nu fluorescente, ABPs verkregen met affiniteiten voor GBA tot in de lage nanomolairen. Om permanent te kunnen binden, gebruiken de ABPs het katalytische retaining twee-staps mechanisme van GBA, dat gekarakteriseerd wordt door de tijdelijke vorming van een covalent glycosylenzym intermediair tijdens de reactie. Na enzym-gemedieerde protonering van de β- epoxide in de ABP door het zuur/base residu E235 en de aanval door nucleofiel E340, vormt zich juist een stabiele, covalente esterbinding van de ABP aan E340. Inherent aan de remming is de fluorescente labeling van GBA, wat ultra-gevoelige detectie mogelijk maakt 295

3 van enkele attomolen enzym via SDS-PAGE. In cel en weefsellysaten labelen de β-epoxide ABPs zeer specifiek aan GBA moleculen. De specificiteit van de β-epoxide ABPs maken het ook mogelijk actieve GBA-moleculen te visualiseren via fluorescence-activated cell-sorting, fluorescentie microscopie en pulse-chase experimenten in levende cellen en in intacte muizen. Hiernaast wordt het gebruik van fluorescerende β-epoxide ABPs geillustreerd door weefsels van Gaucher patienten ermee te onderzoeken, net als competitieve remmers en chaperones in levende cellen. Chapter 2 beschrijft de ontwikkeling van fluorescente, breed-spectrum cyclophellitol β- aziridine ABPs die de moleculaire architectuur van glucosylceramide nabootsen, waardoor niet alleen ultra-gevoelige visualisatie van GBA mogelijk is, maar ook die van nonlysosomal β-glucosidase GBA2 (gelinkt aan een neurologische aandoening en carcinogenese), cytosolisch β-glucosidase GBA3 en het intestinale lactase/phlorizin hydrolase (LPH; deficiëntie veroorzaakt lactose-intolerantie). De β-aziridine ABP bindt ook irreversibel aan de nucleofiel van GBA, maar is hierin niet afhankelijk van enzymgemedieerde protonering dankzij het elektrofiele karakter van de geacyleerde aziridine, dat resulteert in zeer snelle reactiesnelheid. Het complementaire gebruik van β-aziridine en β- epoxide ABPs wordt geillustreerd door middel van het labelen van cel en weefsellysaten, pulse-chase experimenten in intacte cellen en labeling in levende dieren. Chapter 3 beschrijft het ontwerp, de ontwikkeling en karakterisering van groen fluorescerende 2-deoxy-2-fluoro-D-glucosides met een scala aan verschillende aglyconen gebonden. Na de nucleofiele aanval en protonatie door de zuur/base wordt het ABPgebonden aglycon verdreven, waarop de geglycosyleerde nucleofiel semi-permanent gevangen is vanwege fluorine-geinduceerde destabilisering van de oxocarbenium ionachtige transitie structuur die benodigd is voor succesvolle deglycosylering. Het remmende vermogen van deze ABP-klasse werd drastisch verbeterd door de introductie van een N- fenyl-trifluoroacetimidate aglycon op het anomere centrum, wat imidate-β-2-deoxy-2- fluoro-d-glucoside opleverde. Chapter 4 rapporteert een nieuwe, generieke werkwijze voor een gemakkelijke en gevoelige identificatie van de zuur/base en nucleofiel residuen die benodigd zijn voor het katalytische twee-staps mechanisme van retaining β-glucosidases zoals GBA. Na specifieke mutagenese van residueen mogelijk betrokken bij het katalytische mechanisme, worden direct betrokken residuen geïdentificeerd door het redden van de reactie door middel van externe nucleofielen zoals natriumazide. Tenslotte worden de zuur/base en nucleofiel geïdentificeerd door labeling met ABPs aangezien de binding van β-aziridine ABPs aan de nucleofiel onafhankelijk is van de zuur/base, terwijl β-epoxide ABPs niet aan de nucleofiel kunnen binden in afwezigheid van het zuur/base residu. Een externe nucleofiel als natriumazide heft dit effect weer op. De methode werd gevalideerd door de identificatie van de katalytische zuur/base en de nucleofiel in GBA (E235/E340, respectievelijk), waarna het vervolgens is toegepast op de andere, niet-homologe β-glucosidases GBA3 (E165/E373), LPH (pocket III: E1065/E1273) en GBA2 (D677/E527). 296

4 Chapter 5 beschrijft het effecten van chemische chaperones en remmers op de stabiliteit van GBA, door het meten van de thermodynamische stabiliteit en analyses van wild-type en Gaucher (N370S en L444P) GBA-enzym in levende cellen. De competitieve remmer isofagomine, semi-permanente remmer imidaat-β-2-deoxy-2-fluoro-d-glucoside en permanente remmer β-epoxide ABP stabiliseren elk de vouwing van GBA in toenemende mate, met als resultaat een spectaculaire bescherming van GBA tegen proteolytische intralysosomale afbraak in wild-type en Gauchercellen. De chaperone isofagomine stabiliseerde GBA alleen bij concentraties ver boven de in situ IC 50, terwijl imidaat-β-2- deoxy-2-fluoro-d-glucoside zowel wild-type als Gaucher GBA stabiliseerde in combinatie met concentraties die compatibel zijn met enzymatische activiteit van GBA. Chapter 6 beschrijft het gebruik van groen en rood fluorescente β-epoxide ABPs voor de visualisatie van imiglucerase en velaglucerase, twee recombinante GBA-preparaten geregistreerd voor behandeling van de ziekte van Gaucher, voor een directe vergelijking tussen beide in vitro, in intacte cellen en levende muizen. Opname van ABP-gelabelde rgbas door dendritische cellen was vergelijkbaar, net als de biodistributie na equimolaire intraveneuze injectie in muizen. ABP-gelabelde rgbas waren vooral gelokaliseerd in de lever, witte bloedcellen, beenmerg en milt. Weefsels aangedaan in (zeer) ernstige typen van Gaucher, zoals de longen, brein en huid, bevatten weinig rgbas. Kleine maar significante verschillen zijn gevonden in de binding en opname van rgbas in gekweekte menselijke macrofagen in de afwezigheid en aanwezigheid van mannan. Mannan-geremde binding en opname was het grootst voor velaglucerase, wanneer bepaald met de rgbas apart of als equimolair mengsel van beide enzymen. Vice versa was de mannan-geremde binding en opname van imiglucerase groter. Dit effect verschilde tussen alle geteste donoren (n = 12), maar de trend was altijd overal aanwezig. Het proces van opname van recombinant GBA door gekweekte macrofagen wordt hoogstwaarschijnlijk gemedieerd door een combinatie van verschillende receptoren, inclusief meerdere mannose-lectines. Chapter 7 illustreert het gebruik van ABPs in vivo. Intraveneuze toediening van fluorescente β-epoxide ABPs in vivo maakt het mogelijk GBA in een concentratieafhankelijke mate te labelen. De β-aziridine ABPs bovendien labelen GBA2, GBA3 en LPH in een concentratie-afhankelijke mate. De enzymen werden krachtig geremd in alle geteste weefsels, behalve in de hersenen en de ogen. Met gebruik van rood fluorescente β-epoxide ABP werd de weefsel-specifieke halfwaardetijd van GBA gemeten, welke gemiddeld 24 tot 48 uur bedraagt. Aangezien β-epoxide ABPs specifiek GBA inactiveren, zou langdurige toediening van β-epoxide ABPs aan muizen de ziekte van Gaucher induceren, welke gekarakteriseerd wordt door deficiënte activiteit van GBA en lysosomale stapeling van glucosylceramide in macrofagen. Net als in de ziekte van Gaucher, laten muizen behandeld met GBA-specifieke β-epoxide een verstoring zien in het metabolisme van glucosylceramide, met als kenmerk een snelle toename van glucosylsfingosine, een metaboliet van glucosylceramide, maar ook de inductie van splenomegalie en verhoogde gen-expressie van gpnmb. 297

5 Chapter 8 beschrijft de toepassing van ABPs om een bacterieel β-glucosidase (Rhodococcus sp M-777 endoglycoceramidase II; EGCaseII) te labelen, welke is gefuseerd aan een eiwit van interesse, als een alternatief voor fusies met fluorescerende eiwitten (XFPs). De EGCaseII-tag kan worden gevisualiseerd met behulp van de gerapporteerde groene en rode BODIPY β-epoxide en β-aziridine ABPs, met een hogere gevoeligheid van detectie in vergelijking met XFPs. In zoogdiercellen kan de ABP-labeling van β-glucosidase effectief worden voorkomen door voorbehandeling met 10 μm conduritol β-epoxide, die de ABP-reactieve nucleofiel blokkeert van het endogene enzym, maar niet die van EGCaseII (nucleofiel E351). Recombinant eiwitten met EGCaseII-tag kunnen gemakkelijk gevisualiseerd worden in vitro of in levende cellen na de covalente binding met fluorescente, cel-permeabele ABPs. Als alternatief kan een EGCaseII-bevattend eiwit worden gedetecteerd via het unieke vermogen om 4MU-β-D-Lac te hydrolyseren in fluorescerend 4-methylumbelliferyl en lactose, wat een enzymatische activiteit is die ontbreekt in de meeste zoogdiercellen. In de General discussion and future prospects worden het ontwerp en de toepassing van activity-based probes voor retaining β-glucosidases bediscussieerd en worden verschillende mogelijke verbeteringen in de structuur van ABPs voorgesteld ter bevordering van de selectiviteit en affiniteit voor specifieke retaining β-glucosidases. Tevens wordt de ontwikkeling van ABPs voor andere retaining glycosidases besproken, met de hieruit vloeiende implicaties voor het wetenschappelijk onderzoek naar deze eiwitten alsmede de hiermee geassocieerde ziekten en toekomstige behandelmethoden. 298