Voorbeeld NEN norm. Preview. Melk en melkproducten Aantonen van coagulase-positieve staphylococcen met een vloeistofcultuur.

Transcriptie

1 Nederlandse norm Melk en melkproducten Aantonen van coagulase-positieve staphylococcen met een vloeistofcultuur NEN 6878 Milk and milk products Detection of coagulase positive staphylococci by liquid culture 1e druk, februari 1998 ICS Vervangt NEN 6878:1994 Ontw. Dit document mag slechts op een stand-alone PC worden geinstalleerd. Gebruik op een netwerk is alleen. toestaan als een aanvullende licentieovereenkomst voor netwerkgebruik met NEN is afgesloten. This document may only be used on a stand-alone PC. Use in a network is only permitted when a supplementary license agreement for us in a network with NEN has been concluded. 1 Onderwerp en toepassingsgebied Deze norm beschrijft een methode voor het aantonen van coagulase-positieve staphylococcen in melk en melkproducten door kweken in een selectief vloeibaar medium. Deze methode is vooral bestemd voor monsters waarin gehalten aan coagulase-positieve staphylococcen worden verwacht van 100 of minder per gram niet-vloeibaar of dik-vloeibaar product, of van 10 of minder per ml vloeibaar product. De groep van coagulase-positieve staphylococcen bestaat voornamelijk uit Staphylococcus aureus, maar ook een aantal andere zoals Staphylococcus intermedius en sommige stammen van Staphylococcus hyicus. EN 1. Voor algemene aanwijzingen voor microbiologisch onderzoek is een praktijkrichtlijn. 2. Voor in acht te nemen veiligheidsvoorschriften wordt verwezen naar de Aanbevelingen voor veilig microbiologisch werk. 2 Normatieve verwijzingen De volgende normen bevatten bepalingen die, doordat ernaar wordt verwezen, tevens bepalingen van deze norm zijn. Op het ogenblik van publicatie van de onderhavige norm waren de vermelde drukken van kracht. Alle normen kunnen echter worden herzien; partijen die overeenkomsten sluiten op basis van deze norm wordt daarom aanbevolen na te gaan of het mogelijk is, de meest recente druk van de onderstaande normen toe te passen. NEN 955: 1992 Melk en melkproducten. Aantonen van bacteriën van de coligroep en bepaling van het gehalte aan bacteriën van de coligroep met behulp van een vloeistofcultuur. NEN 6872:1985 Melk en melkproducten. Voorbehandeling van het monster en bereiding van verdunningen voor microbiologisch onderzoek. 3 Term en definitie coagulase-positieve staphylococcen: Micro-organismen, die zich bij toepassing van de beschreven werkwijze in een selectief vloeibaar voedingsmedium kunnen vermeerderen onder vorming van een zwart neerslag en bij overenten op een selectief medium kenmerkende kolonies vormen, zoals omschreven in deze norm. 4 Beginsel Eén of meer hoeveelheden analysemonster of verdunningen ervan worden geënt in een selectief vloeibaar voedingsmedium (Giolitti Cantoni bouillon). Vorming van een zwart neerslag in dit medium wijst op de mogelijke aanwezigheid van coagulase-positieve staphylococcen. Vervolgens wordt afgestreken op een selectief vast voedingsmedium (Baird Parker- of RPF-medium). Coagulase positieve staphylococcen geven op Baird Parker medium kenmerkende kolonies die vervolgens met de coagulasetoest worden bevestigd. Coagulase positieve staphylococcen vormen op RPF-medium kolonies met een positieve coagulasereactie. 5 Voedingsmedia en verdunningsvloeistoffen 5.1 Algemeen Gebruik materialen die voldoende zuiver zijn. Gebruik gedestilleerd of op andere wijze gedemineraliseerd water. Het water mag geen voor micro-organismen giftige bestanddelen bevatten. Voor een goede reproduceerbaarheid van de resultaten verdient het aanbeveling uit te gaan van in de handel verkrijgbare droge ingredinnten of geschikt bevonden droge voedingsmedia. De instructies van de fabrikant voor de bereiding moeten nauwgezet worden gevolgd. Gebruik voor de meting van de ph een ph-meter; referentietemperatuur 25 C. Indien het voedingsmedium niet direct wordt gebruikt, moet dit in het donker tussen 0 C en 5 C worden bewaard en onder omstandigheden waarbij geen veranderingen in de samenstelling optreden. Bewaar het voedingsmedium niet langer dan een maand, tenzij elders in deze norm anders wordt aangegeven. 5.2 Ophopingsvloeistof Basismedium Samenstelling Dubbele trypton vleesextract gistextract natriumpyruvaat glycine lithiumchloride (LiCI) natriumchloride (NaCI) mannitol Tween 80 water 6,0 g 2,4 g 40,0 g 2,0 g 1000 ml Enkele 3,0 g 1,2 g 1,0 g 1000 ml 1998 Nederlands Normalisatie-instituut Kalfjeslaan 2, Postbus 5059, 2600 GB Delft, Telefoon (015) , Fax (015)

2 Blz. 2 In de handel is het basismedium zonder de Tween 80 onder de naam Giolitti Cantoni bouillon verkrijgbaar. Van het handelsproduct moet voor het basismedium op dubbele de dubbele hoeveelheid van die vermeld op de verpakking worden afgewogen Bereiding Los de ingrediënten onder verwarming op in het water. Stel de ph zo in dat deze na sterilisatie 6,9 0,2 bedraagt bij 25 C. Verdeel het basismedium met dubbele in hoeveelheden van 10 ml in buizen van ca. 20 mm 200 mm. Verdeel het basismedium met enkelvoudige in hoeveelheden van 9 ml in buizen van ca. 16 mm 160 mm. Steriliseer gedurende 15 min bij (121 1) C. Bewaar het medium bij 0 C tot 5 C ten hoogste 14 dagen Kaliumtellurietoplossing Samenstelling kaliumtelluriet (K 2 TeO 3 ) 0,5 g water 100 ml Bereiding Los het kaliumtelluriet op in het water en steriliseer door filtratie. Bewaar de oplossing bij 0 C tot 5 C Bereiding ophopingsvloeistof Samenstelling Dubbele Enkele basismedium (5.2.1) 10,0 ml 9 ml kaliumtellurietoplossing (5.2.2) 0,2 ml 0,1 ml Bereiding Verhit kort voor gebruik het aantal benodigde buizen met basismedium (5.2.1) gedurende 15 min in een waterbad met kokend water. Koel direct af tot ca. 45 C en voeg per buis 0,1 ml kaliumtellurietoplossing (5.2.2) toe aan het basismedium van enkele en per buis 0,2 ml aan het basismedium van dubbele. Het medium wordt kort voor verbruik verhit om zoveel mogelijk het aanwezige zuurstof uit het medium te verdrijven, ter bevordering van de anaerobe omstandigheden tijdens de incubatie. Door het medium af te koelen tot ca. 45 C wordt na het mengen met het monster, of een verdunning hiervan, de vereiste incubatie temperatuur reeds benaderd. 5.3 Agaroplossing Samenstelling agar Bereiding Los de agar op in het water. Verdeel in hoeveelheden van 100 ml en steriliseer gedurende 15 min bij (121 1) C. 5.4 Isolatiemedium Basismedium Samenstelling trypton vleesextract gistextract 1,0 g natriumpyruvaat glycine 12,0 g lithiumchloride (LiCl) agar In de handel is het basismedium verkrijgbaar onder de naam Baird Parker medium Bereiding Los de ingredinnten onder verwarming op in het water. Stel de ph zo in dat deze na sterilisatie 7,2 0,1 bedraagt bij 25 C. Breng het medium in hoeveelheden van 100 ml in kolfjes en steriliseer gedurende 15 min bij (121 1) C Eidooier-emulsie Gebruik voor de eidooier-emulsie bij voorkeur een in de handel in steriele vorm verkrijgbaar gestandaardiseerd preparaat met ca. 20 % dooier. Mocht dit niet mogelijk zijn, ga dan als volgt te werk. Reinig verse kippeneieren met lauwwarm water en zeep en desinfecteer daarna grondig met ethanol 70 % (V/V). Breek de eieren en neem de dooiers apart, alles uiteraard op aseptische wijze. Meng de dooiers grondig met vier maal hun volume steriel water. Verwarm dit mengsel gedurende 2 h in een waterbad van 45 C en laat 18 h tot 24 h bezinken bij ca. 4 C. Giet de bovenstaande vloeistof af en steriliseer deze door filtratie indien voor infectie wordt gevreesd. De emulsie kan tot 72 h bij ca. 4 C worden bewaard. Controleer het aldus bereide preparaat op groeiremming, steriliteit en bruikbaarheid voor de specifieke reactie in het gerede medium Bereiding volledig voedingsmedium Voeg per 95 ml van het tot ca. 45 C afgekoelde basismedium (5.4.1) toe: 1 ml tellurietoplossing (5.2.2) 5 ml eidooier-emulsie (5.4.2) Plaats de toe te voegen oplossingen ca. 5 min. van te voren in het waterbad van 45 C. Meng de toevoegingen met het basismedium door zwenken en giet onmiddellijk daarna uit in petrischalen met een middellijn van 9 cm. Laat stollen. Droog de platen voor gebruik totdat ze voldoende droog zijn bijvoorbeeld met een broedstoof van 55 C of met de steriele luchtstroom in een veiligheidswerkkast. Bereid het medium steeds vers voor gebruik. Naast eidooierpreparaat (egg yolk emulsion) is ook een gecombineerde telluriet-eidooier-emulsie in de handel verkrijgbaar. 5.5 Isolatiemedium Basismedium De samenstelling en bereiding is beschreven in Bovinefibrinogeen-oplossing Samenstelling bovinefibrinogeen steriel water 100 ml Bereiding Los het bovinefibrinogeen op aseptische wijze in 30 s op in het water met het suspendeertoestel (6.4). Breng het mengsel over in een steriele kolf van 250 ml en laat het daarin 1 h tot 2 h staan bij kamertemperatuur. Pipetteer de benodigde hoeveelheid op aseptische wijze onder uit de kolf. Bereid de oplossing zo kort mogelijk voor gebruik Oplossing van coagulaseplasma en trypsine-inhibitor Samenstelling coagulaseplasma van konijnen, met EDTA gestabiliseerd (zie ook onder 5.7) 30 ml trypsine-inhibitor 30 mg

3 Blz. 3 Coagulaseplasma correpondeert met gevriesdroogd coagulaseplasma EDTA, gereconstitueerd in 30 ml steriel water. Weeg niet minder dan ca. 30 mg trypsine-inhibitor af om een te grote afweegfout te voorkomen Bereiding Los het coagulaseplasma en de trypsine-inhibitor zo kort mogelijk voor gebruik op aseptische wijze op in steriel water Kaliumtellurietoplossing De samenstelling en bereiding is beschreven in Volledig voedingsmedium Samenstelling basismedium (5.5.1) 90 ml bovinefibrinogeenoplossing (5.5.2) 7,5 ml oplossing van coagulaseplasma en trypsine-inhibitor (5.5.3) 2,5 ml kaliumtellurietoplossing (5.5.4 resp ) 0,25 ml Bereiding Smelt op de dag van gebruik het basismedium. Koel het af tot 45 C. Voeg vervolgens per 90 ml basismedium toe: 7,5 ml oplossing 5.5.2, 2,5 ml oplossing en 0,25 ml oplossing Plaats de toe te voegen oplossingen ca. 5 min van te voren in het waterbad van 45 C. Meng bij elke toevoeging door zwenken en giet onmiddellijk daarna uit in petrieschalen met een middellijn van 9 cm. Laat stollen en drogen (zie 5.4.3) alvorens de voedingsbodem te gebruiken. Gebruik het voedingsmedium binnen 4 h na bereiding. In plaats van de oplossingen t.m mag gebruik worden gemaakt van een in de handel verkrijgbaar mengsel dat de genoemde ingrediënten in steriele gedroogde vorm bevat. Volg in dat geval voor de bereiding van het volledige voedingsmedium de instructies van de leverancier. 5.6 BHI-medium Samenstelling pepton 10 g gedroogd aftreksel van kalfshersenen 12,5 g gedroogd aftreksel van runderhart glucose 2,0 g natriumchloride (NaCl) dinatriumwaterstoforthofosfaat (Na 2 HPO 4 ) 2,5 g Bereiding Los de ingrediënten onder verwarming op in het water. Stel de ph zo in dat deze na sterilisatie 7,4 0,1 bedraagt bij 25 C. Breng het medium in hoeveelheden van 10 ml in buisjes en steriliseer gedurende 15 min bij (121 1) C. 5.7 Coagulaseplasma-oplossing Gebruik bij voorkeur het in de handel verkrijgbare lyofiel gedroogde coagulaseplasma. Gebruik geen citraatbevattend plasma omdat eventuele citraat-aantastende nietstaphylococcen hiermee vals-positieve reacties kunnen geven. Pipetteer de op de verpakking voorgeschreven hoeveelheid steriel water in de ampul met het lyofiel gedroogde coagulase-plasma. Los op door schudden. Indien nog geen EDTA aanwezig is, voeg dan EDTA toe om een concentratie van 0,1 % EDTA te verkrijgen in het gevriesdroogde plasma. Het gereconstitueerde plasma moet dezelfde dag worden gebruikt. 5.8 Verdunningsvloeistof Zie voor de samenstelling en de bereiding van verdunningsvloeistoffen NEN Zie ook hoofdstuk 8. 6 Toestellen, glaswerk en hulpmiddelen Gebruikelijke toestellen en steriel glaswerk voor microbiologisch laboratoria en in het bijzonder de onderstaande. Gesteriliseerde materialen voor éénmalig gebruik mogen worden toegepast. 6.1 Petrischalen met een middellijn van ca. 9 cm. 6.2 Cultuurbuizen met inwendige afmetingen van ca. 16 mm 160 mm en met inwendige afmetingen van ca. 20 mm 200 mm en eventueel kolven. 6.3 Broedstoof voor het bebroeden bij (37 1) C. 6.4 Suspendeertoestel, Stomacher. 6.5 Waterbad ingesteld op (45 1) C. 6.6 Entoog van platina-iridium, nikkel-chroom of kunststof. 6.7 Agglutinatiebuisjes met een ronde bodem en afmetingen van ca. 10 mm 75 mm. 7 Voorbehandeling van het monster Behandel het monster voor volgens NEN Werkwijze Zie voor de monsterneming NEN-EN-ISO Keuze van de voorwaarden bij een grensreactie Hou bij het kiezen van het veelvoud waarmee een hoeveelheid analysemonster of een decimale verdunning wordt onderzocht, rekening met de aanwijzigingen in NEN Bereiding van verdunningen Bereid verdunningen volgens NEN Ophoping Pipetteer in een buis met 10 ml ophopingsvloeistof van dubbele (5.2.3) 10 ml van het monster of de eerste decimale verdunning ervan. Pipetteer in een buis met 9 ml ophopingsvloeistof van enkelvoudige sterkste (5.2.3) 1 ml van het monster of decimale verdunning ervan. Breng in iedere buis een laag agaroplossing (5.3) met een hoogte van ongeveer 2 cm en laat stollen. Bebroed de buizen gedurende (24 2) h in de broedstoof bij (37 1) C. Bebroed de buizen waarin zich na 24 h geen zwarting voordoet nogmaals (24 2) h bij (37 1) C. 8.4 Isolatie Algemeen Breng van iedere buis waarin zich binnen 48 h een vorm van zwarting voordoet, een druppel cultuur onder uit de buis over op een plaat met isolatiemedium 1 (5.4) of isolatiemedium 2 (5.5).

4 Blz. 4 De te onderzoeken vloeistof kan het beste toegankelijk worden gemaakt door de deklaag aan de zijde van de glaswand te doorsteken met een in de vlam verhitte corrosievaste staaf met een middellijn van enkele millimeter. Houd daarbij de buis scheef en doorsteek op het hoogste punt zodat het gedeeltelijk gesmolten deklaagmateriaal de ontstane opening zo weinig mogelijk blokkeert. Neem de vloeistof af met een pipet met nauwe uitmonding, bijv. een pasteurpipet. Sluit zo nodig de vloeistof daarna opnieuw van de lucht af. Strijk met een entoog (6.6) zo uit dat losliggende kolonies kunnen worden verkregen. Bebroed de platen gedurende (27 3) h in de broedstoof bij (37 1) C. Beoordeel de zich op het isolatiemedium ontwikkelde kolonies Beoordeling kolonies op isolatiemedium 1 (Baird Parker) Kolonies, karakterisiek voor coagulase-positieve staphylococcen op isolatiemedium 1 zijn rond, glanzend, bol, regelmatig begrensd, gitzwart van kleur en met een heldere hof. Binnen deze hof kan zich een kleinere doffe hof bevinden. Deze kolonies moeten aan een bevestigingsreactie (8.5) worden onderworpen. Niet-karakteristieke kolonies welke wel tot de coagulasepositieve staphylococcen kunnen behoren, moeten ook aan de bevestigingsreactie (8.5) worden onderworpen. Deze kolonies zijn: a) zwart, glanzend zonder (heldere) hof of met een nauwelijks zichtbare hof. b) minder zwart dan a) met een ruwe, droge structuur. Incubeer, indien geen kenmerkende kolonies worden gevonden, de platen nogmaals 24 h. Selecteer van het isolatiemedium 1, drie karakteristieke en niet-karakteristieke kolonies van elke plaat en bevestig deze kolonies (8.5) Beoordeling kolonies op isolatiemedium 2 (RPF) Kolonies van coagulase-positieve staphylcoccen op isolatiemedium 2 zijn glanzend, bol, wit-grijs tot zwart van kleur en omgeven door een hof met witte neerslag. De hof met witte neerslag wordt veroorzaakt door de coagulasereactie. Het is daarom niet nodig om deze kolonies op isolatiemedium 2 aan de bevestigingsreactie (8.5) te onderwerpen. Incubeer, indien geen karakteristieke kolonies worden gevonden, de platen nogmaals 24 h. 8.5 Bevestigingsreactie op coagulase Ent de te onderzoeken kolonies over in BHI-buizen (5.6). Bebroed gedurende 20 h tot 24 h in de broedstoof bij (37 1) C. Pipetteer porties van 0,3 ml van de coagualseplasmaoplossing (5.7) in steriele agglutinatiebuisjes (6.7). Voeg vervolgens van elke verkregen BHI-cultuur 0,1 ml toe. Plaats de buisjes in de broedstoof bij (37 1) C. Controleer de buisjes na 6 h bebroeden. De coagulasereactie wordt als positief beschouwd indien in het buisje een grote samenhangende klomp stolsel is onstaan die de vloeistof grotendeels of geheel vult. Bij kleinere hoeveelheden stolsel (minder dan de helft van de vloeistof vullend) wordt de reactie als negatief beschouwd. Verricht de reactie ook steeds met twee controlestammen, een met een positieve reactie (S.aureus) en een met een negatieve reactie (bijv. een Micrococcus). 9 Beoordeling en weergave 9.1 Beoordeling Beoordeel de buizen waarin na ophoping volgens 8.3 wel zwarting heeft plaatsgevonden en waaruit coagulasepositieve kolonies konden worden geïsoleerd die voldeden aan de in 8.4 beschreven kenmerken als positief. 9.2 Weergave van het resultaat Geef aan welke hoeveelheid product is onderzocht, in welk veelvoud dat is gebeurd en hoeveel malen een positief resultaat werd verkregen. 10 Precisie Prestatiekenmerken zijn vooralsnog niet voor handen. 11 Verslag Vermeld in het verslag: de gevolgde methode door de vermelding: volgens NEN 6878; de gegevens die noodzakelijk zijn voor de identificatie van het monster; de gevolgde methode van monsterneming, indien bekend; het resultaat volgens hoofdstuk 8; eventuele bijzonderheden die tijdens de bepaling zijn waargenomen die het resultaat kunnen hebben beïnvloed. 12 Literatuur ICMSF Methods Studies. XV. Comparison of four media and methods for enumerating Staphylococcus aureus in powdered milk. A. Chopin, S. Malcolm, G. Jarvis, H. Asperger, H.J. Beckers, A.M. Bertona, C. Cominazzini, S. Carini, R. Lodi, G. Hahn, W. Heeschen, J.A. Jans, D.I. Jervis, J.M. Lanier, F. O Conner, M. Rea, J. Rossi, R. Seligmann, S. Tesone, G. Waes, G. Mocquot and H. Pivnick; J. Food Protection, 48, 1985,

5 Bestelformulier Stuur naar: NEN Uitgeverij t.a.v. afdeling Marketing Antwoordnummer WB Delft Ja, ik bestel NEN Uitgeverij Postbus GB Delft Vlinderweg AX Delft T (015) F (015) ex. nl Melk en melkproducten - Bepaling van coagulasepositieve <em>staphylococcen</em> met een vloeistofcultuur Wilt u deze norm in PDF-formaat? Deze bestelt u eenvoudig via Stel uw vraag aan Klantenservice Gratis nieuwsbrieven Wilt u op de hoogte blijven van de laatste ontwikkelingen op het gebied van normen, normalisatie en regelgeving? Neem dan een gratis abonnement op een van onze nieuwsbrieven. Gegevens Bedrijf / Instelling T.a.v. O M O V Klantnummer NEN Uw ordernummer BTW nummer Postbus / Adres Postcode Plaats Telefoon Fax Factuuradres (indien dit afwijkt van bovenstaand adres) Postbus / Adres Postcode Plaats Datum Handtekening Retourneren Fax: (015) marketing@nen.nl Post: NEN Uitgeverij, t.a.v. afdeling Marketing Antwoordnummer 10214, 2600 WB Delft (geen postzegel nodig). Voorwaarden De prijzen zijn geldig tot 31 december 2015, tenzij anders aangegeven. Alle prijzen zijn excl. btw, verzend- en handelingskosten en onder voorbehoud bij o.m. ISO- en IEC-normen. Bestelt u via de normshop een pdf, dan betaalt u geen handeling en verzendkosten. Meer informatie: telefoon (015) , dagelijks van 8.30 tot uur. Wijzigingen en typefouten in teksten en prijsinformatie voorbehouden. U kunt onze algemene voorwaarden terugvinden op: Normalisatie: de wereld op één lijn. preview