Cover Page. The handle holds various files of this Leiden University dissertation.

Maat: px

Weergave met pagina beginnen:

Download "Cover Page. The handle holds various files of this Leiden University dissertation."

Andreas de Wilde
4 jaren geleden
Aantal bezoeken:

Cover Page The handle http://hdl.handle.net/1887/20326 holds various files of this Leiden University dissertation.

1 Cover Page The handle holds various files of this Leiden University dissertation. Author: Somireddy Venkata, Bharat Kumar Reddy Title: Dynamics of protein-protein interactions studied by paramagnetic NMR spectroscopy Date:

2 Eiwit-eiwit interacties spelen een belangrijke rol in alle cellulaire processen zoals signaaltransductie, elektronentransport, genregulatie, transcriptie en translatie. Het begrijpen van deze eiwit-eiwit interacties op moleculair niveau is daarom een belangrijk doel in de structuurbiologie. De eiwitinteracties die bestudeerd zijn in dit werk, zijn voornamelijk betrokken bij signaaltransductie en elektronentransport. Deze eiwitinteracties behoren tot de familie van kortlevende dynamische interacties, waarmee wordt bedoeld dat ze snel associëren en dissociëren. De dissociatieconstanten van dergelijke eiwit-eiwit interacties bevinden zich in de micromolaire orde van grootte. De interactie tussen focal adhesion kinase en de Src homologie domeinen spelen een belangrijke rol in cellulaire processen als cel verankering, cel motiliteit, celdifferentiatie, proliferatie en overleving. Deze eiwitten worden modulaire eiwitten genoemd omdat ze bestaan uit verschillende domeinen die als kralen aan een ketting aan elkaar zitten. De individuele domeinen van deze eiwitten kunnen separaat van elkaar gekloneerd worden en in vivo gekarakteriseerd. Het werk wat in hoofdstukken twee en drie wordt gepresenteerd, geeft een gedetailleerde beschrijving van een studie om de bindingsoriëntatie vast te stellen van een peptide, wat van focal adhesion kinase is afgeleid, aan het Src SH3 domein. Het is welbekend dat het SH3 domein een wijde variëteit aan peptiden herkend, waarvan de meeste een PxxP motief bevatten, maar sommige peptiden ontbreekt het aan zo n motief. Gebaseerd op de oriëntatie van hoe het peptide bindt, zijn de SH3 bindende peptiden ingedeeld in twee klassen. Waar de peptiden die in N-C oriëntatie binden tot klasse 1 behoren, behoren de peptiden die binden in C-N oriëntatie tot klasse 2. Wij hebben hier de hypothese getoetst dat een van FAK afgeleid peptide in beide oriëntaties kan binden, maar dat wel doet in verschillende populaties. Voor dit doel hebben we paramagnetische NMR spectroscopie toegepast. Daartoe zijn er met behulp van mutaties in het SH3 domein op verscheidene posities cysteine residuen aangebracht, waar vervolgens paramagnetische labels aan zijn gebonden. Met behulp van de paramagnetische relaxatie versterkingen (PRVs) van de nuclei van het eiwit kon de positie van het paramagnetisch centrum worden bepaald en 145

3 met behulp van de PRVs van het peptide, kon de positie van het peptide op het eiwit worden bepaald. De experimenteel bepaalde afstanden werden vergeleken met de gewogen gemiddelden van de afstanden van combinaties van de N-C en C-N oriëntaties van het peptide. We hebben daarbij overtuigend bewijs gevonden dat het peptide in twee oriëntaties aan het SH3 domein bindt, waarbij 80% van het peptide in de N-C oriëntatie bindt en 20% in de C-N oriëntatie. Deze resultaten plaatsen vraagtekens bij het classificeren van de SH3 bindende eiwitten. Het onderscheid in klassen gebaseerd op de bindingsoriëntatie kan simpelweg een gevolg zijn van de statische aard van de voor handen zijnde kristal en NMR structuren. Het zou erg interessant zijn om in plaats van op peptide niveau, op eiwit niveau te verifiëren dat FAK inderdaad in twee oriëntaties aan een SH3 domein kan binden. Het werk dat beschreven is in hoofdstuk vier, geeft een gedetailleerde beschrijving van het kloneren, tot expressie brengen en het zuiveren van het focal adhesion kinase domein met daar aan vast de SH3 en SH2 bindingssequenties (32k), gebruik makend van een baculovirus expressie systeem. Verscheidene 32k constructen werden geproduceerd om de zuivering te verbeteren. Western blotting experimenten zijn uitgevoerd, waarbij gebruik is gemaakt van anti-his en anti-py397 antilichamen om de activiteit van de constructen vast te stellen. Door middel van TROSY-HSQC experimenten zijn de NMR karakteristieken van de complexen van de Src domeinen bepaald. Met behulp van analyse van de veranderingen van de chemische verschuiving, kon worden vastgesteld dat het Src SH3 domein bindt aan het kinase domein in het linker gebied op dezelfde wijze zoals het van FAK afgeleide peptide. De binding projecties van het SH3 domein aan het van FAK afgeleide peptide aan 32k waren verbazingwekkend gelijkend. Maar, NMR studies aan Src SH2 en 32k lieten zien dat binding van 32k aan het SH2 domein verwaarloosbaar is, in tegenstelling tot het gedrag van het van FAK afgeleide peptide welke een SH2 bindingsmotief bevat. Dit suggereert dat het SH2 bindingsmotief, die bestaat uit het py397 residu in het 32k construct, niet beschikbaar is voor het Src SH2 domein. Deze resultaten roepen de vraag op hoe het kan dat het SH3 domein zijn bindingsmotief op 32k wel kan vinden, terwijl het Sh2 domein dat niet kan. Een mogelijke verklaring zou een intra-domein interactie van 32k kunnen zijn, aangezien er een afstand van 22 residuen is 146

4 tussen het SH3 en het SH2 bindingsmotief. Het zou buitengewoon interessant zijn om het Src SH3SH2 construct te combineren en de interactie hiervan met 32k te testen. Dit zou kunnen helpen, niet alleen om de bindingsmodus te identificeren, maar ook om licht te schijnen op de initiatie van de formatie van het complex tussen FAK en Src. Het werk gepresenteerd in hoofdstukken vijf en zes beschrijft de NMR karakterisatie van de interacties tussen verscheidene redox-eiwitten. Het doel van dit werk was om kortlevende eiwitcomplexen te converteren naar specifieke complexen. Hiervoor hebben we het complex tussen gist en paarden cytochroom c met paarden myoglobine (Mb) bestudeerd in hoofdstuk vijf en het cytochroom b 5 /Mb complex in hoofdstuk zes. De 15 N, 1 H HSQC experimenten met wt Cc en Mb lieten zien dat binding verwaarloosbaar is en dat de dissociatieconstanten in de orde van grootte van 10 mm of meer liggen. Gebruik makend van de resultaten van Brownse dynamica simulaties, konden drie positief geladen residuen van Mb worden geselecteerd en gemuteerd naar negatief geladen residuen. De binding van gemuteerd Mb aan Cc werd vervolgens getest om vast te stellen of de mutaties naar omgekeerde ladingen een invloed hadden op de binding van de twee eiwitten. De veranderingen in de chemische verschuivingen lieten duidelijk zien dat de eiwitten elkaar veel steviger bonden in vergelijking met de wt eiwitten. Door het plotten van de veranderingen in de chemische verschuivingen op het oppervlak van Cc, kon worden aangetoond dat de positief geladen residuen van Cc betrokken zijn bij de binding. In aanwezigheid van een hoge concentratie zout, werden de interacties sterk gereduceerd. Dit bevestigt de hypothese dat de eiwitten in eerste plaats via lading-lading interacties met elkaar binden. De dissociatieconstante afgeleid van een fit van de veranderingen van de chemische verschuivingen aan een 1:1 bindingsmodel was 22 µm. Maar, de veranderingen van de chemische verschuiving van sommige van de residuen, lieten een slechte fit zien in het 1:1 bindingsmodel, met name in hoog zout omstandigheden. Het modeleren met andere bindingsmodellen leverde geen betere fit, maar de locatie van deze residuen op het oppervlak van Cc suggereren de aanwezigheid van een extra bindingsplek voor Mb. 147

5 In hoofdstuk zes zijn vergelijkbare experimenten beschreven voor een ander complex van redox-eiwitten; cyt b 5 en Mb. De interactie tussen wt cyt b 5 /Mb is bestudeerd door Worrall et al. en de resultaten laten duidelijk zien dat de twee eiwitten een zeer dynamisch, kortlevend complex vormen, met een dissociatieconstante van 200 µm. Prof. Hoffman en zijn groep, pasten Brownse dynamica analyse toe op het eiwit complex en lieten zien dat de affiniteit van het complex verhoogd kan worden door mutaties waarmee ladingen van residuen worden omgekeerd. Drie negatief geladen residuen van Mb werden gemuteerd naar positief geladen residuen en de interactie tussen deze Mb mutant en cyt b 5 werd bestudeerd met NMR spectroscopie. In tegenstelling tot bij het wt cyt b 5 /Mb complex, waren bij het complex met de Mb mutant sterke veranderingen van de chemische verschuivingen zichtbaar, tot wel meer dan 20 keer sterker dan bij het wt complex. De veranderingen van de chemische verschuivingen werden gefit op een 1:1 bindingsmodel, wat een bindingsconstante van 63 µm opleverde. Het weergeven van de veranderingen van de chemische verschuivingen op het oppervlak van cyt b 5 liet zien dat de meeste van de residuen die betrokken zijn bij binding aan Mb gelokaliseerd zijn nabij de rand van de heem. De meeste van de residuen van cyt b 5 die betrokken zijn bij de interactie zijn negatief geladen en uit de resultaten van de Brownse dynamica analyse bleek duidelijk dat de positief geladen residuen van Mb betrokken zijn bij binding. Dit bevestigt het idee dat de interactie tussen cyt b 5 en Mb voornamelijk op oppervlakte ladingen gebaseerd is. Deze resultaten worden verder ondersteund door experimenten naar complex formatie in aanwezigheid van NaCl. De resulaten laten zien dat de interactie tussen cyt b 5 en Mb sterk gereduceerd is na toevoeging van 100 mm NaCl en zelfs volledig afwezig in aanwezigheid van 250 mm NaCl. Dit laat zien dat elektrostatische interacties een significante rol spelen in de vorming van eiwitcomplexen. De studies suggereren dat ieder zwak, kortlevend complex van redox-eiwitten omgevormd kan worden naar een specifiek complex, door gebruik te maken van Brownse dynamica analyse en het omkeren van oppervlakte ladingen met mutagenese. Desalniettemin, artificiële complexen zijn enkel gebaseerd op lading-lading interacties, terwijl natuurlijk voorkomende specifieke complexen, zoals het SH3/peptide complex, gestabiliseerd worden door een breed scala aan interacties, zoals waterstofbruggen, hydrofobe en elektrostatische interacties. 148

Vergelijkbare documenten

Cover Page. The handle http://hdl.handle.net/1887/26922 holds various files of this Leiden University dissertation

Cover Page. The handle http://hdl.handle.net/1887/26922 holds various files of this Leiden University dissertation Cover Page The handle http://hdl.handle.net/1887/26922 holds various files of this Leiden University dissertation Author: Shah, Dipen M. Title: NMR structural studies of protein-small molecule interactions