Cover Page. The handle holds various files of this Leiden University dissertation

Maat: px

Weergave met pagina beginnen:

Download "Cover Page. The handle holds various files of this Leiden University dissertation"

Christiaan de Wit
6 jaren geleden
Aantal bezoeken:

1 Cover Page The handle holds various files of this Leiden University dissertation Author: Valk, Ramon van der Title: Responding to environmental cues : the adaptive qualities of chromatin compaction proteins Issue Date:

2 Nederlandse samenvatting 129

3 Het effectieve volume van de genomen van alle vormen van leven is veel groter dan dat van de cellen waarin ze zich bevinden. Alle organismen beschikken daarom over mechanismen voor het compact vouwen en functioneel organiseren van hun genetisch materiaal. Door recente ontwikkelingen in fluorescentiemicroscopie en 3C-gebaseerde technologieën hebben we eindelijk een eerste inkijk in de complexe mechanismen die de driedimensionale vouwing van genomen bepalen. Dit proefschrift beschrijft onderzoek aan drie mechanismen voor het samenpakken van DNA: DNA-brugvorming (door bijvoorbeeld het bacteriële eiwit H-NS), DNA-buiging, en het wikkelen van DNA rondom een eiwitkern (zoals in het geval van de archaeale HMfA- en HMfB-eiwitten). Deze studies suggereren dat er een complexe relatie bestaat tussen de functies van deze eiwitten en de omgeving waarin de cel zich bevindt. Doordat de DNA-bindingseigenschappen van deze eiwitten worden beïnvloed door externe factoren, kunnen hun functies (b.v. de regulatie van genexpressie) worden gemoduleerd. Bacteriën zijn genoodzaakt zich regelmatig aan te passen aan verandering in hun leefomgeving. Aanpassing vereist veranderingen in genexpressie, vaak gestuurd door globale transcriptieregulatoren. Het nucleoïde-geassocieerde eiwit H-NS is een belangrijke globale regulator in Gramnegatieve bacteriën en wordt beschouwd als een sleutelspeler in bacteriële chromatine-organisatie door DNA-brugvorming. In vivo wordt H-NS-activiteit gemoduleerd door fysisch-chemische factoren (osmolariteit, ph, temperatuur) en interactiepartners. Het is onbekend hoe de functie van H-NS wordt gemoduleerd door deze factoren. In Hoofdstuk 2 wordt aangetoond dat een breed spectrum van factoren het vermogen van H-NS om DNA-DNA-bruggen te vormen kan veranderen. Door het veranderen van de concentratie van tweewaardige of eenwaardige ionen is het mogelijk om DNA- DNA-brugvorming door H-NS te bevorderen, terwijl DNA-binding grotendeels onaangetast blijft. Evenzo moduleren synergetische en antagonistische co-regulatoren de efficiëntie van de DNA-DNAbrugvorming door H-NS. DNA-brugvorming kan worden bevorderd in wisselwerking met H-NSbindende eiwitten zoals Hha en YdgT met H-NS, terwijl van andere eiwitten zoals H-NST en gp 5,5 gedacht wordt dat ze het omgekeerde effect teweeg kunnen brengen. Simulaties van de structuur van H-NS laten onder sommige van deze omstandigheden een overgang zien tussen een vorm van H-NS die in staat is tot brugvorming en een vorm die daar niet toe in staat is. Het is niet altijd eenvoudig de effecten van eiwitten die binden aan DNA te doorgronden en te kwantificeren. In de afgelopen jaren zijn veel nieuwe biofysische technieken ontwikkeld die gebruikt kunnen worden om dit soort systemen met grote nauwkeurigheid te onderzoeken. Een dergelijke techniek, Atomic Force Microscopy (AFM), blijkt een krachtig hulpmiddel voor de studie van de wisselwerking van DNA-eiwit interacties vanwege zijn vermogen om enkelvoudige moleculen op nanoschaal in beeld te brengen. De AFM kan ook worden gebruikt voor krachtspectroscopie, maar deze techniek wordt zelden toegepast om de interacties tussen DNA en eiwit te bestuderen. In Hoofdstuk 3 wordt het gebruik van een AFM-toepassing besproken waarbij op grote schaal de stabiliteit van DNA-DNA-bruggen gevormd door eiwitten wordt gemeten met een Pulling assay". Als modelsysteem, onderzochten we de interacties tussen DNA en H-NS. Middels deze analyse waren we in staat om informatie over de kracht en brugvormende eigenschappen van H-NS te verkrijgen. Deze methode zal in de toekomst gebruikt worden om de effecten van fysisch-chemische factoren en interactiepartners van H-NS, zoals beschreven staan in Hoofdstuk 2, verder te kwantificeren. 130

4 Zoals hierboven vermeld, is de organisatie van genomen een essentieel aspect in alle domeinen van leven. In Hoofdstuk 4 onderzoeken we het derde domein van leven, de Archaea. Het phylum Archaea is het nieuwste domein in de phylogenetische stamboom, dat slechts vier decennia geleden erkend werd, en zoals de naam aangeeft (afkomstig van het Griekse arkhaios, wat betekent oud of primitief) verondersteld wordt de oudste van de drie te zijn. Archaea zijn te vinden in uiteenlopende omgevingen, variërend van omgevingen met extreme temperaturen ( hot tubs etc.) en met hoge druk (diepzee) tot menselijke ingewanden. Archaea vouwen en organiseren hun genomen op verschillende manieren. Veel Archaeasoorten brengen eiwitten homoloog aan de eukaryote histonen H3 en H4 tot expressie. Het meest gangbare model, gebaseerd op data uit in vitro-experimenten, suggereert de vorming van nucleosoomachtige structuren waarbij een histontetrameer betrokken is. Echter, recente in vivo studies wijzen op de vorming van histon-dna complexen van verschillende groottes bestaande uit een aantal dimere eenheden. Hier gebruiken we de Methanothermus fervidus HMfA en HMfB eiwitten als een modelsysteem om de samenstelling en structuur van archaeale histon-dnacomplexen te onderzoeken. Onze studies tonen aan dat deze histon-achtige eiwitten coöperatief multimeriseren langs het DNA en daarbij zorgen voor sterke samenpakking. Daarnaast suggereren de resultaten dat de vorming van nucleosoomachtige structuren door tetrameren op specifieke sequenties multimerisatie stimuleert, waardoor de beide modellen samen een nieuw model opleveren. Risico analyse en beoordeling van de techniek (Risk analysis and technology assessment, RATA) De RATA van dit proefschrift heeft betrekking op de beoordeling van de risico s verbonden aan het werken met de biologische onderzoekssystemen, evenals het sociaal-economische nut van de bevindingen. Alle experimenten en bevindingen in dit proefschrift worden als laag risico beschouwd, aangezien de genetisch gemodificeerde Escherichia coli stammen niet-pathogeen zijn. Als veiligheidsmaatregel werden deze stammen dealniettemin alleen in een laboratoriumomgeving bestudeerd. Dit werd gedaan om te voorkomen dat genen die niet van nature in Escherichia coli voorkomen, zoals genen coderend voor archaeale chromatine-eiwitten of antibioticaresistentie, overgedragen worden aan andere stammen via horizontale genoverdracht,. De experimenten in dit proefschrift werden uitgevoerd volgens standaard laboratoriumveiligheidsrichtlijnen en maatregelen zijn genomen om de risico s te beperken (o.a. door het dragen van labjassen en het dragen van handschoenen). Bacteriegerelateerde experimenten werden uitgevoerd in Biosafety niveau 1 gekwalificeerde laboratoria, en zorgvuldige maatregelen werden genomen voor de veilige opslag en afvoer van biologische materialen. Experimenten met radioactiviteit werden uitgevoerd in speciaal voor dit doel aangewezen en gekwalificeerde laboratoria. Sommige experimenten vereisten het gebruik van micro- of nanodeeltjes, zoals polystyreenbolletjes gebruikt in diverse biochemische studies en in de TPM-experimenten. Geen nadelige effecten zijn bekend ten aanzien van het gebruik van deze deeltjes. Niettemin werden voorzorgsmaatregelen genomen om het risico op blootstelling te beperken, zoals het dragen van handschoenen en het minimaliseren van de gebruikte concentraties van deze deeltjes. 131

5 Alhoewel de bevindingen van deze studie niet direct toegepast kunnen worden, zijn we ervan overtuigd dat ze uiteindelijk nieuwe mogelijkheden kunnen bieden op het gebied van antibiotica of behandeling van ziektes die het gevolg zijn van foutief gereguleerde genen of afwijkingen in chromatineorganisatie. 132

Vergelijkbare documenten

Cover Page. The handle http://hdl.handle.net/1887/37134 holds various files of this Leiden University dissertation.

Cover Page. The handle http://hdl.handle.net/1887/37134 holds various files of this Leiden University dissertation. Cover Page The handle http://hdl.handle.net/1887/37134 holds various files of this Leiden University dissertation. Author: Zhang, Yu Title: Functional analysis of Dof transcription factors controlling