Abstract. KERNWOORDEN: Endotoxine - Fijn stof - Neutralisatie - Fotokatalyse - LAL test

Transcriptie

1 Abstract De hoge dosissen fijn stof (PM) die we dagelijks inademen hebben een zeer nadelig effect op onze gezondheid. Microbiële endotoxines in dat fijn stof zouden mee verantwoordelijk zijn voor deze gezondheidseffecten. Om een beter beeld te krijgen van de interactie tussen deze endotoxines en fijn stof in de atmosfeer onderzochten wij de activiteit van vrije endotoxines en endotoxines gebonden op fijn stof. Er werd gebruik gemaakt van een bio-assay om endotoxine activiteit te kwantificeren, namelijk de Limulus Amoebocyt Lysaat (LAL) test. Ook hebben we onderzocht of het mogelijk was om vrije endotoxines en PM-gebonden endotoxines te neutraliseren door middel van fotokatalyse met TiO 2 en UV licht. Uit onze resultaten bleek duidelijk dat de aanwezigheid van fijn stof de endotoxine activiteit in de LAL test verminderde. Daarnaast bleek fijn stof een beschermend effect te hebben tegen een korte behandeling met enkel TiO 2 en tegen een korte en lange behandeling met enkel UV licht. Een lange behandeling met TiO 2 in combinatie met UV licht bleek het meest efficiënt om zowel vrije als PM-gebonden endotoxines te neutraliseren. Als bindingsmodel tussen PM en endotoxines wordt voorgesteld dat de endotoxines met hun hydrofoob lipide-a deel naar de PM-deeltjes toe gebonden zijn. De vraag is dan of dit model kan veralgemeend worden voor andere vormen van PM en endotoxine dan de onderzochte vormen en ook naar andere fasen dan de vloeibare fase waarin het onderzoek gebeurde. Tijdens de experimenten werd ook de LAL test in vraag gesteld en werden een aantal experimenten uitgevoerd om de validiteit ervan te controleren. Als belangrijkste resultaat werd gevonden dat de LAL test gevoelig is voor inhibitie door op dit moment nog ongeïdentificeerde stoffen in de atmosfeer, en dat het voldoende verdunnen van luchtstalen essentieel is om deze inhibitie weg te werken. Een beter inzicht in de interacties tussen endotoxines en fijn stof kan op termijn leiden tot het ontwikkelen van efficiëntere neutralisatietechnieken voor PM-gebonden endotoxines, en tot een beter begrip van de gezondheidseffecten van endotoxines als component van PM. KERNWOORDEN: Endotoxine - Fijn stof - Neutralisatie - Fotokatalyse - LAL test I

2 Inhoudsopgave Abstract Inhoudsopgave Lijst met afkortingen en symbolen Lijst van figuren Lijst van tabellen I II IV V VI 1 Inleiding 1 2 Bespreking van de literatuur Fijn stof Definitie en opbouw Classificatie Gezondheidseffecten van fijn stof Wetgeving Endotoxines Definitie en structuur Meten van endotoxines Gezondheidseffecten van endotoxines Neutralisatie, detoxificatie en inactivatie van endotoxines Algemeen Neutralisatie met UV Neutralisatie door aluminium hydroxide Neutralisatie door fotokatalyse Doelstellingen 12 4 Materiaal en methode Materiaal LAL test Buffers Stopreagens Microplaatlezer LAL kit Glaswerk Laminaire flow kast Methode LAL test Materiaal TiO 2 proef Titaniumdioxide (TiO 2 ) PM LPS II

3 4.3.4 Glaswerk Methode TiO 2 proef Materiaal staalname Coreolis air sampler Resultaten en bespreking Zoektocht naar een geschikte buffer Neutralisatie van LPS en PM met TiO Wordt de LAL test geïnhibeerd? Problemen met het LAL protocol Discussie De interactie tussen endotoxines en fijn stof Is de veelgebruikte LAL test betrouwbaar? Interferentie Belang van het meten bij de juiste golflengte Gevolgen van verdamping Endotoxinevrij werken Sociaal-economisch Problematiek omtrent luchtvervuiling Belang van het meten van fijn stof en endotoxinegehalte Fijn stof, endotoxines en sociale ongelijkheid Ingenieur-technisch deel Toekomstperspectieven 33 Nawoord 35 Referenties 39 Bijlage 40 Bijlage 1: Overzicht van de meetwaarden voor PM, PM en Black Carbon jaar en daggemiddelden Bijlage 2: Bronnen van geselecteerde luchtverontreinigende polluenten in 2008 voor EER-32 en de landen van de Westelijke Balkan Bijlage 3: Protocol Lonza voor LAL test uit te voeren Bijlage 4: Nieuw opgesteld protocol voor LAL test uit te voeren III

4 Lijst met afkortingen en symbolen WHO World Health Organisation EU Endotoxin Unit: een maat om de endotoxineconcentratie weer te geven LAL Limulus amoebocyt lysaat LPS PM rfc TiO 2 Lipopolysachariden Particulate matter Recombinant factor C Titaniumdioxide IV

5 Lijst van figuren 1 Overzicht van de verschillende componenten van lipopolysachariden (LPS) [1] De degenkrab (Limulus polyphemus) [2] Verkort schematisch overzicht van de LAL-cascade, die leidt tot verschillende bio-assays om het endotoxinegehalte te bepalen in een staal [3] De activatie van macrofagen door LPS [4] Vereenvoudigde voorstelling van het verschil tussen metaal, halfgeleider en isolator op elektronisch niveau [5] Werking van fotokatalyse met TiO 2 als katalysator [6] Overzicht van de proefopstelling. Onder de doos bevinden zich de schaaltjes die niet met UV belicht mogen worden Coreolis air sampler [7] Resultaten van de LAL testen na 0 uur en 14 uur behandeling met TiO 2 korrels (a), UV licht (b) en TiO 2 in combinatie met UV (c) Absorptie van p-nitro alanine bij golflengtes van 350 tot 450 nm. Als blanco werd de zuivere buffer genomen V

6 Lijst van tabellen 1 Richtlijn 1999/30/EG [8] Richtlijnen WHO [9] Overzicht gebruikte stoffen voor bereiding PBS buffer. De af te wegen massa s komen uit het elabprotocol. De fabrikant en batch nummer werd op de verpakking van de stoffen terug gevonden [10] Gebruikte microplaatlezers Gebruikte LAL kit van Lonza Gebruikte testprocedure voor de LAL test, met modificaties t.o.v. van het protocol van de fabrikant (Lonza) dat zich in bijlage 3 bevindt Eigenschappen van de gebruikte PM Eigenschappen van de gebruikte LPS Overzicht staalname Endotoxine activiteit van de buffers voor en na staalname. Er werd telkens ook gespiked met 0.49 EU/mL om te testen voor inhibitie. Voor de luchtstalen werd de LAL test niet in dubbel uitgevoerd, daarom konden bij deze resultaten geen betrouwbaarheidsintervallen berekend worden Overzicht staalname Endotoxine activiteiten van oplossingen met LPS, PM, LPS+PM en een negatieve controle (buffer). De reactie met TiO 2 en UV werd getest, maar ook met enkel UV en enkel TiO 2. Activiteiten werden gemeten voor de reactie, na één uur van de reactie en na veertien uur van de reactie. Bij de controle meting van 14u geen behandeling, lagen de dubbels heel ver uit elkaar. Alle activiteiten zijn in EU/mL De gemeten endotoxine activiteit na verdunning, en de verwachte activiteit na verdunning op basis van de verdunningsfactor. Alle activiteiten zijn in EU/mL. De onverdunde stalen werden niet in dubbel getest, daarom konden bij deze resultaten geen betrouwbaarheidsintervallen berekend worden Het aantal keer dat 35 µl water kon gepipetteerd worden uit bakjes met ml (het maximum was dus 40 keer). De helft van de bakjes werd een half uur beschenen door de lamp van de laminaire flow kast, de andere helft werd bedekt door aluminium folie VI

7 1 Inleiding Het onderwerp van deze bachelorproef is endotoxines in de lucht en de relatie ermee tot fijn stof. De term fijn stof hangt nauw samen met luchtvervuiling. Luchtvervuiling zelf heeft daarnaast zeer directe socio-economische gevolgen op het dagelijkse leven. Zo wordt bijvoorbeeld in een artikel uit de krant De Morgen [11], door de woordvoerder van de Europese Kamer van Koophandel in China, geconstateerd dat tal van mensen wegtrekken door luchtvervuiling. Daarnaast wordt hierin ook geschreven dat luchtvervuiling, alleen al in China, gezorgd heeft voor 1.2 miljoen doden in het jaar Deze resultaten zijn afkomstig van een studie die werd uitgevoerd door de Universiteit van Washington, gepubliceerd in het Britse tijdschrift The Lancet. Dit artikel illustreert dus dat luchtvervuiling niet alleen beperkt is tot gezondheidsnadelen, maar dat het ook ernstige economische en sociale gevolgen kan hebben op een samenleving. Door dergelijke artikels en het vele gebruik van de term fijn stof in bijvoorbeeld de media, klinken termen als luchtvervuiling en fijn stof voor veel mensen steeds banaler. Daarom is het van belang om dieper in te gaan op de impact ervan. In deze bachelorpaper wordt daarom de classificatie, de gezondheidsaspecten en de wetgeving omtrent fijn stof besproken. Vervolgens wordt ingegaan op een tot nu toe weinig onderzochte component ervan, namelijk endotoxines. Deze microbiële endotoxines kunnen ongunstig gezondheidseffecten veroorzaken. Naast de structuur en hoe endotoxines worden gemeten, worden ook de reeds onderzochte neutralisatie technieken besproken. In de huidige literatuur is veel informatie over zowel fijn stof als endotoxines te vinden. Echter wanneer het om de interactie en/of de chemische binding tussen fijn stof en endotoxines gaat, blijven de resultaten uit. Daarom is het primaire doel van deze bachelorproef om de interactie van endotoxines met fijn stof te bekijken. Zo kan de vraag gesteld worden of de verschillende componenten van fijn stof een invloed hebben op de endotoxines. Het zou namelijk kunnen dat de binding van endotoxines op fijn stof ervoor zorgt dat de endotoxines hun toxiciteit of pro-inflammatoire karakter verliezen. Ook de vraag of de LAL test deze gebonden endotoxines kan meten wordt gesteld. Zoals besproken zal worden in de literatuurstudie kunnen endotoxines bijdragen tot tal van negatieve gezondheidsaspecten. Hierdoor is het belangrijk dat er een effectieve methode gevonden wordt om endotoxines te neutraliseren. Een reeds geteste neutralisatietechniek bestaat uit titaniumdioxide (TiO 2 ) dat onder invloed van ultraviolet licht endotoxines kan afbreken. Deze techniek wordt ook in deze bachelorproef gebruikt. Om nog in lijn te lopen met de eerste topic van de bachelorproef, zal er dus een experiment opgesteld worden waarbij neutralisatie centraal staat en waarbij gekeken wordt naar de effecten ervan op fijn stof, endotoxines en beide gecombineerd. Hierdoor kan er inzicht verkregen worden in de interactie tussen de twee, en ook hoe de LAL test hierop reageert. De bredere doelstelling van dit bachelorproject is dus een meerwaarde te bieden aan het verhaal van endotoxines in samenhang met fijn stof. Niet alle vragen vanuit deze inleiding kunnen beantwoord worden, maar wel wordt er geprobeerd om een literaire basis te leggen voor verder onderzoek tussen endotoxines en fijn stof. Door een efficiënte manier te vinden om endotoxines te neutraliseren kan er al een krachtige stap vooruit gezet worden om de problematiek omtrent luchtvervuiling tegen te gaan. Door verder onderzoek van endotoxines in fijn stof kan het gevaar hiervan beter ingeschat worden. 1

8 2 Bespreking van de literatuur 2.1 Fijn stof Definitie en opbouw Fijn stof is vandaag de dag een ingeburgerde term. Echter, om de impact van fijn stof op milieu en gezondheid beter te kunnen inschatten, moet er nog veel wetenschappelijk onderzoek gebeuren. Volgens de United States Environmental Protection Agency (EPA) wordt de term fijn stof gedefinieerd als the generic term for a broad class of chemically and physically diverse substances that exist as discrete particles (liquid droplets or solids) over a wide range of sizes [12]. De samenstelling van fijn stof kan variëren van deeltje tot deeltje. Meestal worden de volgende componenten onderscheiden: metalen, koolwaterstoffen, ionen en organische componenten zoals endotoxines [13]. Fijn stof in het algemeen, bestaat hoofdzakelijk uit sulfaat, nitraat, ammonium, natrium, chloriden, koolstof (zowel elementair als organisch) als water [14] Classificatie Er bestaan tal van onderverdelingen om fijn stof te karakteriseren. Zo deelt men fijn stof voornamelijk in volgens de grootte en de oorsprong ervan. Als er in de literatuur over de grootte gesproken wordt, komen volgende termen aan bod: Particulate Matter10 (PM 10 ) en Particulate Matter2.5 (PM 2.5 ). PM 10, die ook wel coarse particles genoemd worden, zijn deeltjes met een grootte tussen 2.5 en 10 µm. Deze deeltjes worden voornamelijk gevormd door mechanische processen zoals erosie van het aardoppervlak [12]. PM 2.5 of fine particles zijn deeltjes kleiner dan 2.5 µm. Verder zijn er nog tal van andere onderverdelingen zoals: Aitken en ultrafine. De term ultrafine particles slaat op deeltjes die kleiner zijn dan 0.1 µm. Door hun grootte hebben ze een aanzienlijke invloed op de gezondheid. Het is namelijk zo dat hoe kleiner het deeltje is, hoe groter de gezondheidsrisico s zijn [15]. Fijn stof wordt daarnaast ook onderverdeeld op basis van de oorsprong. Hiervoor worden termen zoals natuurlijk en antropogeen aangewend. Onder de term natuurlijk fijn stof, vallen bijvoorbeeld deeltjes die afkomstig zijn van vulkaan uitbarstingen. Antropogeen duidt op deeltjes afkomstig van een menselijke input zoals emissie van motoren. Een laatste classificatie van fijn stof is de opdeling primair/secundair. Primair fijn stof zijn deeltjes die rechtstreeks worden uitgestoten in de atmosfeer afkomstig van natuurlijke en antropogene bronnen [14]. Secundaire deeltjes zijn deze die gevormd worden via chemische processen in de atmosfeer afkomstig uit gasvormige emissie van polluenten [14]. De vorming van sulfaten en nitraten uit SO 2, NO x en NH 3 zijn hiervan een voorbeeld [14] Gezondheidseffecten van fijn stof Het kunnen inschatten van de gezondheidseffecten van fijn stof wordt steeds belangrijker. Hiervoor moet echter eerst een onderscheid gemaakt worden tussen korte en lange termijn effecten. Een verschil tussen deze laatsten is bijvoorbeeld de onderzoeksmethode. Studies die het aantal doden meten in korte termijn blootstelling aan PM, zullen namelijk alleen die individuen opnemen die toch zouden gestorven zijn binnen een paar dagen. In een korte termijn studie kan daarom het lange termijn effect van een dagelijkse blootstelling aan hoge concentraties PM niet onderzocht worden. De lange termijn studies focussen zich dan weer op de algehele gezondheidseffecten. Ook de effecten van langdurige blootstelling aan lage concentraties PM zijn hierin dus opgenomen [16]. 2

9 Korte termijn gezondheidseffecten De korte termijn studies kijken naar veranderingen in het aantal dagelijkse overlijdens die geassocieerd zijn met korte termijn veranderingen in PM en luchtvervuiling. Vooral bij hoge concentraties speelt dit een belangrijke rol. Resultaten van dergelijke onderzoeken suggereren dat een toename van 10 µg/m 3 in PM 10 gerelateerd is aan een stijging van 0.5% tot 1.5% in het aantal dagelijkse overlijdens [16]. Een ander onderzoek wijst uit dat astma en chronische obstructieve longziekten bij mensen ouder dan 65 jaar toenemen met 1.0% voor elke stijging van 10 µg/m 3 in de PM 10 concentratie. Tot slot concludeert hetzelfde onderzoek dat de opnames voor hart- en vaatziekten met zowat 0.5% stijgen per µg/m 3 toename in PM 10 [16]. Lange termijn gezondheidseffecten Naast de korte termijn effecten is het ook relevant om te weten wat de gevolgen zijn van cummulatieve blootstelling aan lage concentratie van PM op lange termijn. Studies wijzen uit dat lange termijn blootstelling aan fijn stof gekoppeld is aan een vermindering van de longfunctie, chronische bronchitis, een toename in de kans op longkanker en cardio-pulmonale sterfte. Ook blijkt dat fijne en ultrafijne deeltjes, afkomstig van de uitlaat van voertuigen, een invloed hebben op hartslagvariabiliteit, bloedviscositeit, bloed coagulatie, hartritmestoornissen, atherosclerose, et cetera [16] Wetgeving De opbouw, classificatie en gezondheidseffecten van fijn stof zijn hierboven kort besproken. Daarnaast is het ook belangrijk om te weten hoe de politiek op deze kennis inspeelt. Dit uit zich in richtlijnen die worden opgesteld en opgelegd binnen de Europese Unie, om de concentratie aan fijn stof in de lucht te verlagen. Het is van belang om te weten dat er geen grenswaarden voor het fijn stof gehalte bestaan die de gezondheidseffecten volledig elimineren; er zijn altijd mensen die effecten ondervinden van zelfs zeer lage concentraties. Toch zijn er richtlijnen opgesteld om de gezondheidseffecten minimaal te houden [17]. De richtlijnen (grenswaarden) die de Europese Unie heeft opgesteld waaraan de lidstaten zich moeten houden worden weergegeven in tabel 1. Ze zijn onderverdeeld op basis van dag en jaar. Dit is van belang omdat onderzoek uitwijst dat er gezondheidseffecten zijn op zowel korte als lange termijn [18]. Ook in Vlaanderen wordt dit opgevolgd. Zo worden er overzichtstabellen opgesteld van de PM 10, PM 2.5 en Black Carbon (BC) waarden in µg/m 3. Deze tabellen zijn weergegeven in bijlage 1. Voor bijvoorbeeld PM 10 worden de verschillende meetstations weergegeven waarbij het PM 10 jaargemiddelde wordt voorgesteld vanaf 1997 (zie bijlage 1a). De overschrijdingen zijn gebaseerd op de EU richtlijn 1999/30/EG. Zo worden waarden die hoger zijn dan 40 µg/m weergegeven in het oranje en vanaf 2005 in het rood. De World Health Organisation (WHO) heeft andere streefwaarden opgesteld. In figuur 2 worden deze voorgesteld voor zowel PM 10 als PM 2.5. De waarden van PM 10 komen overeen met deze uit bijlage 1a voor Het is belangrijk om er rekening mee te houden dat er geen optimale waarde bestaat. Zelfs bij de PM-waarden van WHO zullen er mensen zijn die negatieve gezondheidseffecten zullen ondervinden. WHO expliceert dit in als volgt it is unlikely that any standard or guideline value will lead to complete protection for every individual against all possible adverse health effects of particulate matter [9]. 3

10 Tabel 1: Richtlijn 1999/30/EG [8]. Tabel 2: Richtlijnen WHO [9]. 4

11 2.2 Endotoxines Definitie en structuur Volgens het volgende handboek Microbiology: an evolving science, wordt een endotoxine gedefinieerd als een celcomponent die onschadelijk is zolang de pathogeen intact blijft; maar wanneer vrijgesteld door een lyserende cel, overstimuleren de endotoxines de verdedigingsmechanismen van de gastheer, wat zo een mogelijke letale endotoxische shock kan veroorzaken [19]. Lipopolysachariden (LPS) zijn hiervan het best gekende voorbeeld. Dit zijn componenten die terug te vinden zijn in de celwand van gramnegatieve bacteriën. Een LPS molecule is opgebouwd uit drie basisdelen: een lipide-a, een kerngedeelte en een O-antigeen gedeelte. Figuur 1 geeft een overzicht van de verschillende componenten. Het lipide-a gedeelte is sterk geconserveerd en is daarnaast verantwoordelijk voor de biologische activiteit [20]. Het O-antigeen gedeelte daarentegen kan sterk verschillen tussen LPS moleculen. Figuur 1: Overzicht van de verschillende componenten van lipopolysachariden (LPS) [1]. LPS wordt in tal van studies onderzocht en deze molecule staat er om bekend om luchtwegontstekingen te veroorzaken. Dit wordt later uitgewerkt in Daarnaast wordt LPS ook vaak onterecht als synoniem voor endotoxines gebruikt. Endotoxines beslaan namelijk een bredere definitie. Zo stelt het boek Microbiology: an evolving science dat een concreet verschil tussen deze twee is dat endotoxine naast LPS, ook lipoteichoïnezuur van grampositieve bacteriën omvat. Opvallend in de literatuur is dat wanneer er gesproken wordt over fijn stof, er vaak geen notie wordt gemaakt van endotoxines. Dit is echter iets dat niet zomaar vergeten mag worden aangezien biologische componenten voor 20% deel uitmaken van atmosferische aerosolen in de lucht. Deze biologische componenten zijn ondermeer: pollen, sporen, planten resten, algen, bacteriën, protozoa en virussen [21]. 5

12 2.2.2 Meten van endotoxines Algemeen Vandaag de dag zijn er verschillende mogelijkheden om het endotoxinegehalte te bepalen. De oudste methode is de pyrogeentest op konijnen. Een meer recente, en meer gebruikte methode, is het gebruik van de bio-assays. Hiervan zijn de verschillende soorten Limulus Amoebocyt Lysaat (LAL) testen en de recombinant factor C test (rfc) de belangrijkste. Daarnaast kunnen ook chemische analysetechnieken gebruikt worden om het endotoxinegehalte te bepalen. Dit verloopt dan ofwel via gas-vloeistof chromatografie, ofwel via gaschromatografie gevolgd door massaspectrometrie [3]. Hieronder worden de verschillende soorten LAL testen toegelicht. LAL test De LAL test is momenteel de meest gebruikte test om endotoxinegehaltes in stalen te bepalen. Dit is een bioassay die gebaseerd is op LAL enzymes geproduceerd door de degenkrab (Limulus polyphemus, zie figuur 2). Deze LAL enzymes ontstaan in de bloedcellen (amoebocyten) van de krab als primitief immuunsysteem. Wanneer het immuunsysteem van de krab in contact komt met indingende endotoxines, komt er een inactivatie tot stand zoals links weergegeven in figuur 3 ( gel clot LAL test). De eerste stap is dat het factor C enzym geactiveerd wordt door binding met endotoxine. Zo ontstaat er een actief factor C enzym, dat op zijn beurt het proclotting enzym activeert. De laatste stap is dat het geactiveerde clotting enzym coagulogeen omzet tot coaguline, wat zorgt voor clotvorming (stolling). Deze stolling zorgt ervoor dat verdere infectie wordt tegengehouden. De opeenvolgende reacties van enzymen die geactiveerd worden tot en met de clotvorming, worden ook wel de LAL cascade genoemd [3, 22]. Figuur 2: De degenkrab (Limulus polyphemus) [2]. Er bestaan verschillende varianten van de LAL test: ˆ gel clot LAL test ˆ kinetische turbidimetrische LAL test ˆ eindpunt chromogenische LAL test ˆ kinetische chromogenische LAL test ˆ eindpunt fluorescerende LAL test (recombinant factor C test)[23]. 6

13 Figuur 3: Verkort schematisch overzicht van de LAL-cascade, die leidt tot verschillende bio-assays om het endotoxinegehalte te bepalen in een staal [3]. Het verschil in de verschillende LAL testen ligt in het feit van wat en hoe er wordt gemeten. Zo wordt bij de gel clot LAL test gekeken of er, na toevoeging van LAL enzymes aan een sample, clotvorming is of niet. Dit is bijgevolg een kwalitatieve test. Een variant op de gel clot LAL test is de kinetische turbidimetrische LAL test. Dit is een kwantitatieve test die de turbiditeit of troebelheid van de oplossing meet in functie van de tijd. De gevoeligheid van deze test bedraagt EU/mL. Een ander soort LAL testen zijn de chromogenische LAL testen (eindpunt of kinetische). Hierbij wordt de activiteit van een serine protease gemeten door het coagulogeen in de LAL cascade te vervangen met een kleurloos synthetisch peptide substraat (Ac-Ile-Glu-Ala-Arg-pNA) dat p-nitroaniline (pna) vrijstelt na proteolyse. Deze stof heeft een gele kleur, die met behulp van een spectrofotometer gemeten kan worden [24, 25]. Wanneer enkel op het eindpunt de absorptie wordt bepaald, spreekt men van de eindpunt chromogenische LAL test. Indien gedurende de hele test de toename (absorptie) van gele kleur wordt gemonitord, gaat het over de kinetische chromogenische LAL test. Beide testen zijn kwantitatief, maar hebben wel een verschillend bereik. Zo is het bereik van de eindpunt chromogenische test EU/mL. De kinetische chromogenische LAL test is de gevoeligste van alle LAL testen met een bereik van EU/mL. Bij alle voorgaande testen moet ook rekening worden gehouden met mogelijke interferenten zoals glucaan, voornamelijk β-1,3-d-glucaan [22]. Deze kunnen ook de LAL cascade initiëren, maar moeten in vergelijking met de endotoxineconcentratie wel 1000 keer meer aanwezig zijn om dezelfde reactie te veroorzaken. 7

14 Een laatste test die besproken moet worden is de eindpunt fluorescerende LAL test of recombinant factor C test. De recombinant factor C (rfc) test brengt verbetering in zowel specificiteit als reproduceerbaarheid t.o.v de andere LAL testen. Deze assay is namelijk gebaseerd op hetzelfde reactiemechanisme als de LAL test, maar hier wordt een genetisch gemodificeerd reagens gebruikt (rfc i.p.v. factor C) om de LAL cascade in gang te zetten. Wanneer er endotoxine bindt aan dit rfc reagens, wordt dit geactiveerd tot een actief rfc enzym. Dit actief rfc enzym, splitst dan vanzelf een synthetisch substraat af, wat resulteert in de toename van een fluorescente verbinding die met een fluorescente microplaatlezer gemeten kan worden. Binnen het EU/mL bereik kan vervolgens kwantitatief het endotoxinegehalte bepaald worden. Een groot voordeel van deze test is dat vals positieve testen vermeden worden omdat er geen interferentie van glucaan mogelijk is. Dit genetisch gemodificeerd reagens (rfc reagens) werd verkregen uit het cdna van de mangrove degenkrab (Carcinoscorpius rotundicauda) [3]. Omdat de rfc test geen reagens van levende dieren gebruikt (in tegenstelling tot bij de LAL testen) is er daarnaast ook geen verschil in reactiviteit v.h. lysaat uit verschillende kitten met endotoxine. Bij de LAL test is dit wel omwille van de natuurlijke variatie in limulus lysaat [3, 23] Gezondheidseffecten van endotoxines Het onderzoek naar de gezondheidseffecten van endotoxines dat tot nu toe is gebeurd, kan ingedeeld worden in drie verschillende categorieën: het effect van endotoxines die in de bloedbaan terecht komen door een infectie met gramnegatieve bacteriën, de korte en lange termijn effecten van het inademen van vrije endotoxines, en het inademen van endotoxines als component van fijn stof. Aangezien lipopolysachariden in alle gramnegatieve bacteriën voorkomen zijn ze voor ons lichaam ideale pathogenassociated molecular patterns (PAMPS): ze worden gebruikt als signaalmoleculen voor een bacteriële infectie. Ons aangeboren immuunsysteem herkent de LPS moleculen als afkomstig van gramnegatieve bacteriën en lanceert een lokale ontstekingsreactie om ofwel de bacteriën volledig uit te schakelen, of om hun groei te beperken tot er een specifieke immuunrespons ontwikkeld is. In sommige gevallen van LPS-blootstelling kan er echter een systemische ontstekingsreactie optreden met soms zelfs de dood als gevolg. Er wordt dan gesproken van een septische shock. Omwille van deze reden is het van vitaal belang dat al het materiaal dat gebruikt wordt in de geneeskunde, denk maar aan injecties, endotoxinevrij is. Het mechanisme waarlangs de ontstekingsreactie verloopt is vrij goed gekend [26, 4, 27, 28, 29]. Centraal bij de herkenning van LPS staan de moleculen LBP, CD14, MD-2 en TLR4. LPS komt voor ofwel als een integraal deel van de celmembraan van een gramnegatieve bacteriën, ofwel in aggregaten. Door te binden aan LPS moleculen katalyseert het eiwit LBP (LPS binding protein) de overgang van de LPS moleculen in de membraan of de aggregaten naar vrije LPS moleculen. Deze LPB:LPS associatie bindt vervolgens aan een mcd14 molecule, die via een GPI anker vastzit aan de celmembraan van macrofagen of monocyten. In het serum komen ook vrije scd14 moleculen voor waar LPB:LPS op kan binden. Op die manier kunnen ook endo- en epitheelcellen, die mcd14 niet bevatten, geactiveerd worden door LPS. In de volgende stap draagt CD14 de LPS molecule over aan het TLR4/MD-2 complex. Dit complex zet de signaaltransductie in gang, met als uiteindelijke gevolg de productie van een aantal cytokines zoals TNF-α en de interleukines IL-1,6,8,12. Deze zorgen dan voor de ontsteking. 8

15 Figuur 4: De activatie van macrofagen door LPS [4]. Negatieve gezondheidseffecten door het inademen van vrije endotoxines in de lucht zijn vooral gedocumenteerd bij werkplaatsen waar de endotoxineconcentratie door de beroepsactiviteit enorm hoog is, zoals bijvoorbeeld in de landbouw en textielindustrie [30]. Zowel acute als chronische effecten door endotoxineblootstelling op de werkplaats werden al vastgesteld [31]. Acute effecten zijn onder meer ODTS (organisc dust toxicity syndrome; een aantal griep-achtige symptomen) en een vermindering in het forced expiratory volume (FEV) tijdens de werkuren. Blootstelling voor een langere periode kan leiden tot koorts, hoofdpijn en ontsteking van de luchtwegen en vergroot de kans op chronische bronchitits. Een groot aantal studies concentreert zich op de vraag of endotoxineblootstelling de kans op atopie (verhoogde gevoeligheid voor allergieën) en astma verhoogt, of net verlaagt. Een Zwitserse studie uit 2002 bij schoolgaande kinderen van 6 tot 13 jaar vond een omgekeerde relatie tussen endotoxineblootstelling en atopie en astma [32]. Inademing van endotoxines bleek dus een beschermend effect te hebben tegen het ontwikkelen van allergieën en astma. Sindsdien hebben echter niet alle studies deze vaststelling kunnen repliceren, en sommigen vonden zelfs het omgekeerd verband [33]. Een review over de relatie tussen endotoxines en atopie uit 2009 concludeert dat wanneer je ook de genetische aanleg in rekening brengt, de meeste studies redelijk consequent volgende hypothese bevestigen: endotoxineblootstelling heeft een beschermend effect tegen atopie, maar alleen bij mensen met een specifieke SNP (single nucleotide polymorphism) mutatie in het CD14 gen [34]. Verder onderzoek is hier echter nog noodzakelijk om de rol van genetische aanleg beter te begrijpen. Over de rol die endotoxines spelen in de gezondheidseffecten van fijn stof is al redelijk wat onderzoek gebeurd. De meeste studies gaan als volgt te werk. Eerst worden luchtstalen op een aantal verschillende plaatsen genomen. Vervolgens worden de concentraties van de verschillende bestanddelen van fijn stof gemeten. Daarna worden de stalen aan ratten/muizen of aan cellijnen toegediend, en ten slotte wordt nagegaan of er een verband is tussen één of meerdere van de componenten en de productie van cytokines [35, 36, 13, 37]. Een review studie over de rol van endotoxines in de toxiciteit van fijn stof door Degobbi et al. [21] concludeert dat de meeste (maar niet alle) studies de pro-inflammatoire effecten van fijn stof toeschrijven aan de endotoxinecomponent, en dan vooral in PM 10. Endotoxines spelen dus hoogstwaarschijnlijk een belangrijke rol in de negatieve gezondheidseffecten van fijn stof. 9

16 2.3 Neutralisatie, detoxificatie en inactivatie van endotoxines Algemeen Nu de gezondheidsaspecten van zowel fijn stof als endotoxine zijn besproken, is het interessant om te weten hoe deze toch wel schadelijke stoffen, geneutraliseerd kunnen worden. Enkel de neutralisatie en detoxificatie van endotoxines wordt hier kort toegelicht Neutralisatie met UV In het wetenschappelijk artikel Endotoxin Inactivation in Water by Using Medium-Pressure wordt aangetoond dat bestraling met UV effectief is voor de inactivatie van endotoxines in water. Dit artikel stelt ook dat er verscheidene gevallen bekend zijn waarbij endotoxines hebben geleid tot sterftegevallen. Een voorbeeld hiervan is het onbewuste gebruik van met endotoxine gecontamineerd water, voor verdunning voor intraveneuze medicatie [38]. Dit is een van de redenen waarom endotoxines vermeden moeten worden in de medische wereld. De resultaten van dit artikel illustreren dat inactivatie van endotoxines proportioneel is met de UV dosis. De inactiveringssnelheid is ongeveer 0.55 EU/ml voor elke mj/cm 2 van bestraling Neutralisatie door aluminium hydroxide Er is ook onderzoek bekend waarbij endotoxines worden gedetoxificeerd door middel van aluminiumhydroxide [39]. Hierbij adsorberen de endotoxines irreversibel aan het oppervlak van aluminiumhydroxide. Adsorptie treedt op door elektrostatische aantrekking en covalente bindingen. Daarentegen is het te zien dat er bij aluminiumfosfaat afstoting waargenomen wordt. Het effect van een toediening van aluminiumhydroxide en een 15 mg/kg toeding van endotoxines is getest geweest op ratten. Dit effect kon bepaald worden door meting van tumor necrose factor-alfa (TNF-α) en interleukine-6 (IL-6). De resultaten van deze proef vermelden dat TNF-α en IL-6 waargenomen is in groepen die enkel een endotoxine of endotoxine en aluminiumfosfaat ontvingen. Er is wel niets gedetecteerd bij de groep die endotoxine en aluminiumhydroxide ontvingen. Hierdoor kan er dus gesteld worden dat aluminiumhydroxide endotoxines detoxificeert door irreversibele adsorptie. Verder kunnen ook alkalinfosfatase [40], Tiratricol [41], titaniumdioxide (TiO 2, zoals later besproken zal worden) en nog enkele andere stoffen gebruikt worden om endotoxines te neutraliseren Neutralisatie door fotokatalyse In deze bachelorproef wordt de nadruk gelegd op detoxificatie/neutralisatie van endotoxines d.m.v. fotokatalyse. Eerst wordt kort besproken wat fotokatalyse is, erna wordt ingegaan op de reeds uitgevoerde neutralisatie experimenten met fotokatalyse, met als katalysator titaniumdioxide. Fotokatalyse Een manier om endotoxines te neutraliseren is met fotokatalyse. Fotokatalyse maakt gebruik van katalysatoren. Dit zijn stoffen die deelnemen aan de reactie maar niet verbruikt worden [42]. De meest gebruikte katalysator voor fotokatalyse is de halfgeleider TiO 2. Voor de werking van fotokatalyse is echter eerst wat achtergrond kennis vereist. In figuur 5 wordt op elektronisch niveau het verschil gegeven tussen een geleider, een halfgeleider en een isolator. Op de y-as wordt het energieniveau weergegeven. Op deze figuur worden de valentie- en conductiebanden weergegeven, met daartussen eventueel de bandgap. De valentieband is de hoogste energetische toestand waar nog elektronen zitten en de conductieband stelt de laagst energetische toestand voor waar geen elektronen meer zitten. Voor een metaal is het zo dat deze twee banden overlappen met elkaar en de elektronen vrij hiertussen kunnen bewegen. Echter voor zowel een halfgeleider als een isolator is er een bandgap of m.a.w. een verschil 10

17 tussen deze twee banden. Het verschil tussen een halfgeleider en isolator is dat voor een halfgeleider, mits toevoeging van energie, er toch nog elektronen van de valentieband naar de conductieband geëxciteerd kunnen worden. Dit gaat niet voor isolatoren omdat de bandgap te groot is om te kunnen overbruggen [6, 42]. Figuur 5: Vereenvoudigde voorstelling van het verschil tussen metaal, halfgeleider en isolator op elektronisch niveau [5]. Wanneer er nu een elektron e - van de valentieband naar de conductieband kan springen door extra energie blijft er op de valentieband een gat over. Dit gat is een H +, wat ook wel het positief geladen equivalent is van een elektron. Specifiek voor de halfgeleider TiO 2 wordt het volgende verkregen. Om de bandgap te overwinnen is een energie van minstens 3.2 elektronvolt nodig. Dit komt overeen met licht met een golflengte van 385 nm of lager. Dit ligt dus in het UV gebied. De gevormde elektron-gat paren kunnen dan elektronen afstaan of opnemen van bijvoorbeeld water en zuurstof uit de omgeving, zodat er radicalen gevormd worden. Deze radicalen zorgen dan voor de afbraak van organische componenten zoals endotoxines, of gassen zoals NO x uit de omgeving [6, 42]. Figuur 6: Werking van fotokatalyse met TiO 2 als katalysator [6]. Reeds uitgevoerde fotokatalytische neutralisatie experimenten Als reactief oppervlak bij al deze experimenten werd gebruik gemaakt van TiO 2. Voor verdere verduidelijking van de werking hiervan, wordt verwezen naar en 4. In deze sectie wordt er ingegaan op reeds uitgevoerde experimenten met TiO 2 om endotoxines te neutraliseren. TiO 2 kan dienst doen als bactericidaal middel en zorgt ook voor een degradatie van endotoxines [43]. In dit wetenschappelijk artikel is er onderzoek gedaan naar twee effecten van TiO 2. Enerzijds de fotokatalytische degradatie van endotoxines en anderzijds de bactericide activiteit. De bactericide activiteit werd bepaald door het aantal levende cellen, die kolonies vormen op een agar plaat, te tellen. De endotoxineconcentratie kon bepaald worden a.d.h.v. de LAL test (zie 2.2.2). Uit de resultaten kan opgemaakt worden dat het TiO 2, d.m.v. UV behandeling, de bacteriën doodt en tegelijkertijd zorgt voor een afbraak van endotoxines. 11

18 Een ander artikel heeft ook de effecten van TiO 2 op bacteriën onderzocht. Dit gebeurde op het organisme L.Pneumophila. Dit micro-organisme is heel abundant en veroorzaakt pneumonie bij oudere mensen. De bactericide effecten werden op drie manieren onderzocht. Eerst werden de bacteriële celwanden bestudeerd met een scanning electron miscrope (SEM). Vervolgens werd de lekkage van endotoxines gekwantificeerd. Deze is van belang omdat UV straling leidt tot sterfte van de cel met als gevolg een lekkage van de inhoud. Als laatste werd de survival rate bepaald. De resultaten van dit onderzoek tonen aan dat volledige degradatie van endotoxines enkel in de aanwezigheid van TiO 2 plaatsgrijpt. Daarnaast blijkt UV alleen ook te zorgen voor degradatie van endotoxines, echter wel in mindere mate. In dit experiment is er onderscheid gemaakt tussen UV-A (6W black light lamp, wavelength: 365nm) en UV-C (6W germicidal lamp, wavelength: 254nm). Belangrijk hierbij is dat UV-C een sterker bacteriedodend effect heeft. De endotoxineconcentratie werd opnieuw bepaald door de LAL test. 3 Doelstellingen Het hoofddoel van deze paper is inzicht verkrijgen in de interactie van endotoxines en fijn stof. Dit zal gebeuren door enerzijds de neutralisatie van endotoxines te onderzoeken met TiO 2 en vervolgens ook deze van endotoxines met fijn stof. Hierdoor kan er inzicht verworven worden tussen beide. Ook wordt er achterhaald of er inhiberende stoffen aanwezig zijn in de lucht. Dit is van essentieel belang om een beter beeld te krijgen over de procedure van de LAL test. 12

19 4 Materiaal en methode 4.1 Materiaal LAL test Buffers ˆ Tris buffer Er werd gekozen voor 100 ml Tris buffer te maken van 0.5 M. m afgewogen = C MG V = 0.5 mol L 1 x 121, 14 g mol 1 x L = g Er werd g Trizma base van fabrikant Sigma afgewogen. Batch number: 066K5454. Dit werd opgelost in 101 ml milli Q water, waardoor een concentratie van 0.49 M werd bekomen. De ph werd daarna van naar 7.44 gebracht door toevoeging van HCl. De buffer werd vervolgens nog geautoclaveerd. Deze werd dan voor de eigenlijke staalname 10 keer verdund door 10 ml buffer in 90 ml milli Q water te doen. ˆ PBS buffer Voor de PBS buffer werd gekozen om 200 ml te maken van de 10x geconcentreerde vorm. Als protocol voor de af te wegen hoeveelheid, werd gebruik gemaakt van het elabprotocol. Hierop wordt aangegeven hoeveel van welke stof afgewogen dient te worden om het totaal volume te bekomen met bepaalde concentratie [10]. Tabel 3: Overzicht gebruikte stoffen voor bereiding PBS buffer. De af te wegen massa s komen uit het elabprotocol. De fabrikant en batch nummer werd op de verpakking van de stoffen terug gevonden [10]. NaCl Na 2 HPO 4 KCl KH 2 PO 4 Theoretische af te wegen massa: m (g) Werkelijk afgewogen m (g) Fabrikant product GPR Rectapur Pro analysis Fluca analytical Fluka Batch nummer 08B of A94386 BCBC Dit werd opgelost in 200 ml. Vervolgens werd de ph van 6.80 met NaOH naar 7.47 gebracht. ˆ Dulbecco s Phosphate Buffered Saline (DPBS) Deze buffer zou een endotoxinevrije buffer moeten zijn. Het was een 1x geconcentreerde buffer van de firma gibco by life technologies. De referentienummer is en het lot nummer is Stopreagens ˆ Sodium dodecyl sulfaat (SDS) Van het stopreagens sodium dodecyl sulfaat (SDS) werd een concentratie van 10 g / 100 ml gemaakt. m afgewogen = C V = 10 g L x L = g Er werd exact g afgewogen en dit werd in 100 ml opgelost. ˆ 25% azijnzuur De 96% azijnzuur oplossing die in het labo aanwezig was (fabrikant: Riedel-de Haën), werd 4 keer verdund tot een finale concentratie van 24% azijnzuur. 13

20 4.1.3 Microplaatlezer Er werd gebruik gemaakt van 2 microplaatlezers: Tabel 4: Gebruikte microplaatlezers. Microplaatlezer 1 2 Naam Synergy TM Mx, Multi-Mode Microplate Reader EZ Reader 400 Eliza Fabrikant Biotek Instruments, Inc Biochrom Serie nummer LAL kit Er werd gekozen om te werken met de eindpunt chromogenische LAL test kit van Lonza. Tabel 5: Gebruikte LAL kit van Lonza. LAL test kit Soort kit QCL-1000, 120 Test kit Beginconcentratie LAL enzyme 28 EU/mL Fabrikant Lonza Kit nummer Lysaat lot nummer Glaswerk Al het niet-volumetrische glaswerk werd ingepakt met ziverpapier en vervolgens endotoxinevrij gemaakt door het gedurende 30 minuten in een oven van 250 C te zetten. Volumetrisch glaswerk werd na reiniging in de afwasmachine, gespoeld met ethanol en milli Q water, alvorens gebruik. Er werden microplaten gebruikt die pyrogeenvrij waren. Bij het pipetteren werden ook pyrogeenvrije pipetpunten gebruikt Laminaire flow kast Gedurende elk experiment werd onder de laminaire flow kast gewerkt (Telstar Bio II advance) om endotoxinecontaminatie te beperken. Ook de UV stand van de kast werd gebruikt voor het uitvoeren van het TiO 2 experiment. De UV lampen uit de laminaire flow kast hebben een gemeten intensiteit van 0.21 mw/cm². Dit werd gemeten over het gebied tussen 178 en 400 nm. De maximale intensiteit werd bij 254 nm bereikt. Deze gegevens werden bekomen door gebruik te maken van een spectrometer type AvaSpec-3648 van het merk Avantes. 4.2 Methode LAL test Voor het uitvoeren van de LAL test werd gesteund op het protocol dat bij de kit van de LAL test bij hoort. Deze is toegevoegd in bijlage 3. Op enkele zaken na, zijn er aanpassingen aangebracht bij het uitvoeren van de LAL test. Zo werden de hoeveelheden van toe te voegen LAL enzym, substraat en stopreagens verminderd met 30% waardoor er uiteindelijk meer testen konden uitgevoerd worden met gegeven aantal LAL enzym. Zie tabel 6. Bij de LAL testen waarbij de geschiktheid van buffers werd bepaald, werd 35 µl stopreagens toegevoegd. Deze hoeveelheid is nog net binnen de hoeveelheid stopreagens die zeker toegevoegd moet worden, namelijk bij toevoegen van X µl LAL moet er minstens X µl stopreagens worden toegevoegd. Bij verdere LAL testen werd 70 µl stopreagens toegevoegd zoals hieronder weergegeven. 14

21 Tabel 6: Gebruikte testprocedure voor de LAL test, met modificaties t.o.v. van het protocol van de fabrikant (Lonza) dat zich in bijlage 3 bevindt. Sample Test sample of standaard op C 35 µl LAL 35 µl Mix en incubeer op (37±1) C 10 minuten Substraat oplossing op (37±1) C 70 µl Mix en incubeer op (37±1) C 6 minuten Stop reagens (SDS of 25%azijnzuur) 70 µl Mix onmiddellijk Totaal volume 210 µl 4.3 Materiaal TiO 2 proef Titaniumdioxide (TiO 2 ) Er werd gekozen voor TiO 2 korrels (Aerolyst 7710 van het merk Evonik) omdat ze makkelijk zijn in gebruik en ook de mogelijkheid hebben om in de oven te worden gestoken. Dit werd dus ook gedaan om ze endotoxinevrij te hebben. Hiervoor werden ze gedurende 30 minuten op 250 C verwarmd. Door deze behandeling verdwijnen echter alle hydroxylgroepen die normaal op het TiO 2 oppervlak gebonden zijn. Daarom werden de korrels, alvorens gebruikt in de proef, terug in pyrogeenvrij milli Q water gelegd zodat ze terug hydroxylgroepen kunnen binden PM ˆ Printex 12 De eerste PM bron is Carbon Black Italia S.R.L van evonik. Een andere naam hiervoor is Printex 12. Hiervan werd 19.9 mg afgewogen. ˆ Vlamroet 101 Een tweede PM bron is vlamroet 101 waarvan verdere eigenschappen weergegeven worden in tabel 7. Er werd exact 20 mg afgewogen. Tabel 7: Eigenschappen van de gebruikte PM. Vlamroet 101 Kontrolnummer Fabrikant evonik Naam Carbon Black GmbH LPS De eigenschappen van de gebruikte LPS vindt u hieronder terug. 15

22 Tabel 8: Eigenschappen van de gebruikte LPS. Organisme Fabrikant SKU-pack size Zuiveringsproces Onzuiverheden Prijs LPS lipopolysachariden van Pseudomonas aeruginosa 10 Sigma Aldrich L MG Gezuiverd door trichlooracetaat zuur extractie 1-10% proteı nen (Lowry) euro Glaswerk Glazen horlogeglazen met een diameter ± 5 cm, die gedurende 30 min op 250 C in een oven hebben gezeten. 4.4 Methode TiO2 proef Voor de eigenlijke TiO2 proef wordt volgens het volgende protocol gewerkt. Eerst worden bepaalde endotoxinevrije horlogeglazen gevuld met 1g TiO2. Omdat de TiO2 korrels eerst gehydrateerd moeten worden (nadat ze in de oven werden gestoken), wordt overal 4 ml milli Q water in gedaan. Dit wordt ook met de glazen gedaan die geen TiO2 bevatten om de concentraties hetzelfde te houden. Vervolgens wordt ook 4 ml van de te testen samples toegevoegd. Sommige van deze glazen worden vervolgens met UV belicht. De belichting gebeurt in de laminaire flow kast door de UV modus aan te schakelen om zo endotoxinecontaminatie te beperken. De horlogeglazen die niet belicht worden, worden ook in deze kast geplaatst (om steriel te blijven), maar dan onder een doos, zodat het UV licht er niet aan kan. Vervolgens wordt de belichtingstest gestart en wordt na 1 uur, respectievelijk 14 uur, telkens 2 keer 35 µl gepipetteerd uit het staal in een microplaat. Hiervan kan vervolgens d.m.v. de LAL test, de endotoxineconcentraties bepaald worden. Dit wordt dan vergeleken met de begin hoeveelheid endotoxine die in de stalen aanwezig was. In figuur 7 wordt de proefopstelling van de proef weergegeven. Figuur 7: Overzicht van de proefopstelling. Onder de doos bevinden zich de schaaltjes die niet met UV belicht mogen worden. 16

23 4.5 Materiaal staalname Coreolis air sampler Om luchtstalen te nemen waarvan de endotoxineconcentratie bepaald kon worden, werd de coreolis air sampler gebruikt. Dit is een apparaat dat lucht aanzuigt met een bepaald debiet en door een recipiënt stuurt dat gevuld is met een vloeistof om staal in te nemen. Bij het nemen van de stalen werd voor gebruik de gekromde buis en het opzetstuk geautoclaveerd, echter niet endotoxinevrij gemaakt wegens niet mogelijk. Als recipiënt werd een bijhorend plastiek opvangbekertje gebruikt dat voor gebruik met ethanol werd gereinigd. Deze laatste kon ook niet endotoxinevrij gemaakt worden. Er werd in verschillende buffers (zie 4.1.1) staalgenomen. Figuur 8: Coreolis air sampler [7]. 17

24 5 Resultaten en bespreking De eerste doelstelling van dit bachelorproject over microbiële endotoxines als component van fijn stof is een beter inzicht te krijgen in de interactie tussen endotoxines en fijn stof, en de implicaties daarvan voor onze gezondheid. De tweede, daarmee samenhangende, doelstelling is om te onderzoeken of endotoxines geneutraliseerd kunnen worden met behulp van fotokatalyse door TiO 2, en of de interactie met fijn stof een invloed heeft op deze mogelijke neutralisatie. Omdat we endotoxines onderzoeken in de context van hun effect op de gezondheid hebben we gebruik gemaakt van de LAL test als bio-assay. We zijn namelijk niet zozeer geïnteresseerd in aantallen van endotoxines, maar wel in de activiteit ervan. Deze activiteit wordt gekwantificeerd door middel van de LAL test. Tijdens het uitvoeren van de experimenten zijn we ons echter vragen beginnen stellen bij de correctheid van de LAL test, waardoor de derde doelstelling van dit project is om een aantal aspecten van deze test te controleren. 5.1 Zoektocht naar een geschikte buffer Een geschikte buffer vinden voor de LAL test is niet evident. De buffer moet immers 100% endotoxinevrij zijn en mag niet interfereren met de enzymes van de test (zie 2.2.2). Ook zijn endotoxines relatief gevoelig voor phwijziging [44], dus zowel voor onze experimenten als voor verder onderzoek rond endotoxines aan de universiteit Antwerpen, moest een buffer gevonden worden die tijdens staalname de ph wijziging kan opvangen. Omwille van al deze redenen hebben we redelijk wat tijd besteed aan het vinden van een goede buffer voor de verdere experimenten. We hebben van verschillende buffers getest of de ph veranderde tijdens de staalname, of er interferentie optrad tussen de buffer en de LAL test, en of de buffers endotoxinevrij waren. De buffers die we getest hebben waren een Tris buffer en een PBS buffer, zoals beschreven bij materiaal en methode. Met elke buffer werden twee verschillende stalen genomen. In tabel 9 worden de exacte omstandigheden van de staalname weergegeven, alsook de ph en het volume van het recipiënt, zowel voor als na de staalname. Het belangrijkste wat opvalt aan deze tabel is dat de ph door de staalname maar zeer beperkt verandert. Dit geldt voor beide stalen die genomen werden met de PBS buffer, en ook voor beide stalen die genomen werden met de Tris buffer. Tabel 9: Overzicht staalname 1. Sample PBS 1 Tris 1 PBS 2 Tris 2 ph buffer: voor ph buffer: na Volume buffer: voor 15 ml 15 ml 15 ml 15 ml Volume buffer: na ml ml ml ml Datum 05/03/ /03/ /03/ /03/ Coördinaten: ( NB, OL) - Naast de UA Groenenborger waaronder de Craeybeckxtunnel loopt Locatie - In buitenlucht, op grasveld met enkele bomen/struiken - Op 10m afstand is er een fietspad: ± 5 personen/15 minuten passeren - De zon scheen, temp ± 8 C (schaduw) - Windsterkte ± 5 knopen, staal werd genomen in richting vd wind (Z-O) Tijd 10:30-10:50 10:56-11:16 11:17-10:37 11:40-12:00 Tijdsduur 20 min 20 min 20 min 20 min Debiet van coreolis air sampler 300 L/min 300 L/min 300 L/min 300 L/min Opmerkingen -De metalen buis was geautoclaveerd voor gebruik -Er zijn 3 vliegen in het staal gekomen tijdens staalname 18

25 De resultaten van de LAL testen worden weergegeven in tabel 10. De LAL activiteiten van de negatieve controles tonen aan dat de Tris buffer in grote mate vervuild was met endotoxines, en dat ook de PBS buffer wat endotoxine activiteit vertoonde, zij het dan minder dan de Tris buffer. De endotoxine activiteit van de stalen genomen met Tris buffer bleek veel lager dan de negatieve controle, terwijl we zouden verwachten dat er door de staalname net endotoxines zijn bijgekomen. Er zijn volgens ons drie mogelijke verklaringen voor deze vaststelling. Ofwel heeft de procedure van de staalname een groot aantal endotoxines afgebroken, bijvoorbeeld door het heftig mixen van de buffer tijdens de staalname. Ofwel hebben een aantal stoffen uit de lucht die in het staal terecht zijn gekomen endotoxines afgebroken of geïnactiveerd. Een derde optie is dat stoffen uit de lucht de LAL test zelf sterk hebben geïnhibeerd. De resultaten van het spiken lijken steun te bieden voor de laatste verklaring, namelijk inhibitie van de LAL test. Bij het toevoegen van de spike werden de stalen telkens een klein beetje verdund. Deze verdunning werd dan verrekend na het resultaat van de LAL test, om de gespikete stalen met de ongespikete te kunnen vergelijken. Eventuele stoffen in het staal met een inhiberende werking werden dus mee verdund, wat in de gespikete stalen een afname van de inhibitie zou veroorzaken. Een afname van inhibitie betekent dan weer een grotere endotoxine activiteit volgens de LAL test. Er werd gespiked met 0.49 EU/mL. Bij de buffers waarmee een luchtstaal was genomen werden na het spiken echter stijgingen van meer dan het dubbele van de verwachte waarde opgemerkt. De stalen genomen met Tris buffer stegen gemiddeld met 1.83 EU/mL, en de stalen genomen met PBS buffer met 1.4 EU/mL. Deze vaststelling zou dus te wijten kunnen zijn aan de verdunning van de inhiberende stoffen. Om die reden is onze inhibitiehypothese een mogelijke verklaring voor de extra toename in endotoxine activiteit van de spike. Tabel 10: Endotoxine activiteit van de buffers voor en na staalname. Er werd telkens ook gespiked met 0.49 EU/mL om te testen voor inhibitie. Voor de luchtstalen werd de LAL test niet in dubbel uitgevoerd, daarom konden bij deze resultaten geen betrouwbaarheidsintervallen berekend worden. Endotoxine activiteit Endotoxine activiteit Verschil (EU/mL) zonder spike (EU/mL) met spike (EU/mL) Tris buffer (neg controle) 33 ± 3 34 ± 3 (1 ± 4) PBS buffer (neg controle) 0.19 ± ± ± 0.1 Tris buffer staal Tris buffer staal gemiddelde 3 ± 1 5 ± ± 0.04 PBS buffer staal PBS buffer staal gemiddelde 2 ± 1 3 ± ± 0.2 Omdat beide geteste buffers vervuild bleken met endotoxines, en een endotoxinevrije buffer cruciaal was voor onze experimenten, werd besloten een endotoxinevrije DPBS buffer te bestellen. Ook deze buffer werd gecontrolleerd op ph stabiliteit tijdens de staalname, en ook hier bleek de buffer de ph wijzinging goed op te vangen, zoals te zien is in tabel

26 Tabel 11: Overzicht staalname 2. Sample DPBS(staal 1) DPBS (staal 2) ph buffer: voor ph buffer: na Volume buffer: voor 15 ml 15 ml Er is in het midden van de tijdsduur van de staalname terug tot 15 ml aangelengd om grote fluctuaties in ph te vermijden Volume buffer: na 20 min ±10 ml ±10 ml staalname Datum 26/03/ /03/ Coördinaten: ( NB, OL) - Naast de UA Groenenborger waaronder de Craeybeckxtunnel loopt - In buitenlucht, op grasveld met enkele bomen/struiken - Op 10m afstand is er een fietspad: ± 5 personen/15 minuten passeren Locatie - De zon scheen, temp ± -1 C (schaduw) - Om er voor te zorgen dat het niet bevroor, werd rond het staal een beker met warm water gezet tijdens de staalname. - Windsterkte ± 4-7 knopen (alle richtingen), staal werd genomen in richting (Z-O) Tijd 10:07-10:27 10:29-10:49 Tijdsduur 20 min 20 min Debiet van coreolis air sampler 300 L/min 300 L/min Opmerkingen -De metalen buis was geautoclaveerd voor gebruik De resultaten in tabel 10 moeten met een zekere omzichtigheid geïnterpreteerd worden, om verschillende redenen. Ten eerste is de LAL reactie bij deze testen bij een suboptimale temperatuur doorgegaan, namelijk bij 25 C in plaats van 37 C, door een fout bij het gebruik van het warmteblok. De ijklijn was echter vrij goed, met een R 2 waarde van Ten tweede geeft de LAL test enkel een lineair verband tussen absorptie en endotoxine activiteit tussen 0.1 en 1 EU/mL. Op één resultaat na vallen al de waarden uit tabel 10 buiten deze lineaire range. Omwille van deze twee redenen kunnen de resultaten van dit experiment enkel gezien worden als een indicatie. 5.2 Neutralisatie van LPS en PM met TiO 2 In dit experiment onderzochten we de hoofdvragen van het project, namelijk of de interactie met fijn stof een invloed heeft op de toxiciteit van endotoxines, en of endotoxines in zowel de vrije vorm als de PM-gebonden vorm geneutraliseerd kunnen worden door fotokatalyse met TiO 2. We maakten daarvoor gebruik van vlamroet 101 als artificiële PM omdat deze beter in suspensie bleef dan printex 12. Als endotoxine werd LPS gebruikt van Pseudomonas aeruginosa. Er werden oplossingen gemaakt met PM, met LPS, en met LPS+PM, steeds in DPBS buffer. Deze oplossingen werden dan op drie verschillende manieren behandeld: bestraling met UV licht, contact met TiO 2 korrels, en de combinatie van beide. Vóór de behandeling, na één uur van de behandeling en na veertien uur werd op de drie oplossingen een LAL test uitgevoerd. Ter controle werd de LPS+PM oplossing ook gemeten na één uur en na veertien uur zonder behandeling. De resultaten worden weergegeven in tabel 12 en grafisch voorgesteld in figuur 9. Wanneer we kijken naar de endotoxine activiteiten voor het doorgaan van de reactie (de rij 0u in de tabel), zien we dat de LPS+PM oplossing een lagere endotoxine activiteit vertoonde dan de oplossing met enkel LPS, hoewel deze oplossingen dezelfde concentratie aan LPS bevatten. De PM gebonden endotoxines lijken dus minder reactief te zijn dan de vrije endotoxines. Na één uur reageren met TiO 2 korrels of UV licht had de LPS+PM oplossing ook minder afbraak ondergaan dan de LPS oplossing, zoals duidelijk te zien is op de grafiek. Ook na veertien uur UV bestraling waren de PM-gebonden LPS moleculen veel minder afgebroken dan de vrije LPS moleculen. Een verklaring 20

27 hiervoor zou kunnen zijn dat het reactieve lipide-a gedeelte van LPS door PM wordt afgeschermd, wat zowel de reactiviteit van de LPS moleculen als de mate van afbraak beperkt. Uit deze resultaten blijkt ook dat na veertien uur zowel de behandeling met TiO 2 als met UV licht als met de combinatie van beiden effectief waren in het neutraliseren van endotoxines. De behandeling met TiO 2 en UV licht had duidelijk het sterktste resultaat. De LPS+PM oplossing vertoonde na één uur van de controle behandeling (geen TiO 2 en geen UV) een grotere activiteit dan voor de behandeling. Een mogelijke verklaring hiervoor is dat het in de oven plaatsen van de schaaltjes gedurende 30 minuten bij 250 C niet volstond om alle endotoxines af te breken en de schaaltjes dus met andere woorden vervuild waren. Wanneer we van deze veronderstelling uitgaan, waren de behandelingen met TiO 2 en UV na één uur ook al effectief, aangezien de hoeveelheden endotoxines na de meting van 0u nog waren gestegen door het in de schaaltjes gieten van de oplossingen. De resultaten van één uur behandeling met TiO 2 en UV zijn jammer genoeg niet gelukt. Tabel 12: Endotoxine activiteiten van oplossingen met LPS, PM, LPS+PM en een negatieve controle (buffer). De reactie met TiO 2 en UV werd getest, maar ook met enkel UV en enkel TiO 2. Activiteiten werden gemeten voor de reactie, na één uur van de reactie en na veertien uur van de reactie. Bij de controle meting van 14u geen behandeling, lagen de dubbels heel ver uit elkaar. Alle activiteiten zijn in EU/mL. Negatieve controle PM LPS LPS+PM 0u 0.33 ± ± ± ± 0.1 1u geen TiO 2, geen UV 1.60 enkel TiO ± ± ± ± 0.1 enkel UV 0.30 ± ± ± ± 0.1 titaan + UV 14u geen TiO 2, geen UV (0.43) enkel TiO ± ± ± ± 0.07 enkel UV 0.15 ± ± ± 0.08 titaan + UV 0.12 ± ± ± ± 0.07 Ook bij deze experimenten moeten een aantal zaken in het achterhoofd gehouden worden. Net als bij het vorige experiment met de verschillende buffers zijn ook hier de LAL reacties doorgegaan bij 25 C in plaats van 37 C. Maar ook hier was de ijklijn een degelijke fit: de R 2 waarde bedroeg Een kwalitatieve interpretatie van de resultaten is dus zeker mogelijk. Wat ook een moeilijkheid was bij het interpreteren van deze resultaten was het gebrek aan degelijke controles om mee te vergelijken. Hoewel het sterk lijkt dat de controlebehandeling zonder TiO 2 en zonder UV een afname van het endotoxine activiteit zou veroorzaakt hebben, had het toch interessanter geweest als we de afbraak door de verschillende behandelingen met een controle behandeling hadden kunnen vergelijken. Daarom is het heel jammer dat van de twee controles die wel getest werden, er één mislukt is (14u LPS+PM). 21

28 a) b) c) Figuur 9: Resultaten van de LAL testen na 0 uur en 14 uur behandeling met TiO 2 korrels (a), UV licht (b) en TiO 2 in combinatie met UV (c). 5.3 Wordt de LAL test geïnhibeerd? De resultaten van de testen met verschillende buffers leken te suggereren dat de LAL test geïnhibeerd werd door stoffen in het staal. We besloten daarom deze inhibitiehypothese te testen in een extra experiment. In het geval dat de LAL test niet geïnhibeerd zou worden, verwachten we dat wanneer we een staal met gekende LAL activiteit verdunnen met een bepaalde factor, de LAL activiteit met diezelfde factor zal afnemen. In het geval van inhibitie is dat niet het geval: we verdunnen dan niet alleen het aantal endotoxines, maar ook het aantal inhibitoren. De verdunning van het aantal endotoxines zorgt natuurlijk voor een lager resultaat van de LAL test, maar het verminderen van de inhibitie door de verdunning zal de LAL reactie dan weer steker doen doorgaan. Daardoor kan het in principe zelfs zo zijn dat de LAL activiteit door een staal te verdunnen zelfs vergroot. De resulaten van deze proef staan in tabel 13 samengevat. Ze steunen duidelijk de inhibitiehypothese. De endotoxine activiteit was na verdunning telkens hoger dan voorspeld was op basis van de verdunningsfactor. Staal 2 gaf na vier maal te verdunnen zelfs een hogere endotoxine activiteit dan het onverdunde staal. Wat ook opviel was dat het effect afnam bij verdere verdunning: wanneer het al zes maal verdunde staal 1 nog extra verdund werd, werd het verschil tussen de voorspelde activiteit en de gemeten activeit kleiner. Het effect van de verminderde inhibitie door de verdunning bleef echter nog steeds duidelijk zichtbaar. 22

29 Table 13: De gemeten endotoxine activiteit na verdunning, en de verwachte activiteit na verdunning op basis van de verdunningsfactor. Alle activiteiten zijn in EU/mL. De onverdunde stalen werden niet in dubbel getest, daarom konden bij deze resultaten geen betrouwbaarheidsintervallen berekend worden. Verdunningsfactor Activiteit (EU/mL) Verwachte activiteit na verdunning (EU/mL) Staal 1 onverdund 7.4 Staal 1 verdund 1/6 4.4 ± Staal 2 onverdund 3.2 Staal 2 verdund 1/4 4.4 ± Staal 1 verdund 4.4 ± 0.1 Staal 1 extra verdunning 1 6/7 4.1 ± ± 0.1 Staal 1 extra verdunning 2 5/7 3.9 ± ± Problemen met het LAL protocol Tijdens de uitvoering van de LAL testen bij de voorgaande experimenten werden we geconfronteerd met een aantal problemen die we niet onmiddellijk konden verklaren. Zo kwamen we steeds een hoeveelheid LAL enzymes en chromogenisch substraat tekort tijdens de uitvoering van de LAL testen, terwijl we het aantal testen dat we konden doen met de gegeven hoeveelheden telkens nauwkeurig hadden berekend met een vrij grote veiligheidsmarge. Door dit acute gebrek aan enzymes zijn een aantal testen mislukt. Een tweede probleem was dat onze absorptiewaarden zeer laag waren. Om een verklaring te vinden voor de grote hoeveelheden LAL reagentia die leken te verdwijnen besloten we een aantal kleine testjes te doen. Een kleine hoeveelheid reagentia leek volgens een eerste test verloren te gaan door het overkappen vanuit de flesjes in de pipetteerbakjes en omgekeerd, maar het ging niet om onverwachts grote hoeveelheden. In een tweede test keken we naar het effect van verdamping. De reagentia bevonden zich tijdens de LAL testen namelijk steeds gedurende ongeveer een half uur in een pipetteerbakje met een vrij groot verdampingsoppervlak, en de lampen van de laminaire flow kast stonden steeds aan. Daarom deden we een kort experiment, waarbij we acht bakjes met water een half uur onder de laminaire flow kast lieten staan. De bakjes waren verdeeld over twee condities: vier bakjes werden bedekt met aluminiumfolie en vier bakjes niet. Vervolgens lieten we iemand zo veel mogelijk eenheden van 35 µl pipetteren uit elk bakje, zonder dat die persoon wist welke bakjes bedekt waren geweest door de folie. De resultaten staan in tabel 14. Een t-test voor ongepaarde waarnemingen met gelijke varianties gaf aan dat de beide behandelingen significant verschilden (p=0.0027). Er waren dus op een half uur tijd ongeveer twee LAL testen verdwenen enkel en alleen door verdamping van de reagentia. Tabel 14: Het aantal keer dat 35 µl water kon gepipetteerd worden uit bakjes met ml (het maximum was dus 40 keer). De helft van de bakjes werd een half uur beschenen door de lamp van de laminaire flow kast, de andere helft werd bedekt door aluminium folie. licht donker resultaten gemiddelde

30 Een tweede probleem waar we tijdens de experimenten mee geconfonteerd werden waren lage absorptiewaarden. De laatste stap van de LAL reactie is de omzetting van een chromogenisch substraat in p-nitroalanine. Deze laatste stof absorbeert in het zichtbare gebied, met een maximum volgens Lonza bij 405 nm. Omdat wij steeds lage absoptiewaarden verkregen besloten we zelf eens te onderzoeken wat het absorptiemaximum van p-nitroalanine was. Volgens een scan bij alle golflengtes van 350 tot 450 nm lag het absorptiemaximum bij 386 nm, zoals te zien is op figuur 10. Onze lage absorptiewaarden bleken later veroorzaakt te worden door een sub-optimale reactietemperatuur bij de LAL test, maar de vaststelling dat er niet bij het absorptiemaximum wordt gemeten bij de LAL test blijft desondanks interessant. Figuur 10: Absorptie van p-nitro alanine bij golflengtes van 350 tot 450 nm. Als blanco werd de zuivere buffer genomen. 24

31 6 Discussie 6.1 De interactie tussen endotoxines en fijn stof De resultaten van ons experiment lijken te suggereren dat fijn stof het aantal endotoxines die de LAL test initieert reduceert. Dit wil zeggen dat wanneer zowel endotoxines als fijn stof in een staal aanwezig zijn, een aantal endotoxines zullen binden op fijn stof en mogelijk zo dus ontoegankelijk worden om de LAL enzymes van de LAL test te stimuleren. Een mogelijke verklaring hiervoor is dat bij de binding tussen LPS en PM het lipide-a gedeelte, dat het pro-inflammatoire karakter van LPS bepaalt, zich aan de binnenkant bevindt van het PM-LPS complex. Daardoor is het lipide-a deel minder toegankelijk voor de enzymes van de LAL test. Thermodynamisch gezien is dit een logisch model voor de binding, aangezien op die manier het hydrofobe lipide-a deel minder in contact staat met water. De implicatie van dit soort van binding tussen LPS en PM voor onze gezondheid, is dat PM-gebonden LPS ons immuunsysteem minder zou activeren en daardoor ook minder schadelijk zou zijn. Echter een kanttekening die hierbij gemaakt moet worden is dat nog niet goed geweten is hoe fijn stof ons lichaam binnendringt. Het zou immers kunnen zijn dat net door het binden van endotoxines op fijn stof, en het vlot doordringen van fijn stof in onze longen, er zo ook meer endotoxines in onze longen kunnen binnendringen. Dit zou er net voor kunnen zorgen dat het pro-inflammatoire effect van endotoxines toch verhoogd wordt door binding op fijn stof, ondanks dat de LAL test aangeeft dat het minder pro-inflammatoir is. Een belangrijke kritische noot die we moeten aanhalen bij het uitvoeren van deze experimenten, is dat we steeds met oplossingen hebben gewerkt, hoewel we zijn vertrokken van componenten in de lucht. Het is dus zo dat de conclusies uit ons onderzoek niet zomaar veralgemeend kunnen worden voor componenten in de lucht. We weten namelijk niet of de binding endotoxine-fijn stof in de lucht gevormd wordt, en als deze gevormd wordt, deze ook nog hetzelfde blijft wanneer er overgegaan wordt naar de vloeistoffase. Ook kunnen we ons afvragen of de binding endotoxine op fijn stof altijd dezelfde is en hoe deze er chemisch juist uitziet. Hiervoor zouden verdere onderzoeken uitgevoerd kunnen worden zoals besproken zal worden in de toekomstperspectieven. Het zou ook kunnen dat de binding verschilt tussen verschillende soorten fijn stof. In dit project hebben we gebruik gemaakt van vlamroet als model voor fijn stof. De exacte samenstelling van dit vlamroet weten we niet, maar we gaan er van uit dat deze voornamelijk bestaat uit elementaire koolstof. Deze PM bron is dus niet representatief voor echt fijn stof aangezien fijn stof meer heterogeen is qua samenstelling. Denk maar aan de metalen of organische componenten die ook aanwezig zijn in fijn stof uit de atmosfeer. Een betere koolstofbron zou daarom bijvoorbeeld het roet zijn dat afkomstig is van dieselmotoren. Uit een artikel waarin de samenstelling van dieselroet bekeken wordt, rekening houdend met verschillende parameters zoals verdunning en belasting, blijkt dat dieselroet namelijk naast elementaire koolstof ook vluchtige organische componenten en metalen bevat [45]. De samenstelling van dieselroet is dus heterogener dan die van vlamroet, waardoor dit een betere bron voor fijn stof zou kunnen zijn om experimenten met te doen in het labo. Echter, dit volstaat niet voor de experimenten met endotoxines. Het is namelijk zo dat om experimenten met endotoxines uit te voeren, het belangrijk is dat de fijn stof bron endotoxinevrij is, of gemaakt kan worden. Voor elke fijn stof bron dat dus gebruikt wordt, zou bepaald moeten worden of de bron endotoxinevrij is. Dit is iets wat we met onze PM bron vlamroet, niet hebben kunnen bepalen waardoor ook dit tot contaminatie zou geleid kunnen hebben. Echter uit de resultaten kon dit niet significant aangetoond worden. 25

32 6.2 Is de veelgebruikte LAL test betrouwbaar? Er zijn verschillende problemen waar we in contact mee zijn gekomen bij het uitvoeren van de LAL test. Hieronder worden deze kort aangehaald en wordt een mogelijke oplossing voorgesteld Interferentie 30 jaar geleden heeft de U.S. Department of Health and Human Services - Food and Drug Administration (FDA), het gebruik van de LAL test aanvaard i.p.v. de pyrogene test op konijnen [46]. Zoals uitgelegd in de literatuurstudie zijn er verschillende varianten van de LAL test. De richtlijnen van de FDA voor het uitvoeren van de LAL test, beschrijven dat bij het uitvoeren van de LAL test rekening moet worden gehouden met interferentie. Het is namelijk zo dat nogal wat componenten kunnen interfereren met de LAL test zoals β-glucaan [3], en dat de controle op interferenten van gebruikte vloeistoffen, zoals buffers, noodzakelijk is alvorens de LAL test uit te voeren [46]. Echter β-glucaan is een stof die ervoor zorgt dat we de werkelijke endotoxineconcentratie overschatten. Het omgekeerde kan ook voorkomen, namelijk dat er in de lucht zelf ook componenten zitten die de LAL test negatief kunnen beïnvloeden. Dit leek bij onze luchtstalen het geval te zijn. Ook een studie uit Iran uit 1996 ondervond dat hun LAL testen geïnhibeerd werden [47]. De onderzoekers schreven de inhibitie toe aan een aantal kationen uit de lucht. Deze componenten komen tijdens de staalname mee in het staal terecht, waar ze de LAL enzymes mogelijk (ongunstig) kunnen beïnvloeden. We konden jammer genoeg geen volledige tekst van hun artikel bemachtigen om te weten te komen om welke kationen het juist ging. Interferentie, zowel positief als negatief, kan enkel opgemerkt worden indien er gespiked wordt. Vandaar dat dit wel een belangrijke procedure is die zeker en vast altijd moet uitgevoerd worden. Uitschakelen van interferentie bij LAL test Uit onze resultaten kon vastgesteld worden dat de LAL test geïnhibeerd werd. Opvallend was wel dat deze inhibitie kleiner werd naarmate er meer verdund werd zie 5.3. Voldoende verdunnen is dus essentieel bij deze test om de effecten van interferentie (in ons geval inhibitie) weg te werken. Ook de Iraanse onderzoekers die een inhiberend effect ondervonden wezen op het belang van voldoende verdunnen als oplossing voor deze inhibitie [47]. Andere methoden die gebruikt kunnen worden om deze interferentie weg te werken zijn opwarming en neutralisatie, maar deze methoden zijn nog niet gestandariseerd voor luchtstalen en moeten dus nog gevalideerd worden. [48]. Daarnaast is ook de recombinant factor C test gebruiken i.p.v. de LAL test een mogelijk oplossing. Deze test maakt namelijk gebruik van een gemodificeerd substraat dat enkel endotoxine kan triggeren. Hierdoor worden interferenten zoals β-glucaan uitgeschakeld. Deze test heeft daarnaast ook een breder bereik dan alle LAL testen, namelijk EU/mL, en maakt geen gebruik van levende krabben waardoor de reactiviteit van het reagens altijd hetzelfde is. Hierdoor kunnen de gemeten endotoxinegehaltes ook beter met elkaar vergeleken worden. Er zijn daarnaast ook chemische analysetechnieken mogelijk zoals gaschromatografie en massaspectrometrie om het endotoxinegehalte te bepalen. Deze zouden tot meer correcte/accurate resultaten kunnen leiden voor endotoxineconcentratie dan de bio-assays. Echter een beperking van te werken met chemische analysemethoden, is dat er geen rekening meer wordt gehouden met de pro-inflammatoire capaciteit van de endotoxines. Bij de bio-assay is de reactie die doorgegaan is bij de LAL test een rechtstreekse maat voor het pro-inflammatoire karakter. Ook stelt zich het probleem van hoe er efficiënte en goedkope kolommen gemaakt kunnen worden waarover bij gaschromatografie het staal gestuurd kan worden (onder hoge druk en temperatuur). Er zouden kolommen gemaakt kunnen worden die interageren met het lipide-a gedeelte, maar in hoeverre dit allemaal mogelijk is zou 26

33 onderzocht moeten worden. Voor het O-antigeen zou dit te complex worden aangezien dit gedeelte varieert tussen endotoxines. Er moet ook rekening gehouden worden met het feit dat vele endotoxines aan glaswanden blijven plakken. Dus moet er verzekerd worden dat al deze endotoxines ook weer uit deze kolom komen Belang van het meten bij de juiste golflengte Een ander probleem waar we mee geconfronteerd werden, was bij het meten van de absorptie na het uitvoeren van de LAL test. Zo schreef het protocol van de fabrikant Lonza (zie bijlage 3) voor dat dit bij een golflengte van nm moet gebeuren. Wij hebben echter getest waar het optimum van de absorptie bereikt werd, en deze was bij een lagere golflengte van 386 nm (zie 5.4). De reden waarom niet bij de optimale golflengte gemeten wordt bij de LAL test is niet onmiddellijk duidelijk. Een mogelijke verklaring is dat andere frequent voorkomende stoffen in de lucht ook een absorptie vertonen rond 390 nm, en dat het gebruik van een andere golflengte daarom noodzakelijk is om interferentie bij de absorptie te beperken Gevolgen van verdamping Wanneer er bij het uitvoeren van de LAL test gewerkt wordt onder de laminaire flow kast, is het zo dat er verdamping van de oplossingen met LAL reagentia optreedt, zoals reeds besproken in 5.4. De consequentie hiervan is niet enkel dat niet alle geplande LAL testen uitgevoerd konden worden, maar dat dit ook een impact had op de resultaten van onze proeven. Het is namelijk zo dat zowel in de microplaat als de pipetteerbakjes verdamping optrad en dat hierdoor de concentratie niet meer dezelfde was als gepland. Aangezien we gewerkt hebben met zeer kleine hoeveelheden in de microplaat, waar dus ook verdamping bij kan optreden, kan dit enorme gevolgen hebben met betrekking tot de resultaten. Doordat er niet exact geweten is hoeveel er juist verdampt is, kan dit ook niet meegenomen worden bij de resultaten. Het belangrijkste dat hieruit geleerd kan worden is dat hier zeker rekening mee moet worden gehouden bij het uitvoeren van de LAL test. Zoals vermeld zal worden in het ingenieur-technische deel (zie 6.5), werd er een eigen protocol opgesteld om de LAL test uit te voeren. In dit protocol wordt rekening gehouden met alle aspecten die volgens ons verbeterd konden worden waaronder deze verdamping. We stellen in het protocol voor om verdamping tegen te gaan door elke keer de pipetteerbakjes af te dekken met zilverpapier. 6.3 Endotoxinevrij werken Met betrekking tot de uitgevoerde experimenten hebben we meerdere keren gemerkt dat endotoxinevrij werken niet evident is. Niet alleen moet het gebruikte materiaal en al de stoffen endotoxinevrij zijn, maar moet ook de lucht endotoxinevrij zijn. Daarom moet er steeds, wanneer er met endotoxines gewerkt wordt, gewerkt worden in een laminaire flow kast waarvan we weten dat deze pyrogeenvrij is. Wat we niet weten is in hoeverre deze ook endotoxinevrij is. Een alternatief voor de laminair flow kast zou zijn om te werken in een cleanroom. Dit is een omgeving, die vooral gebruikt wordt voor industriële productie of wetenschappelijk onderzoek, waarbij een zo laag mogelijke hoeveelheid vervuiling, zoals stof, in de lucht aanwezige micro-organismen, fijn stof of chemische dampen aanwezig mag zijn. Of anders gezegd, een cleanroom heeft een gecontroleerde hoeveelheid vervuiling wat gespecificeerd wordt door het aantal deeltjes per kubieke meter van een specifieke omvang. Vooral bij fabricatie van geneesmiddelen of halfgeleiders wordt deze veel gebruikt [49, 50]. Een ander probleem dat typisch is aan endotoxinevrij werken, is dat al het gebruikte glaswerk en materiaal 27

34 endotoxinevrij moet zijn. Voor niet-volumetrisch glaswerk is dit niet zo moeilijk aangezien dit met zilverpapier kan ingepakt worden en vervolgens gedurende 30 minuten op 250 C kan gezet worden. Zo zouden alle endotoxines worden afgebroken. Maar zelfs dan waren er aanwijzingen in onze resultaten dat er nog intacte endotoxines aanwezig waren op ons glaswerk (zie tabel 12). Echter voor volumetrisch glaswerk mag deze procedure niet gebruikt worden omdat dit glaswerk anders niet meer correct geijkt is. Daarom werd het volumetrische glaswerk in de afwasmachine gestoken en erna onmiddellijk gebruikt of afgedekt met endotoxinevrij zilverpapier. Om het experiment te verbeteren zou er gebruik gemaakt moeten worden van pyrogeenvrij wegwerpbaar volumetrisch glaswerk. Aangezien dit (momenteel) niet bestaat, is het belangrijk voor toekomstige proeven hiervoor een andere oplossing te vinden. Een extra moeilijkheid die werken met endotoxines teweegbrengt, is dat endotoxines de neiging hebben om overal aan te blijven plakken, voornamelijk aan plastiek en glas. Ook dit maakt het werken met endotoxines er niet makkelijker op omdat er niet geweten is hoeveel er juist blijft plakken. Zelfs aan het gebruikte titaniumdioxide zouden er endotoxines kunnen plakken. Om dit te testen of er endotoxines aan de gebruikte titaniumdioxidekorrels geadsorbeerd zijn, zou er een pellet gemaakt kunnen worden van de korrels, waar vervolgens een infraroodspectrum van kan worden gemaakt. Omwille van een praktisch probleem hebben we dit niet kunnen uitvoeren. Het is namelijk zo dat we na het experiment de korrels niet droog kregen, wat noodzakelijk is om een goede pellet te kunnen maken. We zouden de natte titaniumkorrels op een filtreerpapier kunnen leggen, maar dan zouden de korrels automatisch al endotoxines adsorberen aangezien dit papier niet endotoxinevrij is en er ook geen endotoxinevrij papier of doekjes te verkrijgen is. Ook de korrels in de oven steken is geen optie, aangezien de endotoxines dan weer afgebroken kunnen worden. Een vraag die van belang is voor onze uitgevoerde proeven is natuurlijk of er wel endotoxinevrij gewerkt is. We hebben op alle mogelijke manieren geprobeerd dat te verwezelijken, maar zeker zijn we nooit. Er werd wel steeds met handschoenen en onder de laminaire flow gewerkt, maar sommige zaken waren onvermijdbaar. Bijvoorbeeld voor het afwegen van de TiO 2 kon niet onder de laminaire flow gewerkt worden omdat de weegschaal er niet onder geplaatst kon worden, en deze ook al niet endotoxinevrij zou kunnen gemaakt worden. Ook het werken met het volumetrisch glaswerk was een hiaat. We weten daarnaast ook niet in hoeverre de proeven geïnterfereerd zijn door de lucht uit de laminaire flow kast. Is er een beter experimentele methode mogelijk bijvoorbeeld door de bovenvermelde cleanroom? Deze vragen zijn zeker gesteld tijdens het onderzoek, maar het werken onder de laminaire flow was voor ons de beste (en enige) mogelijkheid. 6.4 Sociaal-economisch Problematiek omtrent luchtvervuiling Wat ook zeker een sociaal aspect is van deze bachelorproef is de grotere problematiek omtrent luchtvervuiling. Iedereen op aarde wordt hier immers met geconfronteerd en ademt deze deeltjes in zonder het te beseffen. Hieronder volgen enkele van de voornaamste bronnen van luchtvervuiling [51]: ˆ Verbranding van fossiele brandstoffen in elektriciteitscentrales, transport, industrie en huishoudens ˆ Industriële processen en solvent gebruikt, bijvoorbeeld in de chemische industrie en mineralen ˆ Landbouw ˆ Afvalbehandeling ˆ Vulkaanuitbarstingen, door de wind meegevoerd stof en de uitstoot van organische stoffen uit planten zijn voorbeelden van natuurlijke emissiebronnen. 28

35 Hierbij horend wordt een kort overzicht gegeven van de bijdrage van verschillende sectoren tot luchtvervuiling [52]. ˆ The energiesector is verantwoordelijk voor 70% SO x en 21% NO x emissie in Europa. ˆ Transport is een belangrijke bron van NO x productie. Daarenboven zijn personenwagens de voornaamste bron van zowel CO, NO x, PM 2.5 en non-methane volatile organic compounds (NMVOCs) in de lucht. ˆ Het energieverbruik door huishoudens is een belangrijke bron voor de emissie van PM 2.5. verbranding van hout en kool. Dit door de ˆ De landouw sector draagt voor 94% bij aan de NH 3 emissie in Europa. In de Bijlage 2 is er een overzicht te vinden van verschillende polluenten en het aandeel van verscheidene sectoren hierop. Om toch voeling te krijgen met het belang van deze problematiek, worden hieronder enkele feiten over luchtvervuiling opgesomd [53]. Deze feiten tonen aan dat er zeker moet ingespeeld worden op dit globaal probleem, zowel op sociaal, politiek als economisch vlak. Zonder de werking van de politiek kunnen er immers nooit richtlijnen opgesteld worden en zonder engagement van industrie en bedrijven is er geen verandering mogelijk. Als sociaal aspect is het belangrijk dat ieder individu een moreel standpunt inneemt, en beseft hoe hiermee moet worden omgegaan. ˆ Luchtvervuiling is een groot omgevingsrisico voor de gezondheid. Door de luchtvervuiling te reduceren, kunnen we landen helpen om de globale ziektenlast van ademhalingsinfecties, hartziekten en longkanker te verlagen. ˆ Hoe lager de niveau s van luchtvervuiling in steden zijn, hoe beter de ademhalings- (zowel lange als korte termijn) als de cardiovasculaire gezondheid van de populatie zal zijn. ˆ Er wordt geschat dat luchtvervuiling binnenshuis bij benadering twee miljoen vroegtijdige sterftegevallen veroorzaakt, meestal in ontwikkelingslanden. Bijna de helft van deze sterftegevallen zijn te wijten aan longontsteking van kinderen jonger dan vijf jaar. ˆ Er wordt geschat dat outdoor stedelijke luchtvervuiling 1.3 miljoen doden wereldwijd per jaar veroorzaakt. Diegenen die leven in landen met een middelmatig inkomen ervaren deze last. ˆ De controle aan blootstelling van luchtvervuilende componenten ligt grotendeels buiten het bereik van individuen en vereisen daarom actie door publieke autoriteiten op zowel nationaal, regionaal als internationaal vlak. ˆ De WHO luchtkwaliteitsrichtlijnen representeren de meest wijde overeenkomsten en up-to-date schattingen van de gezondheidseffecten van luchtvervuiling, welke richtlijnen aanraadt voor luchtkwaliteit waarop de gezondheidsrisico s significant gereduceerd worden. Deze richtlijnen geven aan dat door een reductie van PM 10 vervuiling van 70 naar 20 µg/m 3, zorgt voor een daling van 15% voor luchtkwaliteitsgerelateerde overlijdens. 29

36 6.4.2 Belang van het meten van fijn stof en endotoxinegehalte Metingen van zowel fijn stof als de endotoxineconcentratie in de lucht is van groot belang voor de gezondheid van de mens. Voor Nederland is het zo dat momenteel de methode van de verzwakking van β-straling en van de oscillerende microbalans de meest gebruikte methoden zijn om fijn stof te meten [54]. Deze metingen geven informatie over de massa van het stof in de lucht, maar niet over de samenstelling ervan. Voor de samenstelling van fijn stof, meerbepaald secundair anorganisch aerosol, zwarte rook, zware metalen en benzo[a]pyreen (component PAK s), zijn er nog maar enkele meetstations in Nederland die dit kunnen bepalen[54]. De manier waarop deze gemeten worden gaat ons te ver leiden. Wel is op te merken dat zo n meetstations voor de endotoxinecomponent vandaag de dag nog niet bestaat. Het is momenteel enkel mogelijk om endotoxinegehaltes van de lucht te meten via de LAL test, rfc test en chemische analysemethoden. Het probleem hierbij is dat er grote verschillen in resultaten kunnen ontstaan afhankelijk van wanneer en hoe de staalname is gebeurd. Zo speelt zowel de temperatuur als vochtigheid van het moment van staalname een belangrijke rol, maar ook of de staalname gebeurd is met filters (meestal de glasvezelfilter), impingers (zoals coreolis air sampler) of een passieve monstername. Met passieve monstername wordt bijvoorbeeld een vloerstofmonster in huis bedoeld of passief genomen luchtmonsters met de zogenaamde electrostatic dustfall collector die gebruik maakt van elektrostatische doekjes waarop over een periode van weken stofdeeltjes worden opgevangen. Ook is het zo dat de overheid momenteel de totale hoeveelheid van fijn stof bepaalt, maar nog niet genoeg de samenstelling ervan. Dit is echter wel iets wat in de toekomst verbeterd zou moeten worden aangezien de endotoxinecomponent toch een belangrijke rol speelt in de gezondheidseffecten van fijn stof en is het belangrijk om hierop een zicht te krijgen in functie van de tijd. Uit een nieuwsoverzicht van het medisch milieukundig netwerk uit België blijkt dat de overheid zich er wel al van bewust is dat ook de componenten bepaald moeten worden, echter in hoeverre dit werkelijk al werkt is nog niet duidelijk [55]. Daarnaast vragen we ons af in hoeverre de manier waarop de overheid momenteel endotoxineconcentraties bepaald, namelijk via de LAL test, correct is. Deze test heeft namelijk te maken met enkele beperkingen die hierboven reeds zijn aangehaald waaronder de variatie binnen de LAL enzymes en interferentie van zowel glucaan, ionen als andere componenten. Daarenboven heeft de LAL test een kleiner bereik dan bijvoorbeelde de recombinant factor C test. Er bestaan echter wel mogelijkheden om deze interferentie weg te werken zoals ook hierboven besproken werd, maar bestaat er nog geen gestandaardiseerde procedure voor luchtstalen. Er zou dus volgens ons een gestandaardiseerde methode moeten komen, of gebruik gemaakt worden van een andere test zoals bijvoorbeeld de recombinant factor C test. Ook is het zo dat het van groot belang is dat de meetstations doelbewust geplaatst worden. Zo zou het interessant zijn om meetpunten te plaatsen op locaties waar veel mensen komen/werken waardoor de risico s van endotoxines beter ingeschat kunnen worden. Ook zou het interessant zijn om op plaatsen waar geweten is dat er een hogere endotoxineconcentratie is (bijvoorbeeld agrarisch gebied of dicht bij textielbedrijven) een meetstation te zetten om deze waarden met andere plaatsen, waar de endotoxineconcentratie normaalgezien lager is, te vergelijken. 30

37 6.4.3 Fijn stof, endotoxines en sociale ongelijkheid Verschillen in blootstelling aan fijn stof tussen bevolkingsgroepen In heel deze paper zijn er tal van vragen beantwoord op het gebied van de effecten van blootstelling aan fijn stof op de gezondheid. Verder meer is er ook kort ingegaan op de effecten van endotoxines. Deze studies zijn uitgegaan van hele populaties. Daarin is er geen onderscheid gemaakt tussen verschillen binnen een populatie. Hierbij is het interessant om te onderzoeken of er een verschil zou zijn aan blootstelling van fijn stof tussen verschillende bevolkingsgroepen, leeftijd en sociaal economische status. Het volgende onderzoek Environmental Inequality in Exposures to Airborne Particulate Matter Components in the United States van Environmental health perspectives (ehp) kaart deze punten aan [56]. Lange termijn blootstelling binnen de jaren werd geschat voor 215 volkstellingen. Dit werd gedaan voor PM 2.5 en voor veertien componenten van PM 2.5. Vervolgens werd de blootstelling gewogen aan de hand van de populatie grootte om zo een totale geschatte blootstelling te genereren voor ras/etniciteit, educatie, financiële status, werkgelegenheid, leeftijd en inkomen. De resultaten van dit experiment tonen aan dat de verschillen voor de componenten van PM 2.5 groter zijn dan voor de totale massa PM 2.5. Voor ras/etniciteit is het te zien dat de whites groep de minste blootstelling vertoont. De non-hispanic black daarentegen had een hogere blootstelling voor dertien van de veertien componenten va PM 2.5. Jongeren tussen 0-19 jaar hadden gelijke of hogere waarden voor blootstelling in vergelijking met ouderen. Dit geldt wel niet voor de PM-component sulfaat. Personen met een lagere sociaal-economische status bleken ook een hogere blootstelling te hebben. Het besluit van deze studie is dat de blootstelling aan PM 2.5 componenten verschilt voor ras/etniciteit, leeftijd en sociaal-economische status. Daarom is het voor de hand liggend dat indien sommige van deze componenten meer toxisch zijn dan anderen, dit natuurlijk zal resulteren in grotere gezondheidslasten. Factoren die de blootstelling aan endotoxines bepalen In de vorige sectie zijn de socio-economische effecten van fijn stof besproken. Vervolgens is het ook interessant zijn om te weten wat de verschillen zijn enkel en alleen voor endotoxines. Dit is zeker van belang voor de overheid. Bijvoorbeeld wanneer er een effectieve, gemakkelijk te incorporeren, endotoxine neutralisatietechniek zou bestaan, is het van belang dat de overheid weet waar deze eerst ingevoerd moet worden. Zo kunnen de groepen die het meest kwetsbaar zijn, de meeste blootstelling ondervinden, van hun risico ontdaan worden. Aangezien dit verschilt voor elke soort component van fijn stof, zijn dergelijke studies van groot belang om een beter inschatting te kunnen maken, zeker voor beleidsvoerders. Het volgend onderzoeksartikel Predictors of Endotoxin Levels in U.S. Housing wil nagaan welke parameters de endotoxineconcentratie in huisstof bepaalt. Voorgaande studies zijn meestal beperkt tot een welbepaalde geografisch gebied, een demografische groep, een type behuizing of een specifieke plaats in huis. De onderzoekers van dit artikel stellen de representativiteit van dergelijk onderzoek in vraag. Ze gaan er van uit dat een studie uitgevoerd voor de eetkamer, niet direct veralgemeend kan worden voor elke plaats in huis. Er zijn namelijk veel meer parameters die belangrijk zijn voor de endotoxineconcentratie. Zo concludeert het artikel dat de concentratie endotoxine in huisstof afhangt van locatie in huis, regio in het land, aantal kinderen en meer bewoners, aantal honden, lager opleidingsniveau, armoede, waargenomen voedselresten, aanwezigheid van kakkerlakken, bewijs dat er gerookt wordt, et cetera [57]. Dit artikel kaart duidelijk ook het socio-economische verhaal aan van endotoxines. Dit is zeker van groot belang. Door dit nieuw inzicht, dat endotoxine in huisstof veel bredere factoren beslaat, kan er effectiever ingespeeld 31

38 worden. De overheid kan een soort van sensibiliseringscampagne introduceren om dit probleem op te vangen. Dit kan gebeuren door allereerst een bewustmaking te creëren van de negatieve effecten bij de bevolking. Vervolgens kunnen er manieren aangebracht worden die de endotoxineconcentratie in huisstof verlaagt. Dit kan gebeuren door voedselresten te verwijderen, niet te roken in huis, kakkerlakken verwijderen etc. 6.5 Ingenieur-technisch deel Echter van toekomstige ingenieurs wordt er verwacht dat ze probleemoplossend kunnen redeneren. Door de ervaring in het labo werden ook wij met verschillende onverwachte omstandigheden geconfronteerd. Zo kregen we bij de LAL test te maken met verschillende problemen, waarvan het onverwacht verdwijnen van enzymes een van de belangrijkste was (zie 6.2.3). Hierdoor konden niet alle geplande LAL testen uitgevoerd worden, waardoor ook belangrijke resultaten ontbreken. Hoewel dit leidde tot teleurstelling en frustratie op die momenten, werd er getracht te achterhalen waarom er zoveel enzymen verdwenen waren. Dit bracht ons tot het opstellen van een verdampingsexperiment waarvan de resultaten toch wel opvallend waren (zoals reeds besproken bij resultaten). Echter om volgende groepjes te waarschuwen die onder de laminaire flow moeten werken met de LAL test, werd gezorgd dat er een nieuw en verbeterd protocol opgesteld werd. Dit protocol wordt in bijlage 3 meegegeven. Hierin wordt duidelijk de ingenieurstechnische kant van het onderzoek belicht. Er wordt meer ingegaan op elke stap die belangrijk is om dergelijk onderzoek efficiënter en beter te kunnen uitvoeren. Een ander voorbeeld was dat we een luchtstaal moesten nemen op een dag dat het buiten aan het vriezen was. Normaal gezien kan er dan geen staal genomen worden omdat de buffers waarin staal wordt genomen direct bevriest. We hebben dit probleem omzeild door het recipiënt in een beker met warm water onder te dompelen terwijl er staal werd genomen. Maar ook bij de uitgevoerde experimenten bleken niet alle resultaten aan onze hypotheses te voldoen. Zo kregen we bij het uitvoeren van de LAL test bij het neutralisatie experimenten te maken met het feit dat de negatieve controle (zuivere buffer) een redelijk hoge endotoxineconcentratie had t.o.v. de genomen luchtstalen. Hierdoor werd er verondersteld dat er inhibitie was en werd er hier ook bij volgende proefopzetten rekening mee gehouden. Zo werd er zelfs een heel inhibitie-experiment met model opgesteld om dit te verifiëren. Dit is reeds besproken bij resulaten. Hiermee willen we aantonen dat we door het uitvoeren van dit project al onze kennis uit voorgaande vakken konden en moesten integreren om telkens een goede proef te kunnen opzetten, uitvoeren en achteraf statistisch te verwerken. Zo hebben we aspecten van microbiologie (hoe er wordt omgegaan met pyrogeenvrij werken), chemische analysetechnieken, katalyse, modelleren en simuleren, statistische kennis en de praktische vaardigheden uit vorige practica allemaal moeten bundelen om dit tot een goed einde te kunnen brengen. Daarnaast is het ingenieur-technisch ook van belang om te weten hoe we vandaag de dag de bevindingen van dit project kunnen veralgemenen en welke mogelijke toepassingen hiermee behaald kunnen worden. Hiervoor wordt verwezen naar de toekomstperspectieven. 32

39 7 Toekomstperspectieven Zoals reeds in vorige delen aangehaald, is er nog veel onderzoek omtrent endotoxines en de methode om deze te meten mogelijk. Denk maar aan de binding van endotoxine en fijn stof die bijvoorbeeld met de Atomic Force Microscopie (AFM) bepaald kan worden. Dit is een techniek waarbij een tip gelabeld kan worden met specifieke componenten. Deze tip scant vervolgens een heel oppervlak/structuur af en naargelang de interactie tussen de tip en het substraat buigt deze tip meer of minder af. D.m.v. een laser kan de buiging bepaald worden en kan de structuur gevisualiseerd worden. Ook zou via deze atomaire interactie (atomaire krachten) bepaald kunnen worden hoe sterk bijvoorbeeld de binding endotoxine-pm is. Dit zou verder uitgewerkt kunnen worden in het labo in Louvain-la-Neuve tesamen met Y. Dufrène. Hij is expert in gebied AFM in micro-organismen en binding van celwandcomponenten op substraten/liganden. Samen met onze promoter Sarah Lebeer, werden al artikels verwezenlijkt over de structuur van polysacharide (PS), lipoteïchoïnezuren (LTA), peptidoglycaan (PG) en pili [58, 59, 60]. Ondanks dat dit niet mogelijk was voor ons project, blijft dit zeer zeker een interessant onderzoek omdat hier nog niets over geschreven is in de huidige literatuur. Niet alleen kan zo bepaald worden hoe deze binding chemisch in elkaar zit en wat de bindingssterkte is, maar kan ook bepaald worden of endotoxines altijd met hetzelfde gedeelte binden op fijn stof. Dit zou namelijk een effect kunnen hebben op het pro-inflammatoire karakter van deze verbinding zoals reeds in de discussie vermeld. Dit pro-inflammatoire karakter zou vervolgens eventueel via cellijnen bepaald kunnen worden. Naast onderzoek op laboschaal is het ook belangrijk om de globale impact van endotoxine en fijn stof met betrekking tot luchtvervuiling te bekijken. Zo zijn er al vele toepassingen omtrent fotokatalyse met TiO 2 om polluenten (voornamelijk NO x en organische componenten) te reduceren uitgevoerd. Zo werd er al in een pilootproject opgesteld op de Leien (Antwerpen) waarbij m 2 fotokatalytische straatstenen werden aangelegd om pollutie te verminderen [61]. Hierbij werd het TiO 2 enkel toegevoegd in de slijtlaag van de betonstraatstenen. Verschillende onderzoeken ter bepaling van de luchtzuiverende werking van fotokatalytische materialen hebben aangetoond dat deze materialen inderdaad de concentratie aan polluenten kunnen laten verminderen en hieruit bleek ook dat verticale oppervlakken beter doen dan horizontale. De duurzaamheid van deze efficiëntie is ook aangetoond, zij het wel dat een regelmatige reiniging (door middel van regen) noodzakelijk is [61]. In deze onderzoeken werd duidelijk gekeken naar NO x, bacteriën en virussen, maar in hoeverre dit ook voor het endotoxinegehalte geldt, werd niet getest. Daarom is het wel van belang dat ook in deze onderzoeken geprobeerd moet worden om endotoxines te betrekken. Endotoxines bepalen namelijk een belangrijke component m.b.t. de gezondheidseffecten van luchtkwaliteit. Een ander recent voorbeeld zijn de testen voor luchtkwaliteit die uitgevoerd werden van 21 januari 2013 tot maandag 4 februari 2013 in de Brusselse Leopold II-tunnel. Hierbij werd geprobeerd om de zuiverende effecten van zogenaamd fotokatalytisch cement te meten. Dit proefproject, een primeur voor België, wordt gevoerd door het Europees consortium PhotoPAQ, in samenwerking met minister Brigitte Grouwels en haar administratie Mobiel Brussel. De resultaten van deze testen worden deze zomer verwacht, waardoor we niet weten of hier ook de invloed van endotoxines wordt meegenomen [62]. Een kanttekening die bij al deze onderzoeken moet gemaakt worden is dat er steeds bacteriën kunnen zijn die in contact komen met dit fotokatalytisch materiaal. Hierdoor komen ook zij in aanraking met de gevormde radicalen. Echter doordat ze beschikken over mechanismen om tegen de oxidatieve stress [63], verkregen door de radicalen, in te gaan, kan het zijn dat er adaptatie optreedt van deze mechanismen ten aanzien van de oxidatieve stress. Zo zou er een selectieve ontwikkeling kunnen onstaan van bacteriën die steeds beter met deze stress om kunnen gaan, en dus ook moeilijker te doden zullen zijn. Het is dus van belang hier ook rekening mee te houden op sociaal-economisch vlak. 33

40 Een andere toepassing waar momenteel onderzoek naar wordt gedaan zijn speciale maskers, die componenten uit de lucht tegen kunnen houden. Dit is een onderzoek van de Artesis hogeschool waarbij Kristof Vaes van product ontwikkeling bezig is met de ontwikkeling van zo n masker [64]. Wanneer deze maskers ook de endotoxines zouden kunnen weerhouden wil dit zeggen dat mensen minder in contact gaan komen met deze pro-inflammatoire stoffen. Dit zal dan waarschijnlijk de gezondheid bevorderen. Echter in hoeverre we alle endotoxines mogen bannen uit onze leefwereld is niet duidelijk. Er moet namelijk ook rekening gehouden worden met de hygiëne hypothese, die stelt dat ons immuunsysteem opgeleid moet worden door bacteriën en bacteriële componenten. Het onderzoek lijkt tot nu toe te suggereren dat ook endotoxines daar een belangrijke rol in spelen. Kortom tal van onderzoeken zijn momenteel lopende om de luchtkwaliteit te verbeteren. Zoals vermeld in het sociaal-economische deel is het belangrijk dat zowel sociaal, politiek als economisch terrein samenwerkt. Hier is momenteel al duidelijk te zien dat de wetenschappelijke wereld zich engageert om verandering te bieden aan de strijd tegen luchtvervuiling. Zij zorgen voor positieve signalen die een draagvlak bieden voor de economische en politieke wereld. Daarom is het van belang om te beseffen dat hoe erg de luchtkwaliteit er ook aan toe is, er altijd -zoals in het project in Brussel- licht achteraan de tunnel zal zijn. 34

41 Nawoord Voor de totstandkoming van deze bachelorproef, hebben we mogen rekenen op de steun en kennis van vele personen. Daarom willen we van de gelegenheid gebruik maken om al de betrokken personen te bedanken. Allereerst willen we onze promotor Sarah Lebeer graag bedanken voor de goede begeleiding, kennis en opvolging van ons project omtrent endotoxines. Ook doctoraatsstudente Serena Moretti willen we bedanken voor haar begeleiding en hulp bij het organiseren en opstarten van de praktische proeven met de Limulus Amoebocyt Lysaat (LAL) test. Birger Hauchecorne stond dan weer steeds paraat om ons de informatie te verlenen die nodig was om het fotokatalytische experiment correct uit te kunnen voeren, waarvoor dank. Daarnaast willen we graag de labo verantwoordelijken Hilde en Leen bedanken die steeds zorgde dat er voldoende proper glaswerk is en voor het vinden van het geschikte benodigde materiaal. Ook willen we iedereen bedanken van het cel- en gen labo voor hun begrip, en in het bijzonder de groep van Matti Hofmans, Astrid Reymer, Chloë Cuyvers en Hans Gerstmans, omdat we steeds de laminaire flow kast mochten gebruiken voor een volledige dag. Echter zonder de mogelijkheid om te mogen studeren, hadden we dit ook nooit kunnen verwezenlijken. Daarom willen we graag onze ouders bedanken voor de steun en kansen die we krijgen om volwaardige bio-ingenieurs te worden. 35

42 Referenties [1] D. L. Nelson and M. M. Cox. Lehninger Principles of Biochemistry. W. H. Freeman, ISBN X. [2] URL [3] R. Saito. Analyses and exposure assessment of bacterial endotoxin in agricultural environments [4] M. Fujihara, M. Muroi, et al. Molecular mechanisms of macrophage activation and deactivation by lipopolysaccharide: roles of the receptor complex. Pharmacol Ther, Nov (2): [5] fig. URL [6] URL [7] URL id=215. [8] URL [9] W. H. Organization et al. Who air quality guidelines for particulate matter, ozone, nitrogen dioxide and sulfur dioxide. global update 2005, summary of risk assessment. Geneva: WHO, [10] elabprotocol. URL [11] F. Obbema. Westerse expats ontvluchten peking door luchtvervuiling, april URL [12] R. F. Henderson. Clean Air Scientific Advisory Committee (CASAC) Review of the EPA Staff Recommendations Concerning a Potential Thoracic Coarse PM Standard in the Review of the National Ambient Air Quality Standards for Particulate Matter: Policy Assessment of Scientific and Technical Information (Final PM OAQPS Staff Paper, EPA-452-R , June 2005). US Environmental Protection Agency, Office of the Administrator, Science Advisory Board, [13] C. Guastadisegni, F. J. Kelly, et al. Determinants of the proinflammatory action of ambient particulate matter in immortalized murine macrophages. Environ Health Perspect, Dec (12): [14] E. Commission et al. April Second Position Paper on Particulate Matter, [15] C. Terzano, F. Di Stefano, et al. Air pollution ultrafine particles: toxicity beyond the lung. Eur Rev Med Pharmacol Sci, (10): [16] A. Valavanidis, K. Fiotakis, et al. Airborne particulate matter and human health: toxicological assessment and importance of size and composition of particles for oxidative damage and carcinogenic mechanisms. Journal of Environmental Science and Health, Part C, (4): [17] URL [18] URL [19] Slonczewski. Microbiology, An Evolving Science, Loose Leaf edition. WW Norton, ISBN [20] M. B. Gorbet and M. V. Sefton. Endotoxin: the uninvited guest. Biomaterials, (34): [21] C. Degobbi, P. H. N. Saldiva, et al. Endotoxin as modifier of particulate matter toxicity: a review of the literature. Aerobiologia, (2):

43 [22] T. Sandle. Glucans and the bacterial endotoxin test, april [23] Endotoxin detection assays. URL endotoxin-detection/endotoxin-detection-assays.aspx. [24] Lonza. Limulus amebocyte lysate test handleiding. [25] URL [26] D. Heumann and T. Roger. Initial responses to endotoxins and gram-negative bacteria. Clin Chim Acta, Sep (1-2): [27] F. Bäckhed F.hed, L. Meijer, et al. Tlr4-dependent recognition of lipopolysaccharide by epithelial cells requires scd14. Cell Microbiol, Aug (8): [28] E. M. Pallson-McDermott and L. A. J. O Neill. Signal transduction by the lipopolysaccharide receptor, toll-like receptor-4. Immunology, Oct (2): [29] T. Gutsmann, A. B. Schromm, et al. The physicochemistry of endotoxins in relation to bioactivity. Int J Med Microbiol, Sep (5): [30] V. Liebers, M. Raulf-Heimsoth, et al. Health effects due to endotoxin inhalation (review). Arch Toxicol, Apr (4): [31] V. Liebers, T. Brüning, et al. Occupational endotoxin-exposure and possible health effects on humans. Am J Ind Med, Jun (6): [32] C. C. Braun-Fahrländer, C.nder, J. Riedler, et al. Environmental exposure to endotoxin and its relation to asthma in school-age children. N Engl J Med, Sep (12): [33] G. Bolte, W. Bischof, et al. Early endotoxin exposure and atopy development in infants: results of a birth cohort study. Clin Exp Allergy, Jun (6): [34] A. Simpson and F. D. Martinez. The role of lipopolysaccharide in the development of atopy in humans. Clin Exp Allergy, Feb (2): [35] A. R. Osornio-Vargas, J. Serrano, et al. In vitro biological effects of airborne pm2.5 and pm10 from a semi-desert city on the mexico-us border. Chemosphere, Apr (4): [36] A. R. Osornio-Vargas, J. C. Bonner, et al. Proinflammatory and cytotoxic effects of mexico city air pollution particulate matter in vitro are dependent on particle size and composition. Environ Health Perspect, Aug (10): [37] N. Manzano-Leon, R. Quintana, et al. Variation in the composition and in vitro proinflammatory effect of urban particulate matter from different sites. J Biochem Mol Toxicol, (1): [38] W. Anderson, P. Huck, et al. Endotoxin inactivation in water by using medium-pressure uv lamps. Applied and environmental microbiology, (5): [39] Y. Shi, H. HogenEsch, et al. Detoxification of endotoxin by aluminum hydroxide adjuvant. Vaccine, Feb (13-14): [40] J. M. Bates, J. Akerlund, et al. Intestinal alkaline phosphatase detoxifies lipopolysaccharide and prevents inflammation in zebrafish in response to the gut microbiota. Cell host & microbe, (6):

44 [41] L. Cascales, C. Mas-Moruno, et al. Tiratricol neutralizes bacterial endotoxins and reduces lipopolysaccharideinduced tnf-α production in the cell. Chemical Biology & Drug Design, (4): [42] K. W. Kolasinski. Surface science. WILEY, [43] K. Sunada, Y. Kikuchi, et al. Bactericidal and detoxification effects of tio2 thin film photocatalysts. Environmental science & technology, (5): [44] I. R. P. Clett Erridge, Elliott Bennett-Guerrero. Structure and function of lipopolysaccharides. Microbes and Infection, [45] M. Smits, F. Vanpachtenbeke, et al. Effect of operating and sampling conditions on the exhaust gas composition of small-scale power generators. PLoS One, (3):e [46] Guidance for industry, pyrogen and endotoxins testing: Questions and answers, June URL fda.gov/downloads/drugs/guidancecomplianceregulatoryinformation/guidances/ucm pdf. [47] M. RafieeTehrani and H. Khoshbooii. Inhibiting effect of various cations on endotoxin assay with the Limulus amoebocyte lysate chromogenic substrate method. Pharmazeutische Industrie, (11): [48] P. Duquenne, G. Marchand, et al. Measurement of endotoxins in bioaerosols at workplace: a critical review of literature and a standardization issue. Ann Occup Hyg, Mar (2): [49] URL [50] URL [51] URL [52] M. Adams and A. Lukewille. The European environment: state and outlook 2010 Air pollution. European Environment Agency, [53] URL [54] dossier fijn stof: meten, Januari URL stof/meten. [55] M. Mampaey. Veelbelovende nieuwe manier om gezondheidseffect luchtvervuiling te bepalen. URL http: // [56] M. L. Bell and K. Ebisu. Environmental inequality in exposures to airborne particulate matter components in the united states. Environmental health perspectives, (12):1699. [57] P. S. Thorne, R. D. Cohn, et al. Predictors of endotoxin levels in us housing. Environmental health perspectives, (5):763. [58] P. Tripathi, A. Beaussart, et al. Adhesion and nanomechanics of pili from the probiotic lactobacillus rhamnosus gg. ACS Nano, Apr (4): [59] G. Francius, D. Alsteens, et al. Stretching polysaccharides on live cells using single molecule force spectroscopy. Nat Protoc, (6): [60] G. Francius, S. Lebeer, et al. Detection, localization, and conformational analysis of single polysaccharide molecules on live bacteria. ACS Nano, Sep (9): [61] D. A. Beeldens. Fotokatalyse: Een toekomsttechniek? Onderzoekscentrum voor de Wegenbouw. 38

45 [62] Januari URL [63] J. R. Elisa Cabiscol, Jordi Tamarit. Oxidative stress in bacteria and protein damage by reactive oxygen species (review), [64] URL [65] URL 39

46 Bijlagen Bijlage 1: Overzicht van de meetwaarden voor PM 10, PM 2.5 en Black Carbon jaar en daggemiddelden. Bijlage 1a: Overschrijdingen PM-10 EU-norm [65]. De concentratie niet hoger mag zijn dan 40 µg/m 3. Te hoge concentraties worden weergegeven in het oranje en vanaf 2005 in het rood. 40

47 Bijlage 1b: Daggemiddelde concentraties voor PM 10 op verschillende plaatsen in België. De waarden worden weergegeven in µg/m 3 [65]. 41

48 Bijlage 1c: Daggemiddelde concentraties voor PM 2.5 op verschillende plaatsen in België. Bijlage 1d: Daggemiddelde concentraties voor Black Carbon (BC) op verschillende plaatsen in België. De waarden worden weergegeven in µg/m 3 [65]. 42

49 Bijlage 2: Bronnen van geselecteerde luchtverontreinigende polluenten in 2008 voor EER-32 en de landen van de Westelijke Balkan Deze figuur geeft een overzicht van enkele luchtverontreinigende polluenten in verschillende sectoren [52]. 43