PVE-CAMPYLOBACTER-PRESTON Wijzigingen (op hoofdlijnen) ten opzichte van de vorige versie: Als gevolg van wijzigingen in de hygiënebesluiten aangaande het verzenden van monsters is onderdeel 6.1 aangepast. PVE Branchemethode voor het aantonen van thermotolerante Campylobacter met behulp van Preston en CCDA in mest en vlees, afkomstig van pluimvee. 1. Onderwerp en toepassingsgebied Dit protocol beschrijft een methode voor het aantonen van thermotolerante Campylobacter (in dit protocol verder als Campylobacter aangeduid) in monsters mest en vlees, afkomstig van pluimvee. 2. Definitie Campylobacter: micro-organismen die de voor deze bacteriën karakteristieke groei vertonen en specifieke morfologische, biochemische en serologische reacties vertonen wanneer wordt gekweekt respectievelijk getest volgens de beschreven werkwijze. 3. Principe Mestmonsters en blindedarm mestmonsters worden rechtstreeks geënt op een selectieve vaste voedingsbodem (mccda). Vlees (bijvoorbeeld vel van de borstkap of filet) wordt in porties van 25 gram gedurende 1 minuut gestomacherd met 100 ml selectief ophopingsmedium (Preston). Hierna wordt het monstermateriaal verwijderd en alleen het ophopingsmedium gedurende 24 uur bebroed bij 41,5 C. Vervolgens wordt afgeënt op een selectieve vaste voedingsbodem (mccda). Selectieve vaste voedingsbodems worden microaëroob gedurende 48 uur bij 41,5 C bebroed, waarna beoordeeld wordt op aanwezigheid van specifieke kolonies. Specifieke kolonies worden bevestigd met behulp van oxidase reactie en microscopie. Als extra controle kan een deel van de isolaten met behulp van een latex agglutinatie test worden bevestigd. 4. Reagentia en andere materialen 4.1 Algemeen Alle gebruikte grondstoffen en het water moeten van analysekwaliteit zijn. Er mag ook gebruik worden gemaakt van media die kant-en-klaar commercieel verkrijgbaar zijn. Voor algemene eisen en richtlijnen voor microbiologische onderzoeken wordt verder verwezen naar NEN-EN-ISO 7218:2007 Pagina 1 van 7
4.2 Selectief ophopingsmedium: Preston bouillon (zónder paardenbloed) 4.2.1 Preston basismedium 4.2.1.1 Samenstelling Vleesextractpoeder a 10,0 g Pepton a 10,0 g Natrium chloride a 5,0 g Natrium pyruvaat b 0,25 g Natrium metabisulfiet b 0,25 g Ijzer (II) sulfaat b (FeSO4.7H2O) 0,25 g Water 1000 ml a ook tezamen kant-en-klaar verkrijgbaar onder de naam Nutriënt Broth No.2 b ook tezamen verkrijgbaar als supplement (zgn. groeisupplement of FBP supplement) 4.2.1.2 Bereiding Los de ingrediënten op in het water (indien nodig d.m.v. verhitting). Indien nodig, stel de ph, zodat deze na sterilisatie 7,5 ± 0,2 bij 25 ºC bedraagt. Steriliseer gedurende 15 minuten bij 121 ºC ± 1 ºC. 4.2.2 Preston antibiotica oplossing 4.2.2.1 Samenstelling Polymyxine-B 5000 IU Rifampicine 0,01 g Trimethoprim lactaat 0,01 g Amphotericine-B 0,01 g Water 4 ml Opmerking Deze antibiotica zijn ook tezamen verkrijgbaar als Preston supplement. Let op, ook het vroeger gebruikte Preston supplement, met cycloheximide in plaats van amphotericine-b, is nog steeds verkrijgbaar. De voorkeur wordt echter gegeven aan gebruik van supplement met amphotericine-b. 4.2.2.2 Bereiding Los de antibiotica op in het water en steriliseer door middel van filtratie (0,22 µm filter) 4.2.3 Compleet Preston ophopingsmedium 4.2.3.1 Samenstelling compleet Preston ophopingsmedium Basismedium 1000 ml Antibiotica oplossing 4 ml 4.2.3.2 Bereiding compleet Preston ophopingsmedium Koel het basismedium af tot onder de 47ºC. Voeg op aseptische wijze de antibiotica oplossing toe en meng zorgvuldig. Pagina 2 van 7
Opmerking In de originele beschrijving van Preston ophopingsmedium wordt paardenbloed gebruikt. In dit voorschrift wordt echter geen paardenbloed toegepast, omdat uit onderzoek is gebleken dat dat voor onderhavige monstermatrix niet noodzakelijk is (Jacobs-Reitsma et al., 2003). 4.3 Selectieve voedingsbodem: modified Charcoal Cefoperazone Deoxycholate Agar (mccda) 4.3.1 mccda Basismedium 4.3.1.1 Samenstelling Vleesextractpoeder a 10,0 g Pepton a 10,0 g Natrium chloride a 5,0 g Bacteriologische charcoal 4,0 g Caseïne hydrolysaat 3,0 g Natrium deoxycholaat 1,0 g Ijzer (II) sulfaat (FeSO4.7H2O) 0,25 g Natriumpyruvaat 0,25 g Agar 12,0 g Water 1000 ml a ook tezamen kant-en-klaar verkrijgbaar onder de naam Nutriënt Broth No.2. 4.3.1.2 Bereiding Los de ingrediënten op in het water (indien nodig d.m.v. verhitting). Indien nodig, stel de ph, zodat deze na sterilisatie 7,4 ºC ± 0,2 bij 25 ºC bedraagt. Steriliseer gedurende 15 minuten bij 121 ºC ± 1 ºC. 4.3.2 mccda antibiotica supplement 4.3.2.1 Samenstelling Cefoperazone 32 mg Amphotericine-B 10 mg Water 4 ml Opmerking Deze antibiotica zijn ook tezamen verkrijgbaar als mccda supplement. 4.3.2.2 Bereiding Los de antibiotica op in het water en steriliseer door middel van filtratie (0,22 µm filter) 4.3.3 Complete mccda voedingsbodem 4.3.3.1 Samenstelling Basismedium 1000 ml Antibiotica oplossing 4 ml Pagina 3 van 7
4.3.3.2 Bereiding Koel het basismedium af tot 47-50 ºC. Voeg op aseptische wijze de antibiotica oplossing toe en meng zorgvuldig. Giet de agar uit in petrischalen met nok en laat stollen. 4.4 Bevestigingsmedia 4.4.1 Oxidase reagens 4.4.1.1 Samenstelling N,N,N,N -tetramethyl-1,4-fenyleendiammoniumdichloride 0,1 gram Water 10 ml 4.4.1.2 Bereiding Los het N,N,N,N -tetramethyl-1,4-fenyleendiammoniumdichloride op in het water. Bereid het reagens vlak voor uitvoering van de oxidasetest. Dit reagens is ook kant-en-klaar commercieel verkrijgbaar. Handel dan volgens de gebruiksaanwijzing van de fabrikant. 4.4.2 Latexagglutinatietest voor bevestiging van Campylobacter Latexagglutinatietesten voor bevestiging van thermotolerante Campylobacter zijn commerciëel verkrijgbaar. 5 Toestellen, glaswerk en hulpmiddelen Gebruikelijke toestellen en steriel glaswerk voor microbiologische laboratoria en in het bijzonder de onderstaande: 5.1 Broedstoof voor het bebroeden bij 41,5 ºC ± 1 C. 5.2 Suspendeertoestel, Stomacher 5.3 Geschikte apparatuur en hulpmiddelen om te bebroeden in een micro-aërobe atmosfeer (ca. 6% zuurstof, 10% kooldioxide en 84% stikstof). Voor het verkrijgen van micro-aëroob milieu kan gebruik gemaakt worden van commerciële systemen ( gas-zakjes ). 5.4 Microscoop, bij voorkeur met fase-contrast, vergroting 1000x. Opmerking Gesteriliseerde materialen voor éénmalig gebruik mogen worden toegepast. 6. Werkwijze 6.1 Algemeen Bederfelijke pluimveeproducten zoals borstvellen en filet dienen gekoeld (1-8 C) te worden aangeleverd. Zie voor de ontvangst van monsters en registratie van afwijkingen de betreffende bijlage van het Besluit erkenningsvoorwaarden en werkwijzen laboratoria (PPE) 2009 of diens rechts opvolgers. De monsters dienen uiterlijk de tweede dag na monsterneming te worden ingezet. Stel monsters zo min mogelijk bloot aan temperatuurschommelingen. Pagina 4 van 7
Opmerking Komen mestmonsters mee met vleesmonsters in een koelbox, sla dan alle monsters gekoeld op. Worden mestmonsters per post ongekoeld verstuurd, sla dan op bij kamertemperatuur, tenzij deze monsters pas de volgende dag worden ingezet. Campylobacter is zeer gevoelig voor invriezen.daarom is het invriezen van monsters niet toegestaan. In alle gevallen geldt dat de agarplaten na beënten zonder uitstel onder micro-aërobe condities geïncubeerd dienen te worden, omdat Campylobacter obligaat micro-aërofiel is en onder andere omgevingscondities snel afsterft. 6.2 Direct uitplaten 6.2.1 Monstervoorbehandeling Monsters waarin hoge aantallen Campylobacter worden verwacht, zoals mest en blindedarm, worden rechtstreeks op het isolatiemedium afgestreken. Maak 1 mengmonster van de 30 afzonderlijke blindedarmen door deze elk op steriele wijze open te knippen en uit elke darm een evenredige hoeveelheid materiaal over te brengen in een lege steriele petrischaal. Meng goed (bijvoorbeeld met een steriele swab of entoog). 6.2.2 Isolatie Beënt vanuit het mengmonster met behulp van de swab of entoog een halve mccdaplaat. Beënt de rest van de plaat door middel van verdunningsstrepen met behulp van een steriele öse, zodanig dat na incubatie losliggende kolonies kunnen ontstaan. Incubeer mccda platen micro-aëroob gedurende 48 uur ± 4 uur bij 41,5 C ± 1 C. 6.3 Ophoping 6.3.1 Monstervoorbehandeling Breng 25 gram ± 1 gram van het monster, bijvoorbeeld een stuk huid van de borstkap of filet, in een stomacherzak en voeg 100 ml Preston bouillon toe. Stomacher gedurende 1 minuut en scheidt het monstermateriaal van de ophopingsbouillon (bijvoorbeeld door het verwijderen van de binnenzak van de stomacherzak met daarin het monstermateriaal of door overschenken van de ophopingsvloeistof in een schoon steriel flesje). 6.3.2 Ophoping Incubeer de ophopingsbouillon 24 uur ± 2 uur bij 41,5 C ± 1 C in micro-aëroob milieu. Indien geïncubeerd wordt in flesjes of (stomacher)-zakken met weinig kopruimte (d.w.z. </= 2 cm), kan zonder eisen aan het milieu geïncubeerd worden. 6.3.3 Isolatie Ent met behulp van een entoog (10 µl) de Preston-cultuur na incubatie uit op een mccda-plaat. Incubeer mccda platen micro-aëroob gedurende 48 uur ± 4 uur bij 41,5 C ± 1 C. Pagina 5 van 7
6.4 Beoordeling kolonies op mccda Beoordeel bebroede mccda-platen op de aanwezigheid van kolonies met de volgende morfologische eigenschappen: grijs, metalig, laag convex, amorf en de neiging om met de entstreep mee te groeien. Deze kolonies worden als verdacht positief aangemerkt. 7. Bevestiging 7.1 Algemeen Voer de bevestiging uit met minimaal 1 tot maximaal 3 verdachte kolonies per plaat in geval van reincultuur en tot 5 verdachte kolonies (indien aanwezig) in geval van mengcultuur, totdat een positief resultaat wordt verkregen. Ter bevestiging wordt een oxidase reactie uitgevoerd en worden de verdachte kolonies microscopisch beoordeeld. Voer zonodig eerst een reinstrijk uit op bijvoorbeeld een bloedplaat of een mccda-basis agar plaat (zonder antibiotica supplement). 7.2 Oxidase reactie Ent met een entoog (anders dan van nikkel/chroom) vanaf de mccda plaat een verdachte kolonie op een filtreerpapiertje bevochtigd met oxidasereagens. Lees na maximaal 10 seconden de reactie af. De reactie is positief bij paarskleuring en negatief indien er geen verkleuring optreedt. 7.3 Microscopie Maak van de verdachte kolonie een hangende-druppel-preparaat of nat-preparaat en beoordeel met een fasecontrast of donkerveld microscoop (100x objectief) op de karakteristieke kurketrekker-vormige morfologie en grote beweeglijkheid van Campylobacter. Bij kleuring volgens Gram tonen Campylobacter bacteriën zich als kurketrekker-vormig gebogen Gram-negatieve staafjes. De karakteristieke vorm is ook goed te zien bij kleuring met Oost-Indische inkt. Bij oude culturen (> 2 dagen op plaat) kan Campylobacter coccoïde en minder beweeglijke vormen aannemen. 7.4 Aanvullende bevestiging Bij twijfel of als extra controle op de juiste identificatie wordt aanbevolen om regelmatig een aanvullende bevestiging uit te voeren met een latexagglutinatietest, bijvoorbeeld met 1 op 50 bevestigde kolonies. 7.4.1 Latexagglutinatietest Latexagglutinatietesten zijn bij diverse firma s commercieel verkrijgbaar en moeten volgens de gebruiksaanwijzing van de fabrikant worden uitgevoerd en afgelezen. 7.5 Interpretatie bevestigingsreacties Campylobacter bacteriën vertonen de karakteristieken zoals omschreven in tabel 1. Tabel 1- Karakteristieken van Campylobacter Test Omschrijving Campylobacter-specifiek resultaat Microscopie Karakteristieke kurketrekkervormige morfologie en grote + beweeglijkheid Oxidase Paarsvorming + Latexagglutinatie Volgens voorschrift fabrikant + Pagina 6 van 7
8. Controle Voor de eerstelijnscontrole van de methode dienen te worden meegenomen: - Blanco controle, - Negatieve controle (indien een ingangscontrole per batch wordt toegepast, kan deze negatieve controle komen te vervallen), - Positieve controle. 9. Opgave van het resultaat Geef het resultaat op als Campylobacter aangetoond / niet aangetoond in het betreffende monstermateriaal als Campylobacter al dan niet is aangetoond volgens dit protocol. Bij de uitslag kan tussen haakjes aangegeven worden hoeveel gram monstermateriaal is onderzocht. Indien bij het aanleveren van de monsters afwijkingen worden geconstateerd van de wijze waarop de monsters aangeleverd moeten worden (zie bijlage V), dan dient het laboratorium op het analysecertificaat hierover een opmerking te maken en de eventuele gevolgen voor de betrouwbaarheid van de uitslag aan te geven. 10. Bronvermelding Jacobs-Reitsma, W. (1994). Epidemiology of Campylobacter in Poultry. Thesis Agricultural University Wageningen, The Netherlands. Jacobs-Reitsma W., M. van der Wal, R. Achterberg and J. Wagenaar. Comparative studies on Campylobacter isolation methods from fresh poultry products. Posterpresentation A-12 at the 12th International Workshop on Campylobacter, Helicobacter and Related Organisms, September 2003, Aarhus, Denmark. Intern. J. of Med. Microbiol., Vol. 293 Suppl. 35, p. 6-7. NEN-EN-ISO 10272:1995. Microbiology of food and animal feeding stuffs - Horizontal method for the detection of thermotolerant Campylobacter + technical corrigenda (ISO10272:1995/Cor.1:1996(E) and ISO 10272:1995/Cor:1997(E). Nederlands Normalisatie Instituut, Delft. NEN-EN-ISO 7218:2007 En. Microbiologie van voedingsmiddelen en diervoeders - Algemene eisen en richtlijn voor microbiologische onderzoeken. Nederlands Normalisatie Instituut, Delft. Pagina 7 van 7