PBO-blad. Verordeningenblad Bedrijfsorganisatie. jaargang februari 2004 num mer 11

Transcriptie

1 PBO-blad Sociaal- Economische Raad M e d e d e l i n g e n b l a d e n V e r o r d e n i n g e n b l a d B e d r i j f s o r g a n i s a t i e I n h o u d s o p g a v e jaargang februari 2004 num mer 11 Verordeningenblad Bedrijfsorganisatie BEDRIJFSLICHAMEN 2 Productschap Pluimvee en Eieren (PPE 22) 2 Productschap Vee en Vlees (PVV 16) 37 Productschap Zuivel (PZ 4) 40 Hoofdbedrijfschap voor de Detailhandel (HBD 1) 41

2 Verordeningenblad Bedrijfsorganisatie BEDRLTFSLICHAMEN Productschap Pluimvee en Eieren PPE 22 Besluit tot wijziging van het besluit protocollen hygiënevoorschriften pluimveeverwerkende industrie 1999 (2ûû4-11 Besluit van het Productschap Pluimvee en Eieren van 12 februari 2004 tot wijziging van het Besluit protocollen hygiënevoorschriften pluimveeverwerkende industrie Het bestuur van het Productschap Pluimvee en Eieren; Gelet op artikelen 3 en 8 van de Verordening hygiënevoorcchriften pluimveeverwerkende industrie 1999, Besluit: Artikel I Het Besluit protocollen hygiënevoorschriften pluimveeverwerkende industrie wordt gewijzigd als volgt: In artikel 2 wordt in de tweede volzin "Bijlage i" vervangen door: Bijlagen II, III, IV en V 1. Bijlage I vervalt; 2. De bijlagen I, 11, 111, IV, V bij dit besluit worden ingevoegd. A B Artikel II Dit besluit treedt in werking met ingang van de tweede dag na de dag van dagtekening van het Verordeningenblad Bedrijfsorganisatie waarin het wordt geplaatst. Zoetermeer, 12 februari 2004 J.J. Ramekers voorzitter S.B.M. Jongerius secretaris 2

3 TOELtCHTtNG BIJ HET BESLUIT TOT WIJZIGING VAN HET BESLUIT PROTOCOLLEN HYGIËNEVOORSCHRIFTEN PLUIMVEEVERWERKENDE INDUSTRIE ( Het besluit voorziet in de wijziging van de voorwaarden voor erkenning van laboratoria zoals deze zijn opgenomen in Bijlage I. Met de wijziging worden regels opgenomen voor de laboratoria die met Salmonella besmette monsters verder serotyperen. Deze laboratoria dienen voor 1 januari 2005 voor deze verrichting een erkenning van de Raad voor Accreditatie te hebben. Daarnaast dienen zij deet te nemen aan ringtesten en duploonderzoeken waarbij de kwaliteit van dit type onderzoek wordt getest. Voorts is bepaald dat de laboratoria jaarlijks isolaten naar het RIVM moeten insturen ten behoeve van het faagtyperingsonderzoek. Tenslotte worden voorschriften gegeven omtrent het gebruik van de verschillende erkende analysemethoden, de zogenaamde branchemethoden. Er mogen niet meerdere branchemethoden naast elkaar gebruikt worden, zodat het laboratorium kan 'kiezen' uit de uitslagen. De beschreven wijzigingen zijn doorgevoerd onder herziening van de indeling en nadere uitsplitsing van de bijlagen, hetgeen heeft geleid tot de integrale vervanging van Bijlage I door de Bijlagen 1 t/m V bij dit besluit. Van de gelegenheid is gebruik gemaakt om in de tekst enkele redactionele wijzigingen aan te brengen. Zoetermeer, 12 februari 2004 J.J. Ramekers voorzitter S.B.M. Jongerius secretaris Besluit Protocollen Hygiënevoorschriften Pluimverwerkende industrie 'i 999. bijlagen. inhoudsopgave Bijlage I Bijlage I1 Bijlage III Bijlage IV Bijlage V Erkenningsvoorwaarden voor laboratoria die de analyses van Monsters op de aan- of afwezigheid van Salmonella enlof Campylobacter uitvoeren. Analysemethoden voor het aantonen van Salmonella en Campylobacter in pluimvee(v1ees) en eieren. Vermeldingcwijze van de resultaten van Salmonella onderzoeken. Serologische bevestiging en serotypering. Opmerkingen opdrachtgever bij aanleveren afwij kende monsters, Acceptatiecriteria 3

4 Bijlage I: Erkenningsvoorwaarden voor laboratoria die de analyses van monsters op de aan- of afwezigheid van Salmonella enlof Campylobacter uitvoeren. A. Sinds 1 juli 2000 dienen de laboratoria de laboratoria geaccrediteerd te zijn voor de door de branche opgestelde analyse methode inzake de bepaling van Salmonella en per 1 januari 2005 voor de bepaling van Campylobacter Dat wil zeggen dat het laboratorium met ingang van deze datum over een accreditatiecertificaat op basis van de norm ISOIIEC moet beschikken die door de Raad voor Accreditatie te Utrecht (hierna te noemen RVA) wordt verleend. Hieronder dient tenminste de bepaling van Salmonella in de matrix mest volgens de door de branche opgestelde analyse methode te vallen. B. Voor laboratoria die in het buitenland zijn gevestigd zal geen Nederlandse accreditatie door de RVA vereist zijn maar een gelijkwaardige erkenning van het betreffende land. C. De laboratoria dienen voor de bepaling van Salmonella en Campylobacter gebruik te maken van door de branche opgestelde analyse methodes. De analyse methodes zijn bij dit besluit opgenomen. Aangezien de RVA votledig gevalideerde analysemethoden accrediteert, dienen de branche-methodes van een validatie rapport te worden voorzien. Het Productschap draagt zorg, op basis van het aangeleverde validatierapport, voor de beoordeling van de methode door de RVA inzake zijn geschiktheid voor accreditatie als branchemethode. D. Het laboratorium heeft de mogelijkheid tot het gebruik van één van de toegelaten methoden. Er mogen, om te bepalen of het monster al dan niet besmet is met Salmonella, niet meerdere testen naast elkaar toegepast worden. Om verder te kunnen serotyperen dient echter bij toepassing van één van de snelle detectiemethoden een positief monster worden geïsoleerd middels de MSRVmethode. E. Indien het laboratorium bij toepassing van een snelle detectiemethode een positieve bepaling wordt gedaan en het monster ten behoeve van de serotypering niet verder ge'isoleerd kan worden, moet op het uitslagenformulier hiervan melding worden gem a a kt. F. Alle laboratoria dienen mee te doen met Salmonella-ringonderzoek, tot nu toe georganiseerd door het Rijksinstituut voor Volksgezondheid en Milieuhygiëne te Bilthoven (hierna te noemen RIVM). Zodra een ringonderzoek voor Campytobacter is opgezet, dient een laboratorium ook aan dit ringonderzoek mee te doen. G. Het laboratorium verstrekt het Productschap eik kwartaal een overzicht waarop is aangegeven hoeveel koppels of hoeveel analyses door het betreffende laboratorium zijn onderzocht respectievelijk zijn uitgevoerd. Tevens geeft het laboratorium aan hoeveel koppels of analyses hiervan positief waren. Voor zover afgesproken met de pluimveehouder/broederij of slachterij zendt het laboratorium op aanvraag de resultaten van analyses door aan het Productschap (bijvoorbeeld Salmonelta paratyphi B var. Java) 4

5 H. Jaarlijks moeten de laboratoria monsters Salmonella enteritidis (S.e.1 of Salmonella typhimurium (S.t.1 opsturen naar het RIVM. Dit ten behoeve van het faagtyperingsonderzoek, dat het RIVM uitvoert in het kader van de EU- Zoönoserapportage. I. De serotypering van Salmonella enteritidis en Salmonella typhimurium mag door ieder erkend laboratorium worden uitgevoerd. De serotypering van de overige Salmonella serotypen mag uitsluitend uitgevoerd worden door de erkende laboratoria die voor deze verrichting uiterlijk op 1 januari 2005 een erkenning hebben bij de RvA. Het betreft serotypen die op een door het Productschap opgestelde lijst van veel vòòrkomende serotypen in pluimvee staan vermeld. De op deze lijst vermelde serotypen kunnen worden gewijzigd als de in pluimvee/pluimveeproducten vbbrkomende serotypen wijzigen. J. De laboratoria die de serotyperingen uitvoeren zijn verplicht: - de serotyperingen uit te voeren conform het antigenen schema van Kaufmann White; - jaarlijks maximaal 10 isolaten door te sturen naar het RIVM ter cerotypering. Dit is een duplo onderzoek om de kwaliteit van het serotyperen te toetsen; - deel te nemen aan ringonderzoeken, die de kwaliteit van het serotyperen eveneens testen; - isolaten, afkomstig van andere erkende laboratoria die geen serotypering van de typen met uitzondering van S.e. en S.t. kunnen uitvoeren, te analyseren. Hiervoor mogen geen afwijkende tarieven in rekening worden gebracht. Bijlage II : Analysemethoden voor het aantonen van Salmonella en Campytobacter in pluimvee(vtees) en eieren Voor het aantonen van Salmonella en/of Campylobacter in pluimvee(v1ees) en eieren staat de pluimveesector een aantal analysemethoden ter beschikking, welke goedgekeurd zijn door de Raad voor Accreditatie. Het laboratorium kan deze analysemethoden toepassen voor de analyses in het kader van de Verordening Hygiënevoorschriften Pluimveehouderij en de Verordening Hygiënevoorschriften Pluimveeverwerkende industrie Het laboratorium dient dan wel de betreff ende analysemethode onder haar accreditatie van de Raad voor Accreditatie (ISOAEC i onder te brengen. De analysemethoden zijn: I. PVE Branchemethode MSRV voor het aantonen van Salmonella in dons, faeces, vellen en eindproduct afkomstig van pluimvee. 2. Alternatieve PVE Branchemethode ProbeliaTM PCR voor het aantonen van Salmonella in dons, faeces, vellen en eindproduct afkomstig van pluimvee. 3. Alternatieve PVE Branchemethode VIDAS SLM voor het aantonen van Salmonella in dons afkomstig van pluimvee. 4. PVE Branchemethode voor de bepaling van de aan- of afwezigheid van t h e r m o t o I e r a n t e Camp ylobac ter spp. in mo n s t e r s p I u i m v e e, p I u i rn v ee p rod u c t e n e n omgeving smonsters. 5

6 I PVE Branchemethode MSRV voor het aantonen van Salmonella in dons, faeces, vellen en eindproduct afkomstig van pluimvee I i. Onderwerp Dit protocol beschrijft een methode voor het aantonen van Salmonella in dons, faeces (mest) en vellen en eindproduct afkomstig van pluimvee. De Raad voor Accreditatie heeft de methode goedgekeurd voor de matrix mest, dons, vellen en eindproduct. 2. Definities Salmonella: micro-organismen die de voor deze bacteriën karakteristieke groei vertonen en specifieke biochemische en serologische reacties vertonen wanneer wordt gekweekt respectievelijk getest volgens de beschreven werkwijze. Defectie van Salmonella: bepalen van de aan- of afwezigheid van deze micro-organismen als het onderzoek wordt uitgevoerd volgens de beschreven werkwijze. 3. Principe Na voorincubatie van de te onderzoeken matrix in een voorophopingsmediurn, wordt geënt op een half-vast medium, waarna wordt afgestreken op een selectief isolatiemedium. 4. Reagentia en andere materialen Alle gebruikte grondstoffen en het gedestilleerde water moeten van anaiysekwaliteit zijn. Niet-selectief voorophopingsmedium gebufferd pepton water BPw bijlage 1.1 Selectief ophopingsmedium rnodified semi-solid Rappaport- Vassiiiaáis medium MSRV bijlage 1.2 Selectieve agar brioant groen agar Bevestigingsmedia ure umag a r triple-sugar-ironagar lysine-decarbox ylase medium BGA bijlage 1.3 UA bijlage 1.4 TSI bijlage 1.5 LDC bijlage 1.6 Salrnonelta polyvalent aqglutinatie serum De samenstelting en bereiding van media en reagentia is opgenomen in bijlage 1. Er mag echter ook gebruik gemaakt worden van media die commercieel verkrijgbaar zijn. 6

7 ... inlegvellen. 5. Apparatuur en glaswerk Gebruikelijke apparatuur en glaswerk voor een microbiologisch laboratorium en in het bijzonder de onderstaande: Opmerking: Gesteriliseerde materialen voor eenmalig gebruik mogen worden toegepast Broedstoof voor het bebroeden bij 37 C -r 1 "C 5.2. Broedstoof voor het bebroeden bij 42 C I 0,5T 5.3. Waterbad ingesteld op 47 C k 2 C 5.4. Steriele entnaalden met een oog met een diameter van ca. 3 mm Steriele pipetten met een schaalverdeling van 0,l ml en een meetvolume van 1 ml Petrischalen met een middellijn van ca. 9 cm Cultuurbuizen van 17/18 x 150 mm en van 8 x 160 mm. 6. Werk wijze De monsters dienen binnen 4 uur na ontvangst ingezet te worden. Indien de monsters echter binnen 48 uur op het laboratorium aanwezig zijn, mag gewacht worden met het inzetten van de monsters totdat maximaal 48 uur + 4 uur na de datum van monstername is verstreken. Voorbehandeling van bet monster Verdun het monster 1 : 1 O in BPw. In de volgende tabel' is ter illustratie de relatie tussen de verschillende monsterhoevealheden en het volume 3Pw weergegeven: -- ^ _..-._._I.I_ ^.. I. I ".I --I1-..l...._..._..^^..._-_.I_ ". aantallen (hoeveelheid (circa)) BPw ~.^., ".... "_...,..,., type monster ~ 2x25 swabs 12,5 gram) 112,5 ml swabs broederijen 3x20 swabs 10 gram) 90 ml swabs stallen 2x 15 swabs 7,5 gram) 67,5 ml swabs 2 paar 10 gram) 90 ml overschoentjes 6x 25 cwabs 12,5 gram) 112,5 ml swabs 2x 30 swabc 15 gram) 135 mi swabs 30 swabs 15 gram) 135 ml blinde darrnrnest 25 gram 25 gram) 225 ml dons...,, gram (25 gram) 225 ml eindproduct 25 gram (25 gram) 225 ml vel van de borstkap 40 stukjes - (60 gram) I ml ---. Incubeer de potten BPw 18 k 2 uur bij 37 C k 1 C. De potten mogen tussentijds gedurende 2 dagen in de koelkast bewaard worden, deze 'koudestap' is mogelijk. Beën ring en bebroeding Breng 0,l ml BPw-cultuur op een MSRV plaat (bij 9 cm platen 3 druppels, met een gezamenlijk volume van 0,l rnl in een driehoek. Incubeer de platen 1 x 24 & 2 uur bij 42 C k 0,5"C. De platen moeten met het deksel van de petrischaal naar boven ge'incubeerd worden, aangezien het een half-vast medium is. Niet verdachte of negatieve platen dienen nogmaals 1 x 24 k 2 uur bij 42 C t 0,5T bebroed te worden. Een verdachte MSRV-plaat vertoont groei in de agar (zwerming vanuit de entingsplaats) en heeft een witlgrijze kleur. Verdachte platen worden afgeënt door aan de rand van de zwermzone met een öse - 1 Noot: standaard monsters in 225 ml BPw mag ook uitgevoerd worden. Het gaat er om dat er minimaal een 1 : 10 verdunning gemaakt worden. Een ruimere verdunning dan 1 : 10 is toegestaan, een kleinere verdunning dan 1: 10 is niet toegestaan. 7

8 materiaal uit de agar te nemen en daarmee een gedroogde BGA plaat te beënten. Incubeer deze platen gedurende 24 k 2 uur bij 37 C +. 1 C. Beoordeling Controleer de bebroede BGA-platen op de vorming van roze kolonies. Dergelijke kolonies worden als 'vermoedelijk positief' aangemerkt. Bevestiging Voor de bevestiging uit met minimaal 1 tot maximaal 3 specifieke kolonies per plaat in geval van reincultuur en tot 5 specifieke kolonies (indien aanwezig) in geval van mengcultuur totdat een positief resultaat wordt verkregen. De kolonies worden vanaf de BGA plaat geënt in UA middels het afstrijken op het oppervlak van de agar en in TSI middels ladderen over het schuingestolde oppervlak en een steekenting tot op de bodem van de buis. Beënt tevens een buis LDC door een hoeveelheid koloniemateriaal tegen de wand van de buis net onder het vloeistof oppervlak af te strijken. De buizen worden 24 k 2 uur bij 37 C t- 1 C g eincu be erd. Opmerking: Wanneer geen goed losliggende kolonies op de BGA plaat zijn verkregen of bij de aanwezigheid van veel spreidende of overgroeiende ctoorflora is het nodig ter zuivering een nieuwe reinstrijk op een gedroogde BGA- of nutriëntenagarplaat te maken. Bij verontreiniging van de Salmonella-kolonie met andere bacteriën wordt een afwijkend biochemisch patroon verkregen. Het is toegestaan om eerst de bevestigingstest met de TSI uit te voeren, en bij een verdachte uitslag door te gaan met ureum en LDC. Na incubatie geven voor Salmonella verdachte kolonies de volgende biochemische resultaten: fsl aoar onderin de buis schuine gedeelte - geel - zwart - bellenlscheuren - roodlonveranderd - glucose positief (100%) - vorming van H2S (97,6%1 - gasvorming van glucose (91,9%1 I - lactose en/of sucrose negatief (resp. 99,2 % en 99,5 %) J - geen kleuromslag van het medium - negatief 1100%1 LDC - paarse kleur en groei in medium - positief (94,6 %I Het gebruik van biochemische kits (zoals API, Cryctal) is ook toegestaan. Biochemisch verdachte kolonies dienen serologisch bevestigd te worden met een polyvalent serum. Dit werkvoorschrift is opgenomen in bijlage

9 De totale beoordeling van biochemische en serologische resultaten is als volgt: Indien een stam alleen biochemisch verdacht is, wordt deze opgestuurd naar het RIVM. Een andere mogelijkheid is het inzetten van een zogenaamde 'lange bonte rij' of een biochemische kit. Op het resultaat ian het RIVM hoeft niet gewacht te worden, alvorens een uitslag wordt afgegeven. Voor de doncmoncters en faecesmonsters vindt cerotypering plaats voor de 4 hoofdgroepen van Salmonella (6, C, D en E) en indien van toepassing identificatie van Salmonella Enteritidis en Salmonella Typhimurium. (indien nog niet bij pluimveehouder het cerotype nog niet bekend is). In bijlage IV is het werkvoorschrift opgenomen. 7. Controle Voor de eerstelijnscontrole - Positieve controle - Negatieve controle - Blanco controle van de methode dienen te worden meegenomen: De eerstelijnscontrotes met MSRV platen staan beschreven in bijlage Opgave van het resultaat Geef het resultaat op als 'aan- of afwezigheid van Salmonella in het betreffende monstermateriaal' (zie bijlage lil) als Salmonella al dan niet is aangetoond volgens dit protocol. Bij de uitslag kan tussen haakjes aangegeven worden om hoeveel gram het ongeveer gaat dat is onderzocht. Indien bij het aanleveren van de monsters door de opdrachtgever afwijkingen worden geconstateerd van de wijze waarop de monsters aangeleverd moeten worden, dan dient het laboratorium hierover schriftelijk een opmerking te maken richting de opdrachtgever (zie bijlage V). 9. Bronvermelding - NEN-EN Microbiologie van voedingsmiddelen en diervoeders - horizontale methode voor het aantonen van Salmonella (IS0 6579: 1993, gewijzigd). - Zee, van der H., E. De Boer, P. Van Netten, 1990, Salmonella isolatie met behulp van MSRV, De Ware (n) chemicus 20: Hartman, dr. E.G., Validatierapport van de isolatie van Salmonella uit de matrix pluimvee faecec m.b.v. het Modified Semi-solid Rappaport Vassitiadis (MSRV)-medium, september 1999 Indien een ingangscontrole wordt toegepast per batch, kan de negatieve controle komen te vervallen 9

10 Bijlage 1 : Samenstelling en bereiding van media en reagentia 1.1 Gebufferd pepton water (BPw) samenstelling: pepton 10,o g NaCI 5,O g NazHP04.12HzO 9,o 9 KHzP04 1,s g water 1000 ml bereiding: - Los de ingrediënten op in het water (indien nodig d.m.v. verhitting). - Stel de ph, zodat deze na sterilisatie 7,2 i 0,2 bedraagt bij 25 C. - Verdeel het medium over daarvoor geschikte flessen. - Steriliseer in een autoclaaf (15 min. 121 C). 1-2 Modified Semi-solid Rappaport-Vassiliadis medium (MSRVI3 oplossing A (basis): tryptose caseine hydrolysaat NaCI KHzPO4 MgCl2 malachietgroen oxalaat agar gedestilleerd water 4,59 g 4,59 g 7,34 9 1,47 g 10,93 g 0,037 g 2,7 g 1000 ml bereiding - Los de ingrediënten op in het water. - Breng het mengsel onder voortdurend schudden aan de kook (NIET AUTOCLAVEREN). - Stel de ph op 5,2 0,2. - Koel het mengcel af tot 50 C. oplossing B (no vo biocine) : - Los 10 mg novobiocine op in 2 ml gedestilleerd/demi water. - Steriliseer de oplossing d.m.v. filtratie (filter 22 pm). bereiding MSRV medium: - Voeg oplossing B toe aan 500 ml oplossing A. - Meng de oplossing. - Giet uit in petrischalen en verwijder de luchtbellen. - Even aan de lucht drogen om een nat oppervlak te voorkomen. 3 De MSRV-platen moeten volgens de voorschriften van de leverancier/fabrikant bewaard worden. 10

11 1.3 Briljant groen agar (BGAI oplossing A (basis): vleesextract 5,O g pepton 10,o 9 gistextract 3,O g Na2HPû4 1,o g NaHzP04 0,6 g agar 12 g tot 18 g ' water 900 ml ' = afhankelijk van de sterkte van de gel bereiding: - Los de ingrediënten op in het water (indien nodig via verhitting). - Stel de ph, zodat deze na sterilisatie 7,O f 0,2 is. - Schenk het medium in daarvoor geschikte buizen/flessen. - Steriliseer in een autoclaaf (15 min. 12 i "C). oplossing B (suiker/fenol rood oplossingl: lactose 10,o g sucrose 10,o 9 fenolrood OtO9 g water tot een eindvolume van 100 ml bereiding: - Los de componenten op in ml water. - Vul met water aan tot een eindvolume van 100 ml. - Verhit gedurende 20 min. in een waterbad van 70 C - Koel af tot 47 C i 1 C. - Gebruik de oplossing direct. oplossing C IbriQant groen oplossing): briljant groen k 0,5 g water 100 ml bereiding: - Voeg het briljant groen (concentratie tussen 4,5 mg/l en 6 rng/l) toe aan het water. - Bewaar de oplossing tenminste 1 dag in het donker zodat auto-sterilisatie optreedt. bereiding complete medium : oplossing A oplossing B oplossing C 900 rnl 100 ml 1 rnl bereiding: - Voeg, onder aseptische omstandigheden, oplossing C toe aan de (tot 47 C t lacl afgekoelde oplossing B. - Voeg deze oplossing toe aan oplossing A en meng het medium. bereiding van de agar platen: - Giet het vers bereide mediurn in grote (I40 mi) of in kleine petrischalen {? 15 mi). - Laat de platen stollen. - Droog de platen voor gebruik.

12 1.4 Ureumagar (UA) oplossing A {basismedium): pepton 1,o g glucose 1,o g NaCI 5,O g KH2P04 2,o g fenolrood 12,0 mg agar 12,O tot 18,O g gedestilleerd water 1000 ml ' = afhankelijk van de sterkte van de gel bereiding: - Los de ingrediënten op in het water. - Stel de ph op 6,8 0,2 bij 25 C en filtreer de oplossing. - Steriliseer de oplossing gedurende 15 min bij 121 "C in een autoclaaf - Laat de oplossing afkoelen tot 47 C. oplossing B íureumoplossingl: ureum 400 g gedestilleerd water 1000 ml bereiding: - Los de ureum op in het water - Steriliseer de oplossing d.m.v. filtratie en controleer de steriliteit. bereiding complete medium: oplossing A oplossing B 950 ml 50 ml bereiding: - Voeg oplossing B (ureurnoplossing) toe aan oplossing A (basismedium). - Verdeel het medium over steriele buizen, per buis 1 O rnl medium. - Laat de buizen stollen zadat een schuin gedeelte ontstaat. 1.5 Triple-sugar-ironagar (TSII samenstelling: vleesextract 3,O g gistextract 3,O g pepton 20,o 9 NaCI 5,O g lactose 10,o 9 sucrose 10,o g glucose 1,o g ijzer (lil) citraat 0.3 g natriumthiosutfaat 0,3 g fenolrood 0,024 g agar 12,O tot 18,O g ' gedestilleerd water 1000 ml ' = afhankelijk van de sterkte van de gel 12

13 bereiding : - Los de ingrediënten op in het water (indien nodig d.m.v. verhitting). - Stel de ph, zodat deze na sterilisatie 7,4 k 0,2 is. - Verdeel het medium over buizen, per buis 10 mi medium. - steriliseer de oplossing gedurende 15 min bij 120 C in een autoclaaf. - Laat de buizen stollen zodat er bovenop 2,5 cm agar onderin de buis, een schuin gedeelte ontstaat. 1.6 Lysine-decarboxylase medium (LDC) samenstelfing: 1 -lysine rnonohydrocfiloride 5,O g gistextract 3,O g glucose 1,o g brornocresol purper 0,015 g water 1000 ml bereiding: - Loc de ingrediënten op in het water (indien nodig d.m.v. verhitting). - Stel de ph, zodat deze na sterilisatie 6,8 f 0.2 is. - Verdeel het medium over smalle reageerbuizen; per buis 5 ml medium. - Steriliseer in een autoclaaf (1 O min. 121 "C). Bijlage 4: Eerstelijnscontrole met MSRV platen Onderwerp Deze bijlage beschrijft een methode voor de eerstelijnscontrole op de analyse van Salmonella met MSRV. Werkwijze Om de kwaliteit van de geproduceerde media te bewaken, dient iedere dag een controle volgens onderstaand schema te worden uitgevoerd. Positieve controle Inoculum: Kolonie aanstippen met entoogje en afstrijken langs de wand van een buisje met gebufferd peptonwater (BPW). Ca. 24 f 2 uur bij 37 C incuberen in BPw (1 O*) en verdunnen tot 1 O3 of commercieel verkrijgbaar bij de IGB Groningen. Controlestam: S. en feritidis I i00 FtL op de plaat pipetteren I incuberen i x'24 k 2 uur 42 zt 0,5"C I wit/grijze troebeling plaat positief 13

14 Alternatieve PVE Branchemethode PROBELIATM PCR voor het aantonen van Sa/mone//a in dons, faeces, vellen en eindproduct afkomstig van pluimvee Versie 14 november Onderwerp Dit protocol beschrijft een 24-uurs methode voor het aantonen van Salmonella met behulp van de PRûBELIATM test (Bio-Rad Laboratories) in dons, faeces (mest), vellen en eindproduct afkomstig van pluimvee. De methode is gevalideerd ten opzichte van de door de branche opgestelde en door de Raad voor Accreditatie goedgekeurde analyse methode MSRV. 2. Definities Salmonella: Salmonella spp., d.w.z. alle typen Salmonella waarvan het DNA aan de hand van de Polyrnerase Chain Reactie (PCR) wordt aangetoond, wanneer wordt getest volgens de beschreven werkwijze. Detectie van Salmonella: bepalen van de aan- of afwezigheid van deze micro-organismen als het onderzoek wordt uitgevoerd volgens de beschreven werkwijze. 3. Principe U i t e en voor ophoping cm e d i u m wordt, na voor i n c u ba t i e, het DNA van Salm on ella geïsoleerd. Vervolgens vindt amplificatie plaats van een voor Salmonella specifieke en gepatenteerde DNAsequentie, het laga gen, met behulp van de PCR. Het vermenigvuldigde DNA wordt na hybridisatie op een microtiterplaatstrip aangetoond middels een colorimetricche reactie. Inclusief voorophoping wordt een positieve of negatieve uitslag verkregen binnen 24 uur. 4. Reagentia en andere materialen De PROBELIATb Salmonella test bestaat uit kant-en-klare reagentia, inclusief voorophopingmedium. Het te gebruiken gedestilleerde water moet van anatysekwaliteit zijn. Niet-selectief voorophopingsmedium gebufferd pepton water (BPw) Bio-Rad code (500 gl of Blo-Rad code i225 mw [bijlage 1.l I PRO BEL IA^^ Salmonella test Amplificatie kit Bio-Rad code Ibijlage 1.21 Detectie kit Bio-Rad code [bijlage 1.21 De samenstelling en bereiding van media en kits is opgenomen in bijlage 1 14

15 5. Apparatuur en verbruikcmaterialen De gebruikelijke apparatuur voor een microbiologisch laboratorium en de voor de PR06ELIATM test benodigde apparatuur en verbruiksmaterialen, zoals onderstaand vermeld: Opmerking: Gesteriliseerde materialen voor éénmalig gebruik mogen worden toegepast Microcentrifuge voor 1,5 ml centrifugebuisjes (max. 10, rpm) 5.4 Verhittingsblokken of waterbaden ingesteld op O C en 1 O0 f Broedstoof voor het bebroeden bij 37 5 I OC Micropipetten (5-50 en pl) Bio-Rad icycler thermocycler voor PCR Bio-Rad microtiterplaat sha kerhncubator Model Stat-Fax Bio-Rad microtiterplaat washer Model PW-40/41 Bio-Rad microtiterplat reader Model 550 met 450 nm en 620 nrn filters 5.9 Stomacherzak met filter 5.1 O Steriele centrifuge buisjes 1,5 ml Steriele micropipetpunten met filter 5.12 Steriele PCR-tubes 200 pui 6. Specifieke eisen betreffende de laboratorium ruimtes PCR technologie is zeer gevoelig: amplificatie van een enkel molecuul genereert miljoenen identieke kopieën van de gewenste sequentie. Deze kopieën kunnen via aërosolen in de laboratorium ruimte circuleren. Om besmetting van nieuwe monsters met DNA sequenties vanuit amplificaties van voorgaande monsters te voorkòmen, is het essentiëel om de ruimtes waar de monster behandeling en het mixen van de reagentia plaatsvindt (pre-pcr ruimte) te scheiden van de ruimte waar de amplicon analyse plaatsvindt en de centrifugebuisjes worden geopend (post- PCR ruimte). Het gebruik van de PR06ELlATM PCR test vereist een minimum van 2 afgescheiden ruimtes. Elke ruimte is voorzien van eigen gebruiksmaterialen zoals pipetten, handschoenen, laboratorium jassen, etc., die niet mogen circuleren van de ene werkplek naar de andere. 7. Werkwijze Zie voor de acceptatie criteria voor monstermateriaal bijlage V. De monsters dienen binnen 4 uur na ontvangst ingezet te worden. Indien de monsters echter binnen 48 uur op het laboratorium aanwezig zijn, mag gewacht worden met het inzetten van de monsters totdat maximaal 48 uur + 4 uur na de datum van rnonstername is verstreken. Voorbehandeling van het monster Verdun het monster 1 :I O in BPw in een stomacherzak met filter. Stomacher, en incubeer de BPw gedurende uur bij 37'C k IOC. Bij verwerking van nekvel ten behoeve van de verdunning dient zo min mogelijk onderhuids vet meegesneden te worden; een overmaat vet kan de isolatie van DNA bemoeilijken en inhibitie van de PCR-reactie veroorzaken. Mest en dons vergen geen bijzondere voorbehandeling. 15

16 Amplificatie en detectie van DNA met PROBELIATM Salmonella Na voorophoping wordt de inhoud van de stomacherzak lichtjes gehomogeniseerd middels voorzichtig zwenken. Vervolgens wordt met een steriele pipet (bij voorkeur met filter) 1 ml homogenaat uit de stomacherzak gepipetteerd in een 1,5 ml centrifuge buisje. Hierbij moeten geen vet, donsresten of andere vaste substanties worden meegepipetteerd. Overige stappen worden uitgevoerd conform de gebruiksaanwijzing van de PROBELIATM Salmonella testkit (instructie van de fabrikant). Beoordeling Resultaten worden beoordeeld conform de gebruiksaanwijzing van de PROBELIATM Salmofieila testkit (instructie van de fabrikant). Deze zijn gebaseerd op bepating van de optische densiteit (OD) verkregen op de Salmonella detectiestrip (Hl ), vergeleken met de OD van hetzelfde monster op de detectiestrip van de interne controle (HO). Zie ook onderstaande tabel: Salmonellae (Hl) Interne controle (HOI Resultaat 1 OD > niet van belang positief 2 OD < OD > negatief 3 OD < OD c inhibitie In het geval van inhibitie van de amplificatiereactie (de OD'c voor monster en corresponderende interne controle zijn lager dan de gestelde cut-off vaiue van 0.070) dient een nieuwe test te worden uitgevoerd. Hiertoe wordt het supernatant van het betreffende monster, verkregen na isolatie van DNA, 1 : 1 O verdund met steriel water (instructie van de fabrikant). vervolgens wordt de PCR opnieuw ingezet. Voor een positief resultaat geldt: Salmonella aanwezig. Voor een negatief resultaat geldt: Salmonella afwezig. Verdere bevestiging van positieve uitslagen verkregen met de PROBELIATM Salmonella is ter beoordeling van de gebruiker maar is niet vereist. Echter in die gevallen waarin volgens de Verordening Hygiënevoorschriften pluimveehouderij of de Verordening Hygiënevoorschriften pluimveeverwerkende industrie nadere serotypering van de Salmonella bevinding is vereist, dient met dezelf de BPw-voorophoping als waaruit de PCR is uitgevoerd alsnog een isolatie met MSRV en BGA uitgevoerd te worden, zie hiervoor de PVE branchemethode MSRV. In bijlage IV is het werkvoorschrift voor serotypering van isolaten opgenomen. 8. Controle De PROBELIATM Salmonella test kit bevat één positieve en twee negatieve controles. Een additionele interne controle in elk monster bepaald de efficiëntie van de PCR-reactie en is een indicator voor vals-negatieve reacties. Genoemde controles worden in elke test meegenomen. Validatie van de test: De OD van de beide negatieve controles dient kleiner te zijn dan 0.050; deze waarde bevindt zich meestal tussen de en De OD van de positieve controle dient groter te zijn dan De test is alleen geldig indien de optische densiteit van de controles voldoet aan bovengenoemde condities. Voor de eerstelijnscontrole van de methode dienen te worden meegenomen: - Positieve controle - Negatieve controle (indien een ingangscontrole per batch wordt toegepast, kan deze negatieve controle komen te vervallen) - Blanco controle 16

17 9. Opgave van het resultaat Het resultaat wordt opgegeven ais 'aan- of afwezigheid van Salmonella in het betreffende monstermateriaaf' als Salmonella al dan niet is aangetoond volgens dit protocol. Indien bij het aanleveren van de monsters door de opdrachtgever afwijkingen worden geconstateerd van de wijze waarop de monsters aangeleverd moeten worden, dan dient het laboratorium hierover schriftelijk een opmerking te maken richting de opdrachtgever (zie bijlage V). i O. Bronvermelding Fach P., Dilasser F., Grout J., and Tache J., Evaluation of a polymerase chain reactionbased test for detecting Salmonella spp. in food samples: PROBELIATM Salmonella spp. Journal of Food Protection, Vol. 62 (1 2): (1 999). Hartman E.G. Validatierapport van de isolatie van Salmonella uit de matrix pluimvee faeces m. b.v. het Modified Semi-solid Rappaport Vassiliadis (MSRV)-medium, Gezondheidsdienst voor Dieren, projectnr , september Miras I,, Hermant N., Arricau N., Popoff M.Y. Nucleotide sequence of laga and lagb genes invoived in invasion of HeLa cells by Salmonella enterica subsp. Enterica ser. Typhy. Research in Microbiology, Vol. 146 (1 1: (1 995). PROBELIATM Salmonella spp.: AFNOR cettification, attest SDP-07/2-06/96. Productschappen Vee, Vlees en Eieren, Verzamelband Actieplan Salmonella en Campylobacter in de pluimveevleessector 2000'. Van der Zee, H., et al. Vergelijking van de Salmonella bepaling met behulp van de conventionele branchemethode (MSRV) en een snelle alternatieve detectiemethode (PROBELIATM PCR) in de pluimveesector. PVE, september 2002, 17

18 11. Bijlagen Bijlage 1 : Samenstelling van voorophopingsrnedium en PROBELIATM tectkits 1.l Voorophopingsmedium: Gebufferd peption water (BPw) Samenstelling: Pepton 10,o g NaCI 5,o g NazHP g KHzP04 1,5 g Water 1000 ml Bereiding: - Los de ingrediënten op in het water (indien nodig d.m.v. verhitting) - Stel de ph, zodat deze na sterilisatie 7,2 i 0,2 bedraagt bij 25 OC - Verdeel het medium over de daartoe geschikte flessen - Steriliseer in een autoclaaf (15 min., 121 OC) 1.2 PRO BEL IA^^ Salmonella test Samenstelling arnplifica tie kit Al Lysis reagens 1 fles 22 ml A2 Salmonella spp. amplificatie mix 2 buizen 2 x 2,5 ml A3 PCR Positieve controle 1 buis 0,25 mi A4 PCR Negatieve controle 1 buis 0,5 mi A5 Denaturatie reagens 1 fles 6 ml Samenstelling detectie kit: HO H1 96 welk plaat (12x8) gecoat met een probe specifiek voor de interne controle 96 welk plaat (12x8) gecoat met een probe 1 microtiterplaat I microtiterplaat Specifiek voor Salmonella spp. HZ Hybridisatie buffer 1 fles 100 ml H3 Peroxidase-gelabelde probes specifiek voor 1 buis 100 ml Salmonella spp. en de interne controle H4 Was buffer (1 Ox geconcentreerd) 1 fles 100 ml H5 Substraat buffer 1 fles 60 ml H6 Chromogeen: tetramethulbenzidine ITMB) 1 buis 1 ml H7 Stop oplossing (1,5 N zwavelzuur] 1 fles 28 ml Afdekfolie voor de microtiterplaat 20 stuks 18

19 Alternatieve PVE Branchemethode VIDAS SLM voor het aantonen van Salmonella in dons, afkomstig van pluimvee Versie 14 november Onderwerp Dit protocol beschrijft een 48-uurs methode voor het aantonen van Sa/mone/la met behulp van de VIDAS SLM test (biomérieux) in dons afkomstig van pluimvee. De methode is gevalideerd ten optjchte van de door de branche opgestelde en door de Raad voor Accreditatie goedgekeurde analyse methode MSRV. 2. Definities Salmonella: Salmonella spp., d.w.z. alle typen Salmonella waarvan zowel O als H antigenen met behulp van de Enzyme Linked Fluorescent Assay (ELFA) techniek worden aangetoond, wanneer wordt getest volgens de beschreven werkwijze. Detectie van Salmonella: bepalen van de aan- of afwezigheid van deze micro-organismen als het onderzoek wordt uitgevoerd volgens de beschreven werkwijze. 3. Principe VIDAS SLM is een enzym immunoascay voor detectie van Salmonelía antigenen, waarbij gebruik wordt gemaakt van de ELFA methode en geautomatiseerd uitgevoerd op het VIDAS analyse apparaat. De voorophoping en de selectieve ophopingen vinden achtereenvolgens plaats gedurende 1 8 uur in een voorophopingsmedium, 6-8 uur in 2 verschillende selectieve ophopingsmedia en als laatste gedurende 18 uur in een 3" ophopingsmedium. Van dit laatste ophopingsmedium wordt een hoeveelheid verhit en in een reagens strip gebracht. De reagens strip wordt in het VIDAS analyse apparaat gebracht, waarna het aantonen van aanwezigheid van Salmonella antigenen met behulp van een cocktail van specifieke monoclonale antilichamen en een fluorescentie reactie volledig geautomatiseerd verloopt. Het test resultaat van deze aantoningsstap is na ca. 45 minuten beschikbaar. 4. Reagentia en andere materialen Alle gebruikte grondstoffen en het gedestilleerde water moeten van analysekwaliteit zijn Niet-selectief voorophopingsmedium gebufferd pepton water BPw bijvoorbeeld biomérieux ref of Branchemethode MSRV [bijlage 11 Selectief op ho ping smedi um Rappaport- Vassiliadis bouillon RV bijvoorbeeld biomérieux ref seleniet e ysteine bouillon SC bijvoorbeeld biomérieux ref M bouillon Mb bijvoorbeeld biomériecix ref Selectieve agar briljant groen agar BGA PVE Branchemethode MSRV 19

20 Bevestigingsmedia ureumagar UA PVE Branchemethode MSRV triple -s ugar-ironaga r TSI PVE Branchemethode MSRV lysine-decarbox ylase medium LDC PVE Branchemethode MSRV Salmonella polyvalent agglutinatie serum PVE Branchemethode MSRV De samenstelling en bereiding van media en reagentia is opgenomen in bijlage 1 van de PVE Branchemethode MSRV. Er mag echter ook gebruik gemaakt worden van media die commercieel verkrijgbaar zijn. De VIDAS SLM test bestaat uit kant-en-klare reagentia, zoals omschreven in de gebruiksaanwijzing van de VIDAS SLM test, instructie van de fabrikant. 5. Apparatuur en verbruiksmaterialen De gebruikelijke apparatuur voor een microbiologisch laboratorium en de voor de VIDAS SLM test benodigde apparatuur en verbruiksmaterialen, zoals onderstaand vermeld: Opmerking: Gesteriliseerde materialen voor éénmalig gebruik mogen worden toegepast. * * * * * * * * * * * Broedstoof voor het bebroeden bij 37'C f 1 OC Broedstoof voor het bebroeden bij 42 C I 0,5OC Micropipet (500 PI) Steriele micropipetpunten Waterbad (100 OC) of equivalent Steriele entnaalden met een oog met een diameter van ca. 3 mm. Steriele pipetten met een schaalverdeling van 0,l ml en een meetvolume van 1 mt Petrischalen met een middellijn van ca. 9 cm. Cultuurbuizen van 17/18 x 150 mm en van 8 x 160 mm. Stomacherzakken (met filter) VIDAS analyse apparaat 6. Werkwijze Zie voor de acceptatie criteria voor monstermateriaal bijtage V. De monsters dienen binnen 4 uur na ontvangst ingezet te worden. Indien de monsters echter binnen 48 uur op het laboratorium aanwezig zijn, mag gewacht worden met het inzetten van de monsters totdat maximaal 48 uur + 4 uur na de datum van monstername is verstreken. Voorophoping Verdun het monster 1 : 1 O in BPw (25 gram dons in 225 ml BPw). Stomacher, en incubeer de BPw 18 k 2 uur bij 37 C F 1 C. Selectieve ophoping Breng na incubatie van de BPw 1 ml van deze suspensie over in 10 ml SC bouillon. Incubeer 6-8 uur bij 37 C * 1 C. Breng tegelijkertijd ook 0,l ml van deze 8Pw suspentie over in 10 ml RV bouillon. Incubeer 6-8 uur bij 42 C +r 0,5"C Na-ophoping Breng na incubatie van de SC bouillon 1 ml hiervan over in 10 ml M bouillon. Breng na incubatie van de RV bouillon 1 ml hiervan over in een ze buis met 10 ml M bouillon. Herincubeer de SC bouillon en de RV bouillon voor nog eens 18 uur, om bevestiging achteraf mogelijk te maken. 20

21 Incubeer de M bouillon buizen gedurende 18 uur bij 42 C f 0,5"C. Meng de M bouillon buizen na incubatie en breng uit elke buis 1 ml over in een eppendorfbuisje. Sluit de buisjes en verhit gedurende 1 5 minuten in een kokend waterbad. Voer vervolgens de VIDAS SLM test uit volgens de gebruiksaanwijzing van de fabrikant. Bewaar de Overgebleven bouillons bij 2-8 C voor bevestiging. Beoordeling Resultaten worden beoordeeld conform de gebruiksaanwijzing van de VIDAS SLM test, gebruiksaanwijzing van de fabrikant. Deze zijn gebaseerd op metingen van de fluorescentie en worden gestandaardiseerd naar de zgn. Test Value. Resultaten met een Test Value onder de 0,23 betreffen monsters waarin Salmonella antigenen niet aantoonbaar waren. Resultaten met een test Value = O, 23 worden als Salmonellapositief gerapporteerd. Positieve resultaten moeten worden bevestigd met behulp van de bewaarde ophopings- en na-ophopingsmedia. Bevestiging van posirieve resultaten Ent met een öse vanuit de ophopingsbouillons (RV en SC) vanuit de broedstoven en vanuit de M bouillons vanuit de koeling af op gedroogde BGA platen. Incubeer deze platen gedurende 24 k 2 uur bij 37 C +. 1 C. Beoordeling 5GA platen Controleer de bebroede BGA-platen op de vorming van roze kolonies. Dergelijke kolonies worden als 'vermoedelijk positief' aangemerkt. Bevestiging van deze specifieke kolonies, zowel biochemisch ais serologisch, vindt vervolgens plaats zoals omschreven in de PVE Branchemethode MSRV. Voor doncrnonsters vindt serotypering plaats voor de 4 hoofdgroepen van Salmonella (B, C, D en E) en indien van toepassing identificatie van Salmonella enteritidis en Salmonella typhimurium (indien bij de pluimveehouder het serotype nog niet bekend is). In bijlage IV is hiervoor het werkvoorschrift opgenomen. 7. Controle De VIDAS SLM test kit bevat een positieve en een negatieve VIDAS reagens controle en een bijbehorende standaard. Deze worden meegenomen in de bepalingen zoals omschreven in de gebruiksaanwijzing van de VIDAS CLM test, instructie van de fabrikant. Voor de eerstelijnscontrole van de methode dienen te worden meegenomen: - Positieve controle - Negatieve controle (indien een ingangscontrole per batch wordt toegepast, kan deze negatieve controle komen te vervallen) - Blanco controle 8. Opgave van het resultaat Geef het resultaat op als 'aan- of afwezigheid van Salmonella in dons', als Salmonella al dan niet is aangetoond volgens dit protocol. Indien bij het aanleveren van de monsters door de opdrachtgever afwijkingen worden geconstateerd van de wijze waarop de monsters aangeleverd moeten worden, dan dient het laboratorium hierover schriftelijk een opmerking te maken richting de opdrachtgever (zie bijlage V). 21

22 9. Bronvermelding Hartman, E.G., Validatierapport van de isolatie van Salmonella uit de matrix pluimvee faeces rn. b.v. het Modified Semi-solid Rappaport Vassiliadis (MSRV)-medium, Gezondheidsdienst voor Dieren, projectnr , september IS0 6579:l 993(E). Microbiology. General guidance on methods for the detection of Salmonella. Productschappen Vee, Vlees en Eieren, Verzamelband Actieplan Salmonella en Campy/obacfer in de pluimveevleessector Van der Zee, H. et al. Validatierapport van de Salmonella bepaling in de matrix dons met behulp van de VIDAS SLM methode. PVE, september

23 PVE Branchemethode voor de bepaling van de aan- of afwezigheid van thermotolerante Campylobacter spp. in monsters pluimvee, piuimveeproducten en omgevingsmonsters 1 Onderwerp en toepacsingsgebied Dit protoco t beschrijft een methode voor het aantonen van thermotolerante Campylobacrer spp. (in dit protocol verder als Campylobacter aangeduid) in pluimvee, verse pluimveeproducten en omgevingsmonsters zoals mestmonsters en blindedarm mestmonsters. 2 Normatieve verwijzingen NEN-EN-1SO : 1 999, Microbiologie van voedingsmiddelen en diervoeders; Voorbereiding van het monster en bereiding van verdunningen door microbiologisch onderzoek; Deel 1 : Algemene regels voor de bereiding van de primaire verdunning en verdere decimale verdunningen. NEN-EN-IS : 2002, Microbiologie van voedingsmiddelen en diervoeders; Voorbereiding van monsters en bereiding van verdunningen voor microbiologisch onderzoek; Deel 2: Specifieke werkwijze voor vlees en vleesproducten. NEN-IS :1996, Microbiologie van voedingsmiddelen en diervoeders - Algemene regels voor microbiologische onderzoeken. NVN-ENV-IS :2000, Microbiologie van voedingsmiddelen en diervoeders; Richtlijnen voor de kwaliteitsborging en productie van kweekmedia; Deel 1 : Algemene richtlijnen voor kwaliteitsborging van de voorbereiding van kweekmedia in het laboratorium 3 Termen en definities Campylubacter: micro-organismen die de voor deze bacteriën karakteristieke groei vertonen en specifieke morfologische, biochemische en serologische reacties vertonen wanneer wordt gekweekt respectievelijk getest volgens de beschreven werkwijze. 4 Beginsel Mestmonsters en blindedarm mestmonsters worden rechtstreeks geënt op een selectieve vaste voedingsbodem (mccda). Pluimveeproducten (bijvoorbeeld vel van de borstkap of filet) worden in porties van 25 gram gedurende I minuut gestomacherd met 1 O0 ml selectief ophopingsmedium (Prestoni. Hierna wordt het monstermateriaal verwijderd en alleen het ophopingsmedium gedurende 24 uur bebroed bij 41,5 OC. Vervolgens wordt afgeknt op een selectieve vaste voedingsbodem (mccda). Selectieve vaste voedingsbodems worden microaëroob gedurende 48 uur bij 41,5"C bebroed, waarna beoordeeld wordt op aanwezigheid van specifieke kolonies. Specifieke kolonies worden bevestigd met behulp van oxidase reactie en microscopie. Als extra controle wordt een deel van de isolaten biochemisch en/of serologisch bevestigd. 23

24 5 Voedingsmedia en verdunningsvloeistoffen 5.1 Algemeen Gebruik materialen die voldoende zuiver zijn. Gebruik gedestilleerd of op een andere wijze gedemineraliseerd water. Het water mag geen voor micro-organismen giftige bestanddelen bevatten. Voor een goede reproduceerbaarheid van de resultaten verdient het aanbeveling uit te gaan van in de handel verkrijgbare droge ingrediënten of geschikt bevonden droge voedingsmedia. De instructies van de fabrikant voor de bereiding moeten nauwgezet worden gevolgd. Gebruik voor de meting van de ph een ph-meter; referentietemperatuur 25OC. Indien het voedingsmedium niet direct wordt gebruikt, moet dit in het donker tussen 1 OC en 5 O C worden bewaard en onder omstandigheden waarbij geen veranderingen in de samenstelling optreden. Bewaar het voedingsmediurn niet langer dan een maand, tenzij elders in dit protocol anders wordt aangegeven. Er mag ook gebruik worden gemaakt van media die kant-en-klaar commercieel verkrijgbaar zijn. 5.2 Selectief ophopingsmedium: Preston bouillon (zónder paardenbloed) Preston basismedium Samenstelling Vleesextractpoede ra 10,o g Pepton a 10,o 9 Natrium chloride a 5,O 9 Natrium pyruvaatb 0,25 g Natrium metabisulfietb 0,25 9 Ijzer (li) sulfaatb (FeS04.7HzO) 0,25 g Water 1 O00 mi OPMERKING ook tezamen kant-en-klaar verkrijgbaar onder de naam Nutriënt Broth No.2 ook tezamen verkrijgbaar als supplement (zgn. "groeisupplement" of FEP supplement) Bereiding Los de ingrediënten op in het water (indien nodig d.m.v. verhitting). Stel de ph zo in dat deze na sterilisatie 7,5 k 0,2 bedraagt bij 25OC. Steriliseer gedurende 15 minuten bij (1 21 % 1 I OC. 24

25 5.2.2 Preston antibiotica oplossing Samenstelling Polymyxine-B 5000 Rifampicine 0,Ol Trimethoprirn lactaat 0,Ol Amphotericine-B 0,Ol Water Bereiding OPMERKING Deze antibiotica zijn ook tezamen verkrijgbaar als Preston supplement. Let op, ook het "vroeger" gebruikte Preston supplement, met cycloheximide in plaats van amphotericine-b, is nog steeds verkrijgbaar. De voorkeur wordt echter gegeven aan gebruik van supplement met amphotericine-b. Los de antibiotica op in het water en steriliseer door middel van filtratie (0,22 pm filter) Compleet Preston ophopingsmedium samenstelling compleet Preston ophopingsmedium Basismedium 1 O00 ml Antibiotica oplossing 4 ml Bereiding compleet Preston ophopingsmedium Koel het basismediurn af tot onder de 45OC. Voeg op aseptische wijze de antibiotica oplossing to en meng z rgvuldig. OPMERKING in de originele beschrijving van Preston ophopingsmedium {en in daarop volgende beschrijvingen in bijvoorbeeld ISO) wordt paardenbloed gebruikt. In dit NEN voorschrift wordt echter geen paardenbloed toegepast, omdat uit recent onderzoek is gebleken dat dat voor onderhavige monstermatrix niet noodzakelijk is (Jacobs-Reitsrna et al., 2003). 5.3 Selectieve voedingsbodem: modified Charcoal Cefoperazone Deox ychola te Agar ImCCDAI 25

26 5.3.1 mccda Basismedium I Samenstetling Vleesextract poeder a Pepton Natrium chloride a Bacteriologische charcoal Ca s eïn e h y d ro I y sa a t Natrium deoxycholaat Ijzer (li) sulfaat IFeS04.7HzO) Natriumpyruvaat Agar Water 10,o 10,o 5,O 4.0 3,O 1,o 0,25 0,25 12,o 1 O Bereiding OPMERKING a ook tezamen kant-en-klaar verkrijgbaar onder de naam Nutriënt Broth No.2. Los de ingrediënten op in het water (indien nodig d.m.v. verhitting). Stel de ph zo in dat deze na sterilisatie 7,4 k 0,2 bedraagt bij 25T. Steriliseer gedurende 15 minuten bij (1 2f * 11 C mccda antibiotica supplement Samenstelling Cefoperazone Amphotericine-B Water Bereiding OPMERKING Deze antibiotica zijn ook tezamen verkrijgbaar als mccda supplement. Los de antibiotica op in het water en steriliseer door middel van filtratie (0,22 pm filter) Complete mccda voedingsbodem Samenstelling Basismedium 1 O00 Antibiotica oplossing 4 ml ml Bereiding Koel het basismedium af tot ongeveer 45 C. Voeg op aseptische wijze de antibiotica oplossing toe en meng zorgvuldig. Giet de agar uit in petrischalen met nok en laat stollen. 26

27 5.4 Bevestigingsmedia Oxidase reagens Samenstelling N,N,N, N -tetramethyl-i,4-fenyleendiarnmoniumdihlo~ide 0,l gram Water 10 ml Bereiding Los het N,N,N,N -tetramethyi-1,4-fenyleendiamrnoniumdihloride op in het water. Bereid het reagens vlak voor uitvoering van de oxidasetest. Dit reagens is ook kant-en-klaar commercieel verkrijgbaar. Handel dan volgens de gebruiksaanwijzing van de fabrikant Latexagglutinatietest voor bevestiging van Campyiobacrer LI at ex a g g I u t i nat i e test en voor bevestig in g va n t h e r rn o t o I e ra n t e Camp ylob a c ter z ij n commerciëel verkrijgbaar. Enkele leveranciers staan vermeld in Bijlage A Triple Sugarllron agar (TSI) Samenstellincr - Vleesextract Gistextract Pepton Natriumchloride Lactose Sucrose Glucose IJzer (IIII citraat Natriumthiosuifaat Fenol rood Agar Water 3,O g 3,o 9 20,o g 5,O g 10,o g 10,o 9 1,o 9 0,3 9 0,3 9 0,024 g 12,o 9 1 O00 mi Bereiding Los de ingrediënten op in het water (indien nodig d.m.v. verhitting). Stel de ptl zo in dat deze na sterilisatie 7,4 k 0,2 is. Verdeel het medium over geschikte reageerbuizen, 1 O ml medium per buis. Steriliseer gedurende 1 5 minuten bij (1 21? 11 C. Laat de agar stollen, zodat er bovenop 2,5 cm agar onderin de buis, nog een schuin gedeelte ontstaat. 27

28 6 Toestellen, glaswerk en hulpmiddelen Gebruikelijke toestellen en steriel glaswerk voor microbiologische laboratoria (zie ook NEN- IS ) en in het bijzonder de onderstaande: 6.1 Broedstoof voor het bebroeden bij (41,s & 1)'C. 6.2 Suspendeertoestel, Stornacher 6.3 Geschikte apparatuur en hulpmiddelen om te bebroeden in een micro-aërobe atmosfeer (ca. 6% zuurstof, 10% kooldioxide en 84% stikstof). Voor het verkrijgen van rnicroaëroob milieu kan gebruik gemaakt worden van commerciële systemen {'gas-za kjes'). 6.4 Microscoop, bij voorkeur met fase-contrast, vergroting 1 OOOx. OPMERKING Gesteriliseerde materialen voor éénmaiig gebruik mogen worden toegepast 7 Monstername Monstername is geen onderdeel van de methode zoals beschreven in deze norm. PVE de procedure voor de monstername in een apart besluit vastgelegd. ieeft Bederfelijke piuimveeproducten zoals borstvellen en filet dienen gekoeld (1-4O) te worden aangeleverd. Zie voor de acceptatie criteria voor monstermateriaal bijlage V. Indien bij het aanleveren van de monsters afwijkingen worden geconstateerd in de wijze waarop de monsters aangeleverd moeten worden, dan dient het laboratorium hierover schriftelijk een opmerking te maken richting opdrachtgever. Campylobacfer is zeer gevoelig voor invriezen en daarom is het invriezen van monsters niet toegestaan. Monsters dienen binnen 48 uur na monstername te worden ingezet. 8 Werkwijze 8.1 Algemeen In alle gevallen geldt dat de agarplaten na beënten zonder uitstel onder micro-aërobe condities geïncubeerd dienen te worden, omdat Carnpylobacter obligaat micro-aërofiel is en onder andere omgevingscondities snel afsterft. 8.2 Direct uitplaten Monstervoorbehandeling Monsters waarin hoge aantallen Campylobacfer worden verwacht, zoals mest en blindedarm, worden rechtstreeks op het isolatiemedium afgestreken. Maak 1 mengmonster van de 30 afzonderlijke blindedarmen door deze elk op steriele wijze open te knippen en uit elke darm een evenredige hoeveelheid materiaal over te brengen in een lege steriele petrischaal. Meng goed (bijvoorbeeld met een steriele cwab of entoog) Isolatie Beënt vanuit het mengmonster met behulp van de swab of entoog een halve mccda-plaat. Beënt de rest van de plaat middels verdunningsstrepen met behulp van een steriele öse, zodanig dat na incubatie losliggende kolonies kunnen ontstaan. Incubeer mccda platen micro-aëroob gedurende 48 (+ 4) uur bij 41,5 (k l)dc. 28