Cover Page The handle http://hdl.handle.net/1887/22715 holds various files of this Leiden University dissertation. Author: Waterreus, Willem-Jan Title: Software developments in automated structure solution and crystallographic studies of the Sso10a2 and human C1 inhibitor protein Issue Date: 2013-12-05
Nederlandse samenvatting Eiwitten zijn de moleculaire raderen van het leven en spelen een centrale rol in vrijwel alle cellulaire processen. De vergisting van wort tot bier, fotosynthese in planten, de vermeerdering van erfelijk materiaal, de doorgave van stimuli in zenuwcellen en de verdediging tegen ziekteverwekkers zijn slechts enkele van de processen waarbij verschillende eiwitten tezamen een bijdrage leveren in zeer complexe, doch goed georganiseerde systemen. De rol van een enkel eiwit in zo n systeem kan vaak begrepen worden vanuit de driedimensionale structuur. Deze kan inzicht geven in het verloop van de chemische reacties en moleculaire interacties waaraan het eiwit zijn functie ontleent. Daarbij kan de globale vouwing van het eiwit van belang zijn, maar ook de plek en reactiviteit van de individuele aminozuren, de bouwstenen waaruit eiwitten bestaan. Verreweg de meerderheid van de eiwitstructuren wordt bepaald middels röntgendiffractie. Hierbij wordt een kristal met een zeer smalle monochromatische röntgenbundel vanuit verschillende hoeken bestraald. Uit de resulterende verstrooiingspatronen kan middels fouriertransformatie de elektronendichtheid in het kristal verkregen worden, waaruit vervolgens de molecuulstructuur, ook wel kristalstructuur genoemd, afgeleid kan worden. Behalve fundamenteel inzicht in de werking en de ontstaansgeschiedenis van het leven, kan kennis van de kristalstructuur van een eiwit dat betrokken is bij een ziekteproces bijdragen tot ontwikkeling van nieuwe medicijnen. Kennis en gerichte aanpassing van de structuur van eiwitten die gebruikt worden in industriële toepassingen 123
kunnen kostenbesparingen en nieuwe producten opleveren. De organisatie van chromatine is essentieel in alle organismen. Niet alleen vanwege haar rol in het efficiënt verpakken van het DNA zodat het in de cel of celkern past, maar ook door de betrokkenheid van chromatineorganisatie bij allerlei cellulaire processen. Door bijvoorbeeld lokaal het DNA toegankelijker of juist meer compact te maken kan de expressie van een gen beïnvloed worden. Chromatine-eiwitten kunnen het DNA samentrekken door het DNA te buigen of door een DNA streng op twee verschillende plekken te binden en zo lussen te vormen. Andere chromatine-eiwitten maken het DNA meer compact door als een spoel met DNA omwikkeld te worden. Hoofdstuk 4 beschrijft de structuur van het Sso10a2 eiwit uit de Archaeon Sulfolobus solfataricus. Tezamen met de homologe eiwitten Sso10a en Sso10a3 speelt Sso10a2 mogelijk een rol in chromatinedynamiek en -organisatie in S. solfataricus. Sso10a2 vormt een uitermate stabiele dimeer waarbij de lange C-terminale α-helix een belangrijke rol speelt. Daarnaast bevat de Sso10a2 monomeer een DNAbindend domein dat ook in andere chromatine-eiwitten is geïdentificeerd. Ten opzichte van de Sso10a structuur zijn een aantal van de secundaire structuurelementen in het DNA-bindende domein van de Sso10a2 monomeer verschoven, wat mogelijk van invloed is op de binding van DNA. Ruconest is een recombinant C1INH eiwit dat recentelijk is goedgekeurd voor behandeling van patiënten met hereditair angio-oedeem. C1INH behoort tot de familie van serpineproteaseremmers en reguleert ontstekingsprocessen in het bloed door het voorkomen van spontane activatie van het complementsysteem. Genetische C1INH deficiëntie veroorzaakt hereditair angio-oedeem. Deze ziekte gaat gepaard met zwellingen die levensbedreigend kunnen zijn wanneer ze voorkomen in de bovenste luchtwegen. Hoofdstuk 5 beschrijft de succesvolle kristallisatie van twee varianten van het recombinante C1INH eiwit. Van beiden is aangetoond dat ze hun remmende activiteit in vitro behouden. In tegenstelling tot de eerder opgeloste latente structuur van C1INH zijn beide varianten gekristalliseerd met de glycosilering intact. Mogelijkerwijs verschaft de structuur meer inzicht in de actief latent transitie welke voor deze ser- 124
pine nog niet volledig is opgehelderd. Om de kristalstructuur middels fouriertransformatie uit de diffractiepatronen te berekenen zijn zowel de intensiteit van de verstrooide röntgenbundels als hun onderlinge fases nodig. De intensiteit is gemakkelijk te meten met behulp van een röntgendiffractometer, echter de faserelatie kan niet direct experimenteel bepaald worden. Dit probleem is in de kristallografie bekend als het faseprobleem. Hoofdstuk 1 geeft een overzicht van de verschillende methoden die in de loop der jaren ontwikkeld zijn om het faseprobleem op te lossen. Hierbij zijn grofweg twee verschillende benaderingen te onderscheiden. Een techniek die de afgelopen jaren erg populair is geworden, maakt gebruik van een gelijkende reeds bekende eiwitstructuur om een eerste schatting van de fases van de onbekende structuur te verkrijgen. De tweede groep methoden maakt gebruik van informatie uit het diffractie-experiment om een deel van de molecuulstructuur en vervolgens de fase-informatie voor het gehele molecuul te achterhalen. Het verkrijgen van de fase-informatie op deze manier wordt ook wel experimentele fasebepaling genoemd. Om de structuurbepaling te vereenvoudigen en sneller te maken zijn veel van de taken in de structuuranalyse geautomatiseerd. Het programma Crank koppelt verschillende programma s die elk afzonderlijk een enkele taak uitvoeren in de structuuroplossing middels experimentele fasebepaling. Hierdoor is het mogelijk voor een eiwit van gemiddelde grootte met verstrooiingspatronen van goede kwaliteit binnen enkele uren een vrijwel volledig model te genereren. In hoofdstuk 2 komen de vele verbeteringen in Crank aan bod die bij tests met meer dan honderd verschillende datasets tot structuren leidden die aanmerkelijk meer volledig zijn dan bij een vorige versie van Crank. Daarnaast zijn enkele structuren opgelost met de nieuwe versie die voorheen nog niet automatisch opgelost konden worden. Veel van de verbeteringen in Crank hebben hun oorsprong in nieuwe geavanceerde waarschijnlijkheidsfuncties waarmee meerdere bronnen van (experimentele) informatie tegelijkertijd beschouwd kunnen worden en welke de correlaties tussen verschillende bronnen van informatie 125
in acht nemen. Daarnaast kan ook de experimentele foutmarge beter worden gemodelleerd met dit type functies. Hoofdstuk 3 beschrijft de toepassing van de nieuwe SAD-DM waarschijnlijkheidsfunctie die faseinformatie na experimentele fasebepaling combineert met fases verkregen vanuit empirisch verbeterde elektronendichtheid. Vaak is de elektronendichtheid in eerste instantie van onvoldoende kwaliteit om een model van de eiwitstructuur in te bouwen. Door gebruik te maken van kennis over de typische verdeling van de elektronendichtheid in een kristal kan deze verbeterd worden. Zo varieert de elektronendichtheid bijvoorbeeld sterk op plaatsen waar eiwit zit en is deze uniform in de tussenruimte tussen verschillende eiwitmoleculen in het kristal. De verbeterde fases worden verkregen door inverse fouriertransformatie van de verbeterde elektronendichtheid en gecombineerd met de oorspronkelijke experimenteel bepaalde fases. Dit proces wordt herhaald totdat de elektronendichtheid niet langer noemenswaardig verbetert. De nieuwe SAD-DM functie voor fasecombinatie is een aanmerkelijke vooruitgang in vergelijking met het meest gebruikte algoritme σ A. Dit komt onder andere doordat de SAD-DM functie in tegenstelling tot σ A er bij de fasecombinatie niet vanuit gaat dat de oorspronkelijke en verbeterde fases onafhankelijk van elkaar zijn. Het verkrijgen van een goed verstrooiend eiwitkristal is een proces dat maanden tot jaren in beslag kan nemen. Echter een goed verstrooiend kristal is geen garantie dat de structuur opgelost kan worden. In veel gevallen bevatten de diffractiepatronen hiertoe niet genoeg informatie. Dankzij de geavanceerde waarschijnlijkheidsfuncties zoals beschreven in hoofdstuk 2 en 3 kan de beschikbare data beter gebruikt worden. Zo kunnen structuren opgelost worden die met bestaande software niet of moeilijk op te lossen zijn.