Nederlandse samenvatting voor geïnteresseerden buiten dit vakgebied Modellen Lego voor het leven Wij mensen houden van modellen. Als kinderen beginnen wij de opbouw van dingen te begrijpen door ze met behulp van bijvoorbeeld lego na te bouwen. Op latere leeftijd gebruiken ingenieurs, architecten of constructeurs modellen om grote of kleine dingen te testen voordat zij op de uiteindelijke schaal gebouwd kunnen worden. Op deze manier kun je leren of processen en constructies technisch mogelijk zijn, je kunt risico s inschatten en toepassingen nog wel makkelijk uitvoeren. Dus modellen hebben in deze tijd een vrij grote impact op het dagelijkse leven. Maar ook in de wetenschap van het leven zelf, de biologie, gebruiken wij modellen om ingewikkelde processen te kunnen volgen. Je kan namelijk niet altijd direct een heel mens op tafel leggen om iets te analyseren. Daarvoor pakt men daarom vaak een model, een lager organisme als bijvoorbeeld een bacterie. Een bacterie heeft slechts één cel, waartegenover mensen meerdere biljoenen daarvan hebben. Maar kan dus een bacterie, opgebouwd uit maar een cel een goed model zijn voor menselijke processen? Als men in de literatuur kijkt kan het antwoord alleen ja zijn. Een van de bekendste en meest gebruikte bacteriële modellen is de bacterie Escherichia coli. De Nobelprijswinnaar Jaques Monod heeft ooit over deze bacterie gezegd: Anything found to be true for E. coli must also be true for the elephants. Omdat heel veel processen in het leven universeel zijn, dus in mens, dier, plant en ook in bacteriën heel erg op elkaar lijken, bekijken biologen deze processen vaak in bacteriën. In bacteriën zijn de componenten van het leven soms wat eenvoudiger opgebouwd, hebben minder onderdelen of zijn zo stabiel dat ze geïsoleerd 111
bestudeerd kunnen worden. In dit proefschrift gaat het om een model voor mechanosensitieve kanalen. Deze kanalen spelen in ons lichaam verschillende rollen. We hebben ze nodig om te horen, te voelen, onze bloeddruk te reguleren en voor nog vele andere dingen. In de bacterie werkt dit kanaal op het moment dat de druk in de cel oploopt. Om te voorkomen dat de cel ontploft, opent het kanaaltje in de cel- omsluitende membraan en worden water of andere kleinen moleculen eruit gelaten. Dit proces werkt een beetje zoals de ketchupflessen van tegenwoordig. Als je ze samendrukt bouw je binnen in de fles druk op. Pas nadat de druk groter is dan de weerstand van het ventiel komt de ketchup eruit, meestal ongecontroleerd; zo ook in de bacteriële cel. Als we nu even bij de ketchupfles blijven, en je even naar het ventiel kijkt, dan zie je dat dit opgemaakt is uit kunststof lamellen die naar de binnenkant van de fles wijzen. Als je nu voorzichtig druk opbouwt, verandert de positie van de lamellen, in de biologie zou je dat verandering van conformatie noemen. Nog even wat meer druk en het ventiel opent en de ketchup komt eruit. Ons kanaaltje, het heet trouwens MscL, is ook uit een soort van lamellen opgebouwd, vijf om precies te zijn. Figuur 1 Tegenoverstelling van het ventiel van een ketchupfles (links) en het ventiel van een bacteriële cel (rechts). Om te begrijpen hoe dit kanaaltje werkt willen wij er net zo nauwkeurig naar kunnen kijken als we het net met de ketchupfles hebben gedaan. We willen weten wat er in het begin gebeurt, als de druk in de cel oploopt, hoe 112
de conformatie vervolgens verandert en hoe en wanneer het kanaal uiteindelijk opent. Het probleem is, dit kanaaltje is heel erg klein. Ruim vijf nanometer doorsnee en daarmee veel te klein om er met een gewone microscoop naar te kijken. Het is ook nog te klein om er met een buitengewoon krachtige microscoop naar te kijken. Verder is het uit vijf identieke onderdelen opgebouwd. Dus hoe maak je iets zichtbaar of grijpbaar dat te klein is om te zien en zich verder nog gedraagt als een identieke vijfling met dezelfde kleren aan. Ik denk dat niemand van ons ooit met identieke vijflingen heeft gepraat, maar als je daarover nadenkt dat er vijf keer dezelfde persoon voor je staat, met geen enkele verschil en ze bewegen ook nog, hoe onthoud je in zo n situatie met wie je al gepraat hebt? Je zou bijvoorbeeld elke vijfling een ander t- shirt kunnen geven. Dat is makkelijk met mensen maar voor het kanaaleiwit MscL is dit niet zomaar mogelijk. Daarom hebben wij in hoofdstuk 2 een nieuwe methode beschreven, die ontwikkeld is om de vijfling MscL voor het eerst twee verschillende t- shirts te geven. En omdat in de bacteriële celmembraan niet maar een MscL vijfling aanwezig is, maar honderden of duizenden kun je allerlei verschillende combinaties krijgen. Soms heb je vijf, die allemaal hetzelfde t- shirt van de ene kleur, zeg maar grijs, aanhebben, en dan heb je natuurlijk ook mengsels van bijvoorbeeld een grijs t- shirt en vier oranje t- shirts. Bont gemengde vijflingen zul je trouwens meer tegenkomen dan vijflingen met allemaal hetzelfde t- shirt aan. Nu we de onderdelen van ons kanaaleiwit met grijze en oranje t- shirts iets makkelijker kunnen onderscheiden willen we nog een stapje verder gaan en ze allemaal sorteren in groepen. Dat betekent alle vijflingen met alleen oranje of alleen grijze t- shirts vormen een groep en zo ook de mogelijke mengsels van vier oranje plus een grijze, drie oranje plus twee grijze, twee oranje plus drie grijze en uiteindelijk ook een oranje plus vier grijze t- shirts; zes groepen in 113
totaal dus. Aan de groepen van alleen een kleur hebben we niks, dus die laten we in het vervolg weg. Wat overblijft zijn vier bont gemengde groepen met een gedefinieerde samenstelling. In het eiwit MscL lopen de vijflingen niet door elkaar, ze vormen een mooie cirkel. Figuur 2 Het eiwit MscL (links) en vijflingen met of zonder t- shirts. Allebei vormen hier een cirkel, waarbij MscL een centrale porie omsluit. Door een chemisch label te gebruiken kunnen wij een van de onderdelen van MscL met een soort t- shirt voorzien (beneden, oranje) Deze cirkel omsluit een centrale opening, de porie. Deze porie is, net als de ketchup fles, de meeste tijd gesloten en water en kleine moleculen komen er niet doorheen. Terwijl het ventiel van de ketchup fles helemaal dicht lijkt, is het een klein beetje anders met MscL. Er komt niks doorheen, maar als men naar de structuur kijkt, dan ziet men dat er wel een open porie lijkt te zijn. In hoofdstuk drie, vier en vijf kijken wij ernaar hoezo het op een 114
open porie lijkt maar wel gesloten is. Bij deze experimenten spelen de vijflingen met oranje en grijze t- shirts een heel belangrijke rol. Maar eerst even wat uitleg over wat het probleem eigenlijk is. Waar de porie open lijkt te zijn is deze opgebouwd uit bouwstenen, aminozuren, die waterafstotend zijn. Dit is niet alleen in MscL het geval, maar ook in heel veel andere kanalen, de zogenaamde ionenkanalen. Ionenkanalen maken onder andere deel uit van het zenuwstelsel in ons lichaam. Dus, wat je hier leest, snap je ook doordat ionenkanalen openen en dichtgaan en er zo signaalstoffen doorheen kunnen gaan. MscL behoort ook tot de ionenkanalen, maar niet echt bij een zenuwstelsel. Wat weten wij nu over de waterafstotende regio van ionenkanalen? Heel lang hebben wetenschappers gespeculeerd dat de waterafstotende aminozuren betrokken zijn bij het aannemen van een gesloten conformatie, omdat ze zich elkaar van het water beschermen door dicht bij elkaar te komen. Hoewel ze wel dicht bij elkaar komen, zit er vaak toch nog zoveel ruimte tussen de onderdelen van het kanaal, dat er eigenlijk nog wel water doorheen zou kunnen gaan. Dat is echter niet het geval en deze situatie noemen we hydrophobic gating. De regio is zo waterafstotend dat water er niet doorheen kan gaan, hoewel er dus wel ruimte voor zou zijn. Door de vijandige interactie tussen water en de waterafstotende moleculen wordt water als het ware verdampt en kan daardoor niet meer vloeien. Dus terwijl het kanaal fysiek wel open staat is hij functioneel dicht door water te verdampen. Als nu door bijvoorbeeld een kleine beweging van moleculen in de porie, of onderdelen daarvan, veranderingen in deze regio gebeuren, en dan met name de waterafstotende karakter daarvan afneemt, dan, zo wordt gespeculeerd, opent de porie en kunnen water of andere moleculen er doorheen gaan. Zover de theorie; praktisch is dit niet echt makkelijk aan te tonen, onder andere doordat heel veel ionenkanalen drie-, vier- vijf- of nog meerlingen zijn met allemaal dezelfde t- shirts. Als je bij 115
zo n kanaal iets probeert te veranderen dan doe je dat in alle onderdelen tegelijk. Op zo n moment schiet je voorbij je doel want je doet te veel op een moment. Maar omdat wij nu MscL met twee kleuren t- shirts hebben, kunnen we bijvoorbeeld alleen met diegene van de vijfling praten die een oranje shirt aanhebben. Omdat alle onderdelen van MscL met elkaar contact hebben, net zo als vijflingen die elkaar bij de hand pakken en een soort cirkel vormen, betekent praten met de ene ook dat er misschien iets gebeurt met zijn buren. Dat kan je niet zien, maar men kan het met behulp van elektrofysiologie wel meten. Simpel gesproken meet je daarbij de elektrische stroom die door zo een kanaal vloeit. Dat doe je met een patch clamp instrument. Een patch clamp instrument is een mikroskoop gekoppeld aan extra gevoelige elektrodes. Een van de elektrodes zit in een hele dunne glazen capillaire, een andere zit in een reservoir. In het reservoir zwemmen vetbolletjes met MscL daarin, zogenaamde liposomen. Zo n bolletje pak je met de capillaire en de vetmembraan sluit de capillaire af. Daardoor zijn de twee elektrodes van elkaar gescheiden en je kan er geen stroom tussen meten. Als we nu een bouwsteen van MscL aanspreken, hem wateraantrekkend maken, dan gebeurt er iets in de porie, het beweegt een beetje, gaat open en wij kunnen stroom meten. Aangezien dat ik het eerder daarover had dat de porie niet helemaal dicht is, vraag je jezelf misschien af hoezo er geen stroom gemeten kan worden. Stroom kan je alleen meten als er ionen door het kanaal gaan. Ionen gaan alleen door MscL heen als ze in water opgelost zijn. Dus zolang de hydophobic gate dicht zit meet je niks, maar zodra het opent, en water in de porie terecht komt, meet je een stroom. En deze stroom zegt onder gegeven omstandigheden ook nog iets over hoe ver de porie opent, alleen een klein beetje of helemaal. In hoofdstuk vier en vijf hebben wij bepaald wat er gebeurt als we een, twee, drie, vier of alle vijf bouwstenen aanspreken. Daardoor konden wij voor de eerste keer überhaupt experimenteel 116
aantonen dat het systeem van een hydrophobic gate gevoelig is voor veranderingen in alleen een van de bouwstenen. Verder konden wij door de combinatie van deze techniek met een andere techniek zien hoever het kanaal opent als men de verschillende onderdelen aanspreekt. Dit allemaal is nog steeds fundamenteel onderzoek, maar het zou wel toepasbaar kunnen zijn in de toekomst. Aangezien dat ionenkanalen belangrijk zijn in ons zenuwstelsel, en aangezien wij mechanosensitieve kanalen nodig hebben om te voelen en te horen, en misschien nog belangrijker om onze bloeddruk in de gaten te houden, zullen de resultaten beschreven in dit proefschrift op langere termijn ook heel belangrijk zijn. Maar daarvoor moet wel eerst aangetoond worden dat het ook voor andere modellen naast MscL geldig is. 117
118