MYCOTOXINES en DIERGEZONDHEID Siska Croubels Laboratorium voor Farmacologie en Toxicologie Salisburylaan 133 9820 Merelbeke WVPA België - Agriflanders - 10.01.2013 Labo voor Farmacologie & Toxicologie Vakgroep Pathologie, Bacteriologie en Pluimveeziekten MYCOTOXINES μυκης + τοξικόν (schimmel toxine) toxinen gevormd door schimmels behorend tot de genera Aspergillus, Penicillium en Fusarium toxinevorming afhankelijk van factoren zoals subspecies van de plant, heersend klimaat en landbouwpraktijk historisch probleem Claviceps purpurea: ergotisme (Pieter Bruegel, 1568) (H. Bosch, 1495-1515) 1
OVERZICHT Deel I: Meest voorkomende mycotoxines bron preventie toxiciteit toxicokinetiek pathogenese symptomen en letsels - Aflatoxines - Trichothecenen: DON en T2-toxine - Zearalenone - Fumonisines - Ochratoxines OVERZICHT Deel II: Onderzoeksresultaten Invloed van Fusarium mycotoxines op de darmgezondheid bij vleeskippen (Ann Osselaere) Invoed van Fusarium mycotoxines op aviaire macrofagen en hun interactie met Aspergillus fumigatus (Shaoji Li) Het mycotoxine deoxynivalenol (DON) als predisponerende factor voor necrotische enteritis bij vleeskuikens (Gunther Antonissen) ONDERZOEKSPROJECTEN Assistentenmandaat Virginie Vandenbroucke, 2006-2012 Invloed van deoxynivalenol op de darmgezondheid en het verloop van een Salmonella Typhimurium infectie bij het varken IWT project, 2008-2012 Invloed van Fusarium toxines op de darmgezondheid bij het varken in het kader van de ontwikkeling van bestrijdingsmaatregelen Doctoraatsbursalen Joline Goossens en Elin Verbrugghe UGent project, 2009-2013 Invloed van Fusarium toxines op de orale resorptie en biotransformatie mechanismen bij de kip Doctoraatsbursaal Ann Osselaere IWT specialisatiebeurs Mathias Devreese, 2010-2014 Ontwikkeling van in vitro en in vivo modellen voor veiligheid- en efficaciteitsstudies van mycotoxine binders en modifiers 2
ONDERZOEKSPROJECTEN Sector gesponsord project, 2011-2015 Interacties tussen deoxynivalenol, Clostridium perfringens en Salmonella Enteritidis in vleeskippen Doctoraatsbursaal Gunther Antonissen FOD Volksgezondheid, 2012-2015 Onderzoek naar de invloed van mycotoxine binders op de orale biologische beschikbaarheid, farmacokinetiek en weefselresiduen van geneesmiddelen aangewend bij pluimvee en varkens Doctoraatsbursaal Thomas De Mil UGent project, 2012-2016 Intestinale toxiciteit en orale resorptie van geconjugeerde Fusarium mycotoxines, frequent voorkomend in de (dier)voeding Doctoraatsbursaal Nathan Broekaert Assistentenmandaat Sophie Fraeyman, 2013-2019 Toxiciteit en toxicokinetiek van Alternaria mycotoxines bij varkens en pluimvee acute intoxicaties 1. effect van lage concentraties 2. effect van co-contaminanten? 3. nieuwe mycotoxines 4. merkers voor toxiciteit 5. gemaskeerde mycotoxines 3- en 15a-DON, DON-3-glucoside 6. mycotoxine binders www.mytox.be Multidisciplinair kenniscentrum: www.mytox.be 3
MYcotoxines entoxigene schimmels associatie onderzoeksgroep Preventie en controle van schimmels in voedsel en voeder Mycotoxine analyse en methode ontwikkeling Classificatie en identificatie van schimmels Effect van mycotoxines op dier- en humane gezondheid www.mytox.be 10 Mycotoxine Fungus Contaminant Fumonisines F. moniliforme maïs Trichothecenen: Deoxynivalenol (DON), T2-toxine Aflatoxines B1, B2, G1,G2 Ochratoxine A F. graminearum maïs, tarwe, gerst F. sporotrichioides A. parasiticus maïs, droge vruchten en noten, A. flavus oliehoudende granen en zaden A. ochraceus granen, wijn, bier, P. verrucosum koffiebonen Zearalenone 2009-2010 F. graminearum LEVER - LEVERFUNCTIE maïs, tarwe, gerst 12 4
Voornaamste klinische verschijnselen t.g.v. mycotoxicosis 1. Varken verminderde gewichtsaanzet verhoogde voederconversie fertiliteitsstoornissen huidaandoeningen 2. Pluimvee groeivertraging vette lever syndroom verminderde eischaalkwaliteit slechte karkaskwaliteit 3. Rundvee verminderde melkgifte fertiliteitsstoornissen mastitis ketonurie 4. Paard neurotoxisch syndroom OPNAME VAN LAGE GEHALTES GEEFT IMMUNOSUPPRESSIE Voornaamste TOXISCHE klinische EFFECTEN verschijnselen BIJ PLUIMVEE t.g.v. mycotoxicosis Animal feed contamination, effects on livestock and food safety, 2012 DS nov. 2010 5
Voornaamste klinische verschijnselen t.g.v. mycotoxicosis afhankelijk van - type en concentratie mycotoxine - duur van blootstelling - diersoort, geslacht, leeftijd, gezondheidsstatus - bedrijfsmanagement - synergistisch effect tussen diverse mycotoxinen ± 25% van alle grondstoffen besmet 75% met meer dan één toxine (Monbaliu et al., 2010) http://www.efsa.eu.int VOEDER Kwaliteitsbeoordeling van voeder (cfu/g) Kwaliteit bacteriën fungi goed < 2.10 6 3.10 4 aanvaardbaar 2-4.10 6 3-10.10 4 zwak 4-10.10 6 1-2.10 5 bedorven >10 7 >2.10 5 Staalname en analyse -best bij laden of lossen in graanstroom: sub-samples -of op elke 2 m hoogte, nooit homogeen verdeeld! -totaal 10-20 kg voor grote granen, 3-5 kg kleine granen -eventueel drogen voor transport -in papieren of katoenen zakken, invriezen stopt schimmelgroei -drietal subsamples voor analyse -ELISA (screening) of LC-MS/MS (bevestiging) STAALNAME VOEDER 6
Multi-mycotoxine methode UGent (LC-MS/MS) PREVENTIE voor de oogst ECB Varieteit Rotatie Zaaitijdstip Gewas densiteit Onkruidbestrijding Bemesting Irrigatie Insectenbestrijding Oogsttijdstip Apparatuur oogsten 7
PREVENTIE na de oogst Bewaaromstandigheden -vochtgehalte < 14% -minimale graanbeschadiging, gebroken of afwijkende korrels -risico s eigen producten (eigen kuil) Mycotoxine binders - diatomeeën aarde - aluminiumsilicaat klei - bentoniet, zeoliet, sepioliet - geactiveerde kool - gistcelwand gluco-mannanen Toxine Aflatoxine B1 95 DON 10 ZEA 52 FB1 45 % binding Mycotoxine modifiers - enzymen: epoxidase, lactonase, etc 8
Percentage positieve stalen, BEMEFA monitoring: www.bemefa.be 2011 2012 EU Commissie 2006/576 deoxynivalenol ppm (mg/kg) Deoxynivalenol 9
EU Commissie 2006/576 zearalenone ppm (mg/kg) EU Commissie 2006/576 fumonisine B1+B2 ppm (mg/kg) EU Commissie 2006/576 ochratoxine A ppm (mg/kg) 10
FAVV T2 en HT2-toxine Inventaris acties en actiegrenzen en voorstellen voor harmonisering in het kader van de officiële controles - Chemische contaminanten, residuen en additieven : 200 ppb in mengvoeders voor biggen / kalveren 400 ppb in mengvoeders voor pluimvee 500 ppb in mengvoeders voor mestvarkens Acute toxiciteit van mycotoxines Penicillium, Aspergillus en Fusarium spp Orale LD50 in muizen (mg/kg)? fumonisines, zearalenone 500 penicilliumzuur, mycophenolzuur 200 sterigmatocystine, luteoskyrine, sporidesmine, tenuazonzuur 100 rubratoxine B, citrinine 60 PR toxine 50 deoxynivalenol, ochratoxine A, gliotoxine 25 patuline, verruculogen, cyclopiazonzuur, citreoviridine 10 penitrem, aflatoxine B 1 muis, hamster 7 diacetoxyscirpenol, T - 2 toxine rat 5 fusarenon X aap 2 cavia 1 schaap, hond, kat 0.5 varken, konijn, eendekuiken AFLATOXINES Etiologie Aspergillus flavus Aspergillus parasiticus Aspergillus niger Toxine productie vnl. bij 30-37 C, o.a. schade ECB voornaamste bronnen: aardnoten, maïs, oliehoudende zaden en veevoedergrondstoffen afkomstig uit tropische en subtropische gebieden 11
B 1 : meest toxische en carcinogeen (o.a. ratten, eenden, forellen) IARC klasse 1A - Ames test en mutatie p53 gen B 2 : dihydroderivaat (minder toxisch, 20%), potentialiseert B 1 G 1 en G 2 : groen fluorescerend, minder toxisch (resp. 50% en 10%) Toxicokinetiek Orale resorptie: 100% Biotransformatie: 8,9 epoxidatie LEVER Eliminatie: urinair, biliair en melk (1-6%) Typische letsels MEGALOCYTOSE HEPATOCYTEN CENTROLOBULAIRE NECROSE GALGANGENPROLIFERATIE BLOEDSTOLLINGSSTOORNISSEN Pale bird syndroom Prof. J. Fink Diagnose Mycologisch onderzoek op voeder Scheikundig onderzoek op aflatoxines Probleem van correcte staalname! max. 20 µg/kg AFLB 1 Melk geeft gevaren voor de gezondheid: max. 0,05 µg/kg AFLM 1 Behandeling Vit K 1 en eiwitrijke voeding, cysteine 12
COMMISSIE DIRECTIEVE 2003/100/EC bijkomende factor cyclopiazonzuur: sterke inhibitor van CYP450 verantwoordelijk voor neurotoxische symptomen en chondrotoxiciteit Deze worden bijna uitsluitend waargenomen bij acute aflatoxicosis www.thepoultrysite.com DEOXYNIVALENOL en TRICHOTHECEEN TOXICOSE Fusarium graminearum, F. sporotrichioides, F. poae, F. equiseti Type B trichothecenen: deoxynivalenol (DON) (=vomitoxine) nivalenol (NIV) Type A trichothecenen: T2-toxine, HT2-toxine diacetoxyscirpenol (DAS) Bron: tarwe, maïs (wereldwijd vooral in gematigde streken 5 15 25 C), mout, T2-toxine in stro/stof 13
Fusarium head blight Toxicokinetiek Orale resorptie: 55-80% (bij het varken) Biotransformatie: de-epoxidatie, glucuronidatie Excretie: urinair en biliair Toxiciteit Inhibitie proteïnesynthese Vrijstelling IL-6, toename IgA Afname IgG, IgM IARC klasse 3 DON T2-toxine Symptomen varkens Abdominal distress syndrome DON of vomitoxine braken en/of gebrek aan eetlust (vanaf 2000 µg/kg) weigeren van voeder (vanaf 1200 µg/kg) verminderde voederopname (vanaf 1000 µg/kg) immunosuppressie (vanaf 100 µg/kg?) Scheikundige analyse: voeder, gal 14
DON conc (ng/ml) weight (gram) Kip: minder gevoelig aan DON 1800 Gewichtstoename 1600 1400 1200 1000 blank adsorb. low low + detox. 1 < 5 ppm 800 600 400 low + detox. 2 high high + detox. 1 high + detox. 2 > 5 ppm 200 0 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 days Osselaere et al., 2012 8 vleeskippen Toxicokinetiek studie DON n=4 orale bolus van 5 ppm DON intraveneuze bolus van 5 ppm DON n=4 Bloedstaalname tot 8 u erna Plasma DON 250 ORAAL/IV 200 150 Orale biologische beschikbaarheid 20% 100 mean OR mean IV 50 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Tijd (uur) 15
TRICHOTHECEEN TOXICOSE immunosuppressie, leukopenie (ALTA), locale necrose (dermatitis, conjuncitivitis en gastro-enteritis) hemorrhagische diathese Prof. J. Fink 4. Zearalenone ZEARALENONE Fusarium graminearum, F. culmorum Toxine: zearalenone, < 25 C en 16% RV Bron: maïs, tarwe, maïsglutenvoer Symptomen hyperoestrogenisme, gezwollen vulva, prolaps van de uterus, prolaps van het rectum, vulvovaginitis, geatrofieerde ovaria, verminderde hoeveelheid follikels gevolg: voornamelijk reproductiestoornissen gevoelige diersoorten: varken, schaap, hond, rund ZEARALENONE SYNDROOM 16
Toxicokinetiek Orale resorptie: 80-85% Biotransformatie: reductie tot, -zearalenol, verder tot -zearalanol (zeranol) en -zearalanol (taleranol) Excretie: urinair en biliair Binden op ER en ER -zearalenol factor 138 uterotropisme -zearalenol factor 0.5 IARC klasse 3 Fusarium moniliforme Fusarium proliferatum Fusarium subglutinans Toxinen: fumonisine B 1, B 2 en B 3, moniliformine Bron: maïs FUMONISINEN Pathogenese 1. Inhibitie sfinganine N-acyltransferase 2. Toename sfinganine en sfinganine /sfingosine ratio IARC klasse 2B, oesofagus kanker Orale resorptie: 3-6% (varken) Scheikundige analyse: voeder, Sa/So in serum en weefsels 17
Symptomen 1. paard equine leucoencephalomalacie (ELEM) necrose in cerebrum (ataxie, paresis, apathie, coma) + leveraandoeningen 2. varken 3. kippen longaandoening zonder koorts, porcine pulmonary oedema (PPE) longoedeem, hydrothorax, lever- en pancreasaandoeningen bewegingsstoornissen, immunosuppressie LOAEL: 2 mg/kg LG/dag voor broilers 2009-2010 LEVER - LEVERFUNCTIE 53 6. Ochratoxinen OCHRATOXINES Aspergillus ochraceus (Z) Aspergillus carbonarius Penicillium verrucosum (N) Toxinen: ochratoxine A, B en C toxiciteit toxine A > B citrinine Bron: granen, druiven, noten, vlees (mondiaal, vooral Noord-Europa) Symptomen NIERaandoeningen atrofie van renale tubuli, interstitiële renale fibrose, polyurie, immunosuppressie leverdegeneratie embryotoxiciteit en teratogeniteit 18
Toxicokinetiek Orale resorptie: +/- 65% 96 tot 99,8% plasma eiwitbinding OTA is substraat voor oatp (accumulatie nier) en voor ABC transporters Biotransformatie: hydroxylatie, conjugatie via glutathione en glucuronidatie Excretie: urinair en biliair, melk bij monogastrica gevoelige diersoorten varken (MPN = mycotoxic porcine nephropathy), kip, forel, hond, konijn, mestkalf inhibitie proteïnesynthese - Ochratoxine A is carcinogeen en is betrokken bij humane nierziekten, IARC klasse 2B b.v. Balkan endemische nefropathie niet mutageen, wel genotoxisch - Citrinine veroorzaakt nieraandoeningen, immunosuppressie is niet carcinogeen, wel mutageen OVERDRACHTSFACTOREN RESIDUEN 19
www.efsa.eu.int www.knowmycotoxins.com www.thepoultrysite.com www.mytox.be veterinaire.farmacotoxico@ugent.be Tel 09/264 73 46 20