Verspreiding: Algemeen Eindrapport Vlaams Humaan Biomonitoringsprogramma 2007-2011: Blootstelling-effect relaties bij moeder-kind koppels en jong volwassenen Eva Govarts 1, Liesbeth Bruckers 2, Melissa Paulussen 1, Elly Den Hond 1, Gudrun Koppen 1, Isabelle Sioen 3, Vera Nelen 4, Els Van de Mieroop 4, Marc Uytterhoeven 5, Adrian Covaci 6, Jan Vrijens 7, Nik Van Larebeke 8, Greet Schoeters 1 1 Milieurisico en gezondheid; Vlaamse Instelling voor Technologisch Onderzoek (VITO); Mol 2 Interuniversitair Instituut voor Biostatistiek en statistische Bioinformatica; Universiteit Hasselt (UHasselt); Diepenbeek 3 Vakgroep Maatschappelijke Gezondheidszorg; Universiteit Gent (UGent); Gent 4 Dienst Gezondheid; Provinciaal Instituut voor Hygiëne (PIH); Antwerpen 5 Laboratorium voor Arbeidsgeneeskunde, Toxicologie en Gerechtelijke analyses; Algemeen Medisch Laboratorium (AML); Antwerpen 6 Toxicologisch Centrum; Universiteit Antwerpen (UA); Antwerpen 7 Departement Analytische en Milieuchemie; Vrije Universiteit Brussel (VUB); Brussel 8 Vakgroep Radiotherapie en kerngeneeskunde; Universiteit Gent (UGent); Gent Studie uitgevoerd in opdracht van: Steunpunt Milieu en Gezondheid 2012/MRG/R/194 Juli 2012
Alle rechten, waaronder het auteursrecht, op de informatie vermeld in dit document berusten bij de Vlaamse Instelling voor Technologisch Onderzoek NV ( VITO ), Boeretang 200, BE-2400 Mol, RPR Turnhout BTW BE 0244.195.916. De informatie zoals verstrekt in dit document is vertrouwelijke informatie van VITO. Zonder de voorafgaande schriftelijke toestemming van VITO mag dit document niet worden gereproduceerd of verspreid worden noch geheel of gedeeltelijk gebruikt worden voor het instellen van claims, voor het voeren van gerechtelijke procedures, voor reclame of antireclame en ten behoeve van werving in meer algemene zin aangewend worden
Verspreidingslijst VERSPREIDINGSLIJST Steunpunt Milieu & Gezondheid, 2007-2011 I
Samenvatting SAMENVATTING Situering Tussen 2007 en 2011 werd de tweede generatie van de Vlaamse Humane Biomonitoringscampagne uitgevoerd door het Steunpunt Milieu & Gezondheid in opdracht van de Vlaamse overheid. Pasgeborenen en hun moeders kregen bijzondere aandacht in het milieugezondheidsonderzoek. De periode van differentiatie, snelle groei en aanleg van organen en weefsels bij de ontwikkelende foetus is bijzonder gevoelig voor invloeden van buitenaf. Chemische stoffen die vanuit de omgeving via het moederlichaam de foetus bereiken kunnen een nadelige invloed hebben. Naast de pasgeborenen en hun moeders werden ook jongeren (14-15 jaar) en jong volwassenen (20-40 jaar) betrokken in algemeen bevolkingsonderzoek. Jongeren groeien vaak op in eenzelfde streek, hebben nog geen beroepsblootstelling en zijn daarom interessant om op te nemen in een milieugezondheidsbewakingsnetwerk. Studiedesign en methode De deelnemers aan deze biomonitoringsstudie werden evenredig aan het bevolkingsaantal gerekruteerd in de vijf Vlaamse provincies. Via tien materniteiten (twee per provincie) werden 255 pasgeborenen en hun moeders opgenomen in de studie. Tweehonderdenvier volwassenen met een leeftijd tussen 20 en 40 jaar werden gerekruteerd onder de werknemers van alle provinciebesturen. De moeders stemden toe om een bloedstaal, een navelstrengbloedstaal en een haarstaal te geven voor onderzoek en om medische gegevens van de baby op te vragen. De volwassenen gaven een bloedstaal en een urinestaal. Daarnaast vulden alle deelnemers een uitgebreide vragenlijst in over persoonsgebonden kenmerken (geslacht, leeftijd, body mass index (BMI), algemene gezondheid, beroep,...), levensstijlfactoren (voeding, roken, ) en omgevingsfactoren (verkeersblootstelling, ). Op basis van deze gegevens werden referentiewaarden bepaald voor de aanwezigheid van vervuilende stoffen en de impact van milieuvervuilende stoffen op de gezondheid van de algemene Vlaamse bevolking. Biomerkers van blootstelling werden gemeten in navelstrengbloed, perifeer bloed, haar en urine; deze metingen weerspiegelen de interne blootstelling aan een vervuilende stof. Een effectmerker geeft een indicatie over de biologische of gezondheidseffecten die te wijten kunnen zijn aan blootstelling aan polluenten uit de omgeving. Door de blootstellingsmerkers vervolgens te koppelen aan de effectmerkers konden blootstelling-effect relaties bestudeerd worden. De gegevens over de blootstellings- en effectmerkers werden gesupplementeerd met gegevens over individuele gezondheid en levensstijl bekomen via de vragenlijsten om te corrigeren voor mogelijk beïnvloedende factoren. Een overzicht van de geanalyseerde blootstellings- en effectmerkers wordt gegeven in Tabel 1. Een uitgebreide beschrijving van de blootstellingsmerkers en de effectmerkers kan teruggevonden worden in het rapport van de referentiebiomonitoring 1. 1 Vlaams humaan biomonitoringsprogramma 2007-2011: resultatenrapport deel referentiebiomonitoring (2010). www.milieu-en-gezondheid.be II
Samenvatting Tabel 1: Overzicht biomerkers van blootstelling en effectmerkers. Biomerkers van blootstelling pasgeborenen en moeders (navelstrengbloed) lood arseen HBCD cadmium Calux (dioxine-achtige stoffen) TBBPA mangaan PCB s p,p -DDE koper HCB PFOS thallium BDE s PFOA moeder (bloed) lood mangaan thallium cadmium koper arseen moeder (haar) kwik methylkwik volwassenen (urine) cadmium 1-hydroxypyreen (PAK s) pesticide metabolieten arseen t,t -muconzuur (benzeen) HBA (parabenen) toxisch relevant arseen ftalaat metabolieten cotinine (tabaksrook) volwassenen (bloed) PFOS PFOA Effectmerkers pasgeborenen prematuur geboortelengte schildklierhormonen small for gestational age (SGA) hoofdomtrek geslachtshormonen geboortegewicht zwangerschapsduur metabole hormonen moeders astma eczeem zwangerschapsstimulatie hooikoorts allergie time-to-pregnancy (TTP) volwassenen astma allergie spermakwaliteit hooikoorts zwangerschapsstimulatie time-to-pregnancy (TTP) eczeem vruchtbaarheid (mannen) plaatjesfunctie (PFA) Afkortingen: PCB s: polygechloreerde bifenyls; HCB: hexachlorobenzeen; BDE s: gebromeerde difenylethers; HBCD: hexabromecyclododecaan; TBBPA: tetrabromebisfenol; p,p -DDE: p,p -dichloordiphenyldichloorethaan; PFOS: perfluoro-octaansulfonzuur; PFOA: perfluoro-octaanzuur; PAK s: polycyclische aromatische koolwaterstoffen; HBA: para-hydroxybenzoëzuur; PFA: platelet function assay Het onderzoek naar de relatie tussen blootstelling en effect werd gebaseerd op bestaande kennis over de werkingsmechanismen van de chemische stoffen. Specifieke hypothesen werden geformuleerd. Een statistisch analyseplan werd opgesteld dat de te onderzoeken relaties, de nodige variabelen, confounders en covariaten oplijst. De identificatie van confounders en covariaten was gebaseerd op wetenschappelijke gegevens uit andere studies en werd grondig bediscussieerd binnen het onderzoeksteam. Met behulp van blootstelling-effect relaties was het mogelijk om de associaties tussen een bepaalde blootstelling en een effect te bestuderen, dit gebeurt na correctie voor mogelijk beïnvloedende factoren (confounders en covariaten). Enkel de statistisch significante relaties (p<0,05) worden in het III
Samenvatting rapport weergegeven. De gevonden relaties gelden echter enkel binnen de gemeten ranges van zowel de blootstellingsmerkers als de effectmerkers. De blootstellingen lagen over het algemeen vrij laag. De blootstelling-effect relaties werden berekend na exclusie van de extreme outliers, opdat de mogelijke associaties niet te sterk beïnvloed werden of gemaskeerd werden door enkele extreme punten. Voor sommige blootstellingsmerkers lagen meer dan de helft van de waardes onder de detectielimiet. Deze biomerkers werden voor de analyses van de blootstelling-effect relaties opgesplitst in binaire variabelen: één categorie met alle waardes onder de detectielimiet en één categorie met alle waardes boven de detectielimiet. Voor deze binaire blootstellingsmerkers werd gerekend met de proporties. Resultaten In Tabel 2 wordt een overzicht gegeven van de significante blootstelling-effect relaties bij de pasgeborenen, hun moeders en de volwassenen. De blootstelling-effect relaties die positief geassocieerd waren, d.w.z. indien de blootstelling toenam dan steeg (de kans op) het effect, worden aangeduid met een opwaartse pijl; de negatieve omgekeerde associaties, d.w.z. indien de blootstelling toenam dan daalde (de kans op) het effect, worden aangeduid met een neerwaartse pijl. Deze positieve en negatieve associaties zijn statistische relaties en doen geen rechtstreekse uitspraak over de invloed op de gezondheid. Tabel 2: Overzicht van de significante blootstelling-effect relaties via meervoudige regressie analyse Blootstelling Effect Pasgeborenen en moeders: navelstrengbloed zware metalen mangaan (µg/l) moeders: zwangerschapsduur (weken) koper (µg/l) pasgeborenen: geboortelengte (cm) moeders: hormonale zwangerschapsstimulatie thallium (ng/l) moeders: zwangerschapsduur (weken) pasgeborenen: hoofdomtrek (cm) arseen (µg/l) pasgeborenen: SGA persistente gechloreerde polluenten pasgeborenen: SGA som merker PCB s (ng/l) pasgeborenen: SHBG (nmol/l) (PCB 138 + 153 + 180) pasgeborenen: oestradiol (pg/ml) pasgeborenen: SGA pasgeborenen: SHBG (nmol/l) PCB118 (ng/l) (>LOQ) pasgeborenen: oestradiol (pg/ml) pasgeborenen: LH (mu/ml) pasgeborenen: SHBG (nmol/l) PCB138 (ng/l) pasgeborenen: oestradiol (pg/ml) pasgeborenen: SGA PCB153 (ng/l) pasgeborenen: SHBG (nmol/l) pasgeborenen: oestradiol (pg/ml) pasgeborenen: geboortegewicht (g) pasgeborenen: hoofdomtrek (cm) PCB170 (ng/l) (>LOQ) pasgeborenen: SHBG (nmol/l) pasgeborenen: oestradiol (pg/ml) pasgeborenen: SGA PCB180 (ng/l) pasgeborenen: SHBG (nmol/l) pasgeborenen: oestradiol (pg/ml) IV
Samenvatting p,p -DDE (ng/l) HCB (ng/l) (>LOQ) Calux (pg TEQ/L) persistente gebromeerde polluenten BDE47 (ng/l) (>LOQ) BDE99 (ng/l) (>LOQ) BDE100 (ng/l) (>LOQ) BDE153 (ng/l) (>LOQ) TBBPA (ng/l) (>LOQ) perfluorderivaten PFOS (µg/l) PFOA (µg/l) Moeders: bloed zware metalen lood (µg/l) Moeders: haar zware metalen pasgeborenen: SHBG (nmol/l) pasgeborenen: oestradiol (pg/ml) moeders: zwangerschapsduur (weken) pasgeborenen: SGA pasgeborenen: oestradiol (pg/ml) moeders: time-to-pregnancy (langste) (maanden) pasgeborenen: LH (mu/ml) pasgeborenen: FSH (mu/ml) moeders: allergie voor dieren moeders: time-to-pregnancy (huidige) (maanden) pasgeborenen: TSH (µu/ml) moeders: time-to-pregnancy (huidige) (maanden) moeders: time-to-pregnancy (langste) (maanden) moeders: time-to-pregnancy (langste) (maanden) moeders: time-to-pregnancy (huidige) (maanden) moeders: time-to-pregnancy (langste) (maanden) moeders: astmaklachten ooit moeders: allergie voor metaal, verzorgingsproduct, huishoud- en onderhoudsproducten pasgeborenen: insuline (mu/l) moeders: huidig astma moeders: astmaklachten ooit pasgeborenen: testosteron (ng/dl) pasgeborenen: oestradiol (pg/ml) hooikoorts diagnose arts huidig astma kwik (µg/g) astmaklachten ooit Jong volwassen mannen en vrouwen (20-40 jaar): urine zware metalen arseen (µg/l) PAK s 1-hydroxypyreen (ng/l) benzeen t,t -muconzuur (µg/l) ftalaten MnBP (µg/l) pesticiden som DMP en DMTP (µg/l) (metabolieten organofosfaten) 2,5-DCP (µg/l) PFA ( bloedplaatjesaggregatie in seconden) vruchtbaarheidsbehandeling mannen time-to-pregnancy (langste) (maanden) huidig astma astmaklachten ooit allergie voor dieren allergie voor voedingsmiddelen, geneesmiddelen of insectenbeten eczeem hooikoortsklachten ooit V
Samenvatting parabenen zwangerschapsstimulatie hormonale zwangerschapsstimulatie time-to-pregnancy (huidige) (maanden) hormonale zwangerschapsstimulatie HBA (µg/l) inhibine B (pg/ml) Afkortingen: PCB: polygechloreerde bifenyl; p,p -DDE: p,p -dichloordiphenyldichloorethaan; HCB: hexachlorobenzeen; BDE s: gebromeerde difenylethers; TBBPA: tetrabroombisfenol A; PFOS: perfluorooctaansulfonzuur; PFOA: perfluoro-octaanzuur; PAK s: polycyclische aromatische koolwaterstoffen; MnBP: Mono-n-butyl ftalaat; DMP: dimethylfosfaat; DMTP: dimethylthiofosfaat; 2,5-DCP: 2,5-dichlorofenol; HBA: para-hydroxybenzoëzuur; SGA: small for gestational age; SHBG: sex hormone-binding globulin; LH: luteïniserend hormoon; FSH: follikel stimulerend hormoon; TSH: thyroid stimulerend hormoon; platelet function assay Het zware metaal arseen en de gechloreerde verbindingen PCB s en HCB in navelstrengbloed bleken een impact te hebben op de biometrie van de pasgeborenen. Hogere concentraties werden gelinkt met een hogere kans op het krijgen van een small for gestational age (SGA)-baby. Urinair arseen werd bij de jong volwassenen geassocieerd met een versnelde bloedplaatjesaggregatie, waardoor de bloedingstijd dus verkort. Hogere concentraties van de persistente gechloreerde polluenten werden gerelateerd met een verhoogde concentratie aan geslachtshormonen (SHBG, oestradiol) in het navelstrengbloed. De gebromeerde persistente polluenten en PAK s-blootstelling werden geassocieerd met een verminderde time-to-pregnancy bij jonge vrouwen. Jong volwassenen met hogere waarden aan ftalaten en organofosfaat metabolieten in urine hadden een hogere kans op allergie. Daar waar hogere concentraties voor benzeen de kans op astma en allergie verminderden. Ook blootstelling aan perfluorderivaten (gemeten in navelstrengbloed) en de zware metalen lood (gemeten in bloed) en kwik (gemeten in haar) had dit risicoverminderend effect bij de moeders. Discussie en besluit Een aantal van de significante blootstelling-effect relaties zijn in overeenstemming met bevindingen die reeds werden gerapporteerd in de brede waaier van beschikbare internationale publicaties. Arseen in navelstrengbloed wordt in onze studie geassocieerd met een groter risico op SGA. Dit is in overeenstemming met eerdere bevindingen over de negatieve invloed van arseen op groei en ontwikkeling van baby s (Xu et al. 2011, Yang et al. 2003, Hopenhayn et al. 2003, Huyck et al. 2007, Rahman et al. 2009). Bij de groep volwassenen wordt een relatie gevonden tussen arseen in urine en een versnelde plaatjesfunctie, ook deze relatie wordt ondersteund door andere wetenschappelijk studies (Bae et al. 2007, Kumar et al. 2001, Lee et al. 2002). Een ander voorbeeld dat bevestigd wordt door de literatuur is de relatie tussen PFOS en een verhoogd insulinegehalte in navelstrengbloed (Lin et al. 2009). Daarnaast worden in deze studie ook een aantal significante blootstelling-effect relaties geobserveerd die de wetenschappelijke literatuur tegenspreken, bv. HBA en verminderde vruchtbaarheid. Anderzijds blijkt dat er vaak geen eenduidigheid is wat betreft de uitkomst van de resultaten in de verschillende wetenschappelijke studies. Er bestaat geen consensus over de relatie tussen de dioxineachtige stoffen (Calux assay) of HCB op het geboortegewicht. Hoewel de interne blootstelling in de bevolking met de jaren daalt, blijkt uit deze studie dat onderzoek naar de effecten op biologische of gezondheidseindpunten noodzakelijk blijft voor deze persistente polluenten. Er moet een onderscheid gemaakt worden tussen biomerkers die blootstelling op korte termijn (bv. t,t-muconzuur, 1-hydroxypyreen) reflecteren en merkers die lang in het lichaam aanwezig blijven (bv. VI
Samenvatting POP s, urinair cadmium). Blootstelling-effect relaties tussen biomerkers die enkel korte termijn blootstelling weerspiegelen en gezondheidseffecten die al ontstaan zijn in de kindertijd (bv. astma, allergie) kunnen zeer moeilijk geïnterpreteerd worden, aangezien we de blootstelling ten tijde van het ontstaan van het effect niet kennen. In deze studie worden heel wat significante relaties waargenomen tussen verscheidene polluenten op groei en ontwikkeling, en hormoonstatus van baby s. Een verstoring van de hormonale balans kan een impact hebben op bijna alle organen en processen in het lichaam. Ondertussen is er uitvoerige literatuur beschikbaar waaruit blijkt dat de foetus meer vatbaar is voor de effecten van omgevingsfactoren en dat blootstelling aan polluenten in het vroege leven de gezondheid in het latere leven kan beïnvloeden. Anderzijds betekent dit dat er mogelijkheden voor preventie en sensibilisering bestaan, zelfs al vanaf de periode voor de bevruchting. Aandachtspunten voor het beleid die hieruit volgen zijn bv. investeren in het opvolgen van zwangere moeders en jonge kinderen via geboortecohorten in Vlaanderen, en de organisatie van een kwaliteitsvolle inventaris en opvolging van gezondheidsproblemen die gerelateerd zijn aan polluenten, zoals astma, allergie en vruchtbaarheidsproblemen. De geobserveerde blootstellingeffect relaties met nieuwe polluenten, zoals parabenen, perfluorverbindingen e.d. tonen aan dat opvolging en regelgeving omtrent deze chemische stoffen noodzakelijk is. Ook de opvolging en remediëring van historische polluenten, zoals POP s en arseen, blijft een prioriteit. VII
Inhoud INHOUD Verspreidingslijst I Samenvatting II Inhoud VIII Lijst van tabellen X Lijst van afkortingen XI Lijst van symbolen XII HOOFDSTUK 1. Inleiding 1 HOOFDSTUK 2. Materiaal & methoden 3 2.1. Studiepopulatie 3 2.1.1. Pasgeborene moeder koppels 4 2.1.2. Jong volwassen mannen en vrouwen 4 2.2. Biomerkers 5 2.2.1. Biomerkers van blootstelling 5 2.2.2. Effectmerkers 5 2.3. Blootstelling-effect relaties 7 2.3.1. Pasgeborene moeder koppels 7 2.3.2. Jong volwassen mannen en vrouwen 10 2.4. Statistische analyse 12 2.4.1. Voorbereiden van het databestand 12 2.4.2. Schaal van verwerking 12 2.4.3. Waarden boven of onder de detectie- of kwantificatielimiet 12 2.4.4. Statistische regressiemodellen 12 2.4.5. Maat voor sterkte van de blootstelling-effect relatie 17 HOOFDSTUK 3. Resultaten 18 3.1. Biomerkers 18 3.1.1. Biomerkers van blootstelling 18 3.1.2. Effectmerkers 21 3.2. Blootstelling-effect relaties 24 3.2.1. Pasgeborene moeder koppels 24 3.2.2. Jong volwassen mannen en vrouwen 31 HOOFDSTUK 4. Discussie 35 4.1. Pasgeborene moeder koppels 35 4.2. Jong volwassen mannen en vrouwen 38 4.3. Sterktes en zwaktes van de studie 40 HOOFDSTUK 5. Besluit en beleidsaanbevelingen 42 VIII
Inhoud Literatuurlijst 44 Begrippenlijst 50 IX
Lijst van tabellen LIJST VAN TABELLEN Tabel 1: Overzicht biomerkers van blootstelling en effectmerkers. III Tabel 2: Overzicht van de significante blootstelling-effect relaties via meervoudige regressie analyse IV Tabel 3: Overzicht van biomerkers van blootstelling en effectmerkers bij de pasgeborene moeder koppels en de jong volwassen mannen en vrouwen 6 Tabel 4: Geselecteerde confounders voor de effectmerkers van de pasgeborene-moeder koppels 7 Tabel 5: Onderzochte blootstelling-effect relaties bij de pasgeborene-moeder koppels 9 Tabel 6: Geselecteerde confounders voor de effectmerkers van de volwassenen 10 Tabel 7: Onderzochte blootstelling-effect relaties bij de volwassenen 11 Tabel 8: Geometrisch gemiddelde en range biomerkers van blootstelling bij de pasgeborenen en hun moeders en de volwassenen 19 Tabel 9: Proportie binaire biomerkers van blootstelling bij de pasgeborenen en hun moeders en de volwassenen 20 Tabel 10: Proportie binaire effectmerkers bij de pasgeborenen en hun moeders en de volwassenen22 Tabel 11: Gemiddelde en range continue effectmerkers bij de pasgeborenen en hun moeders en de volwassenen 23 Tabel 12: Geometrisch gemiddelde en range continue biomerkers van effect bij de pasgeborenen en hun moeders en de volwassenen 24 Tabel 13: Overzicht significante blootstelling-effect relaties bij de pasgeborene-moeder koppels: binaire effectmerkers 25 Tabel 14: Overzicht significante blootstelling-effect relaties bij de pasgeborene-moeder koppels: continue effectmerkers 27 Tabel 15: Overzicht significante blootstelling-effect relaties bij de pasgeborene-moeder koppels: continue biomerkers van effect 29 Tabel 16: Overzicht significante blootstelling-effect relaties bij de volwassen: binaire effectmerkers32 Tabel 17: Overzicht significante blootstelling-effect relaties bij de volwassen: continue effectmerkers 33 Tabel 18: Overzicht significante blootstelling-effect relaties bij de volwassen: continue biomerkers van effect 33 X
Lijst van afkortingen LIJST VAN AFKORTINGEN BDE BI BMI 2,5-DCP p,p -DDE DEDTP DEP DETP DMDTP DMP DMTP FSH HBA HBCD HCB ICSI QR IVF LH LOD LOQ MBzP MeHg MEHHP MEHP MEOHP MnBP OR PAK PCB s PFA PFOA PFOS POP s SGA SHBG TBBPA TEQ TRA TTP TSH Gebromeerde difenylether Betrouwbaarheidsinterval Body Mass Index 2,5-dichlorofenol p,p -dichloordiphenyldichloorethaan Diethyldithiofosfaat Diethylfosfaat Diethylthiofosfaat Dimethyldithiofosfaat Dimethylfosfaat Dimethylthiofosfaat Follikel stimulerend hormoon Para-hydroxybenzoëzuur Hexabromocyclododecaan Hexachlorobenzeen Intracytoplasmatische sperma injectie Interquartile range = interkwartielafstand in vitro fertilisatie luteïniserend hormoon Limit of Detection = detectielimiet Limit of Quantification = kwantificatielimiet Mono-benzyl ftalaat Methyl kwik Mono-2-ethyl-5-hydroxyhexyl ftalaat Mono-2-ethylhexyl ftalaat Mono-2-ethyl-5-oxohexyl ftalaat Mono-n-butyl ftalaat Odds Ratio Polycyclische aromatische koolwaterstoffen Polygechloreerde bifenyls Platelet function assay = plaatjesfunctie Perfluoro-octaanzuur Perfluoro-octaansulfonzuur Persistente organische polluenten Small for Gestational Age Sex hormone-binding globulin Tetrabromobisfenol Toxische equivalenten Toxisch relevant arseen Time-to-pregnancy Thyroid stimulerend hormoon XI
Lijst van symbolen LIJST VAN SYMBOLEN µ micro (= 10-6 ) n nano ( = 10-9 ) XII
HOOFDSTUK 1 Inleiding HOOFDSTUK 1. INLEIDING Dit rapport bevat de resultaten van de blootstelling-effect relaties van de pasgeborenen en de volwassenen binnen het Vlaams Humaan Biomonitoringsprogramma van de tweede cyclus uitgevoerd door het Steunpunt Milieu & Gezondheid 2007-2011 in opdracht van de Vlaamse overheid (minister van Welzijn, Volksgezondheid en Gezin, minister van Leefmilieu, Natuur en Energie en minister van Economie, Wetenschap en Innovatie). Via metingen in het milieu (bv. in voeding, in oppervlaktewater, ) kan een maat bekomen worden voor de hoeveelheid aan vervuilende stoffen in de omgeving. Maar via metingen in de mens zelf kan de interne blootstelling in kaart gebracht worden. Dit is mogelijk via humane biomonitoring, een techniek waarbij de blootstelling aan polluenten in het lichaam bepaald kan worden. Binnen de tweede generatie van het Steunpunt Milieu & Gezondheid (2007-2011) werden biomerkers van blootstelling en biomerkers van effect gemeten. Een biomerker van blootstelling weerspiegelt de interne blootstelling aan polluenten, en kan worden gemeten in bloed, navelstrengbloed, urine, haar, moedermelk, De biologische of gezondheidseffecten die gerelateerd kunnen zijn met vervuilende stoffen worden gemeten aan de hand van biomerkers van effect. Door de blootstellingsmerkers te koppelen aan de gezondheidseffecten kunnen blootstelling-effect relaties bestudeerd worden. In dit rapport worden de blootstelling-effect relaties van twee leeftijdsgroepen besproken: de pasgeborene-moeder koppels en de volwassenen (20-40 jaar). Moeders en pasgeborenen werden geselecteerd, omdat het ongeboren kind zeer gevoelig is voor de effecten van chemische stoffen die de foetus kunnen bereiken via de placenta. De volwassen leeftijdsgroep werd voornamelijk geselecteerd voor de meting van stoffen die zich opstapelen tijdens het ouder worden. De biomerkers van blootstelling bij de pasgeborene-moeder koppels werden gemeten in navelstrengbloed (zware metalen, persistente gechloreerde en gebromeerde polluenten en perfluorderivaten), in het bloed van de moeder (zware metalen), en in het haar van de moeder (kwik). Bij de volwassenengroep werden zware metalen, poly-aromatische koolwaterstoffen (PAK s), benzeen, ftalaten, cotinine, parabenen, een aantal pesticiden gemeten in ochtendurine; en perfluorderivaten in perifeer bloed. De effectmerkers die bestudeerd werden bij de pasgeborenen waren zwangerschapsduur, geboortegewicht, geboortelengte, hoofdomtrek, metabole hormonen, schildklierhormonen, geslachtshormonen en het al dan niet prematuur en small for gestational age zijn; bij de moeders van de baby s werden astma, hooikoorts, eczeem, allergie, de tijd nodig om zwanger te worden en zwangerschapsstimulatie bevraagd. Bij de groep volwassenen werden volgende biomerkers van effect opgenomen in de studie: astma, hooikoorts, eczeem, allergie, plaatjesfunctie, zwangerschapsstimulatie, vruchtbaarheid, en de tijd nodig om zwanger te worden. Voor een uitgebreide beschrijving van de blootstellings- en effectmerkers verwijzen we naar het eindrapport van de referentiebiomonitoring 2. De deelnemers vulden een uitgebreide vragenlijst in. Met deze informatie kunnen de determinanten die invloed hebben op de blootstelling-effect relaties onderzocht worden; mogelijk beïnvloedende factoren die werden bevraagd, waaronder persoonsgebonden factoren, zoals bv. leeftijd, geslacht, 2 Vlaams humaan biomonitoringsprogramma 2007-2011: resultatenrapport deel referentiebiomonitoring (2010). www.milieu-en-gezondheid.be 1
HOOFDSTUK 1 Inleiding BMI; levensstijlfactoren, zoals bv. actief en passief roken, voedingsgewoonten; en omgevingsfactoren, zoals bv. verkeersblootstelling. Deze factoren kunnen een invloed hebben op het gezondheidseffect en/of de biomerkerwaarde. Daarom is het belangrijk hiermee rekening te houden in de statistische analyse. Vanwege het groot aantal bestudeerde blootstelling-effect relaties worden in dit rapport enkel de significante blootstelling-effect relaties weergegeven. Er is een massa aan internationale literatuur beschikbaar waarin relaties tussen polluenten en gezondheidseffecten beschreven worden. In het discussiehoofdstuk worden de significante blootstelling-effect relaties gekaderd ten opzichte van de wetenschappelijke literatuur. Een deel van de significante blootstelling-effect relaties is vergelijkbaar met reeds verschenen wetenschappelijke literatuur, maar er zijn ook studies die elkaar tegenspreken, waardoor de bewijzen van associaties tussen polluenten en biologische effecten soms niet consistent zijn, wat de nood aan verder onderzoek naar deze verbanden staaft. 2
HOOFDSTUK 2 Materiaal & methoden HOOFDSTUK 2. MATERIAAL & METHODEN Eén van de doelstellingen van het Steunpunt Milieu en Gezondheid is het opzetten van een bewakingssysteem dat de vervuiling en de vroegtijdige gezondheidseffecten in de bevolking meet met behulp van humane biomonitoring. De bedoeling van dit eindrapport is door middel van blootstelling-effect relaties de relatie te onderzoeken tussen biomerkers van blootstelling en biomerkers van effect in de algemene bevolking van Vlaanderen. Biomerkers van blootstelling geven een beeld van de interne blootstelling aan polluenten. Er werden historische polluenten gemeten zoals zware metalen, PCB s, dioxineachtige stoffen (Calux), en gechloreerde pesticiden. Daarnaast werden voor het eerst ook nieuwe polluenten gemeten op grote schaal, o.a. gebromeerde vlamvertragers, ftalaten, metabolieten van nieuwe pesticiden, en parabenen. Biomerkers van effect geven een beeld van de biologische effecten die mogelijk het gevolg zijn van blootstelling aan polluenten. In deze studie worden bv. immunologische en endocriene effecten gemeten. Het projectplan werd voorgelegd aan de ethische commissie van de Universiteit Antwerpen en werd goedgekeurd op 16 mei 2008. 2.1. STUDIEPOPULATIE Een uitgebreide beschrijving van de studiepopulatie is terug te vinden in het rapport van de referentiebiomonitoring 3. In dit rapport beperken we ons tot een korte bespreking van de rekrutering van de studiepopulatie. De rekrutering van deelnemers en het verzamelen van stalen werden verspreid over heel Vlaanderen en over de vier seizoenen. Voor de pasgeborene moeder koppels werden 255 stalen verzameld en voor de jong volwassen mannen en vrouwen (20-40 jaar) 204 stalen. Ervaringen uit het vorige Steunpunt hebben ons geleerd dat het veldwerk (rekrutering van de deelnemers, staalname, etc. ) omwille van de praktische haalbaarheid beter verloopt wanneer wordt gewerkt met een multistage sampling procedure. Deze procedure bestaat uit 3 stappen. De 1ste stap is een stratificatie volgens de provincie. Per provincie en leeftijdsgroep werd het aantal stalen bepaald evenredig met het aantal inwoners in de provincie op 01.06.2007. De 2de stap van de procedure is de selectie van primaire sampling units (PSU). De sampling units of PSU s waarmee werd gewerkt waren kraamklinieken voor de pasgeborene-moeder koppels. Er werden twee PSU s (kraamklinieken) geselecteerd per provincie. Per provincie werden alle PSU s opgelijst. De grootte van de PSU s was evenredig met de kans op selectie. De tweede PSU mocht niet in dezelfde stad liggen als de eerste PSU, en de PSU s mochten niet op minder dan 20 km afstand van elkaar liggen. Voor de selectie van volwassen mannen en vrouwen werd geopteerd om via de vijf verschillende provinciebesturen te werken. In de 3de stap van de procedure werden binnen elke PSU de potentiële deelnemers op toevalsbasis geselecteerd. 3 Vlaams humaan biomonitoringsprogramma 2007-2011: resultatenrapport deel referentiebiomonitoring (2010). www.milieu-en-gezondheid.be 3
HOOFDSTUK 2 Materiaal & methoden Voor deze groepen/clusters werd de staalname vervolgens, per provincie, verdeeld over de vier seizoenen. Globaal werd een gelijke verdeling over de vier seizoenen nagestreefd. 2.1.1. PASGEBORENE MOEDER KOPPELS Voor de selectie van pasgeborene-moeder koppels werd gewerkt via kraamklinieken. Voorwaarden voor inclusie moeders waren: - Ten minste tien jaar in Vlaanderen wonen; - Toestemming geven (toestemmingsformulier): dit betekent bereid zijn om zowel een staal navelstrengbloed, bloed en een haarlok af te staan, een uitgebreide vragenlijst in te vullen in de week na de bevalling en gedurende twee jaar vragenlijsten in te vullen over de neurologische ontwikkeling van het kind; - Nederlandstalige vragenlijst kunnen invullen (met vragen over de zwangerschap/ gezondheid/ sociale parameters/ woonomgeving/ levensstijl/ roken/ alcohol/ voeding en perceptie over milieu en gezondheid). Het streefdoel was om 250 deelnemende moeders te rekruteren met een volledig dossier: minstens 50 ml navelstrengbloed, een ingevulde vragenlijst, 20 ml bloed van de moeder, 150 mg haar van de moeder en de bereidheid om gedurende twee jaar mee te werken aan de opvolgstudie over de neurologische ontwikkeling van hun kind. De veldwerkers noteerden in de kraamkliniek een aantal gegevens over het kind: gewicht, lengte, hoofdomtrek, zwangerschapsduur, complicaties tijdens de zwangerschap, aangeboren afwijkingen, hypospadias, cryptorchidie en resultaten van het standaard neurologisch onderzoek. Later werden de gegevens van de centra voor opsporing van metabole ziekten (TSH (hielprik)) opgevraagd. Bij Kind en Gezin werden gegevens i.v.m. groei en ontwikkeling in de maanden na de geboorte opgevraagd. 2.1.2. JONG VOLWASSEN MANNEN EN VROUWEN De doelpopulatie bestond uit jonge mannen en vrouwen van 20 40 jaar. Het steekproefkader was een lijst van de werknemers van de verschillende Vlaamse provinciebesturen die in de juiste leeftijdscategorie vallen. Voorwaarden voor inclusie deelnemers: - Geboortedatum tussen 1/1/1968 en 31/12/1988; - Ten minste 10 jaar wonen in Vlaanderen; - Toestemming gegeven hebben (getekend informed consent), d.w.z. bereid zijn om bloed en urine te leveren en een uitgebreide vragenlijst in te vullen; - Nederlandstalige vragenlijsten kunnen invullen. Alle personeelsleden binnen de juiste leeftijdscategorie werden aangeschreven. Uit de toestemmingsformulieren werd een steekproef getrokken. De bedoeling was om in totaal 200 volwassenen te rekruteren. De potentiële deelnemers ontvangen een folder en een geïnformeerd toestemmingsformulier met uitleg. Het toestemmingsformulier vermeldt welke analyses op bloed en urine zouden worden uitgevoerd. Ook vroegen we de deelnemers om een algemene vragenlijst over levensstijl/ ziekten/ beroepsblootstellingen en voeding in te vullen. 4
HOOFDSTUK 2 Materiaal & methoden 2.2. BIOMERKERS 2.2.1. BIOMERKERS VAN BLOOTSTELLING In de moeder-kind cohorte werden polluenten gemeten in navelstrengbloed, in perifeer bloed van de moeder (enkel zware metalen) en in haar van de moeder (kwik). Bij de volwassenen werden de meeste metingen uitgevoerd in urine. Er werd tevens een extra bloedstaal gevraagd dat vooral bestemd is voor latere analyses (biobank), maar waarop in de huidige campagne reeds perfluormetingen werden uitgevoerd. Urinaire merkers worden getest in twee eenheden: als concentratie (µg/l) en als creatinine-gecorrigeerde eenheid (µg/g creatinine). Creatinine wordt gebruikt om te corrigeren voor de verdunningsgraad van spot urine. Stalen met een creatinineconcentratie <30 mg/dl en >300 mg/dl worden verwijderd, aangezien te geconcentreerd of te verdund staal (WHO, 1996). Voor polluenten in serum die vetgerelateerd zijn, worden de waardes eveneens getest in twee eenheden: per hoeveelheid serum (ng/l) en per hoeveelheid bloedvet (ng/g bloedvet). 2.2.2. EFFECTMERKERS De effectmerkers zijn een combinatie van toxicologische metingen (biomerkers van effect), vragenlijstgegevens over gezondheidsklachten en data die beschikbaar zijn vanuit andere medische registratiesystemen (het medisch dossier van de kraamkliniek en het dossier van Kind en Gezin bij de pasgeborenen. 5
HOOFDSTUK 2 Materiaal & methoden Tabel 3: Overzicht van biomerkers van blootstelling en effectmerkers bij de pasgeborene moeder koppels en de jong volwassen mannen en vrouwen Deelstudie Pasgeborenen / moeders Volwassenen (20-40 jaar) Blootstellingsmerkers Effectmerkers Navelstrengbloed: - zware metalen (Pb, Cd, Mn, Cu, Tl, As) - persistente gechloreerde polluenten (PCB s, p,p -DDE, HCB, Calux) - persistente gebromeerde polluenten (PBDE s, HBCD, TBBPA) - perfluorderivaten (PFOS, PFOA) Bloed van de moeder: - zware metalen (Pb, Cd, Mn, Cu, Tl, As) Haar van de moeder: - zware metalen (Hg, MeHg) Pasgeborene Groei en ontwikkeling: - zwangerschapsduur, lengte, gewicht, schedelomtrek - schildklierhormonen (TSH, ft3, ft4) - metabole hormonen (insuline, leptine) - geslachtshormonen (testosteron, oestradiol, SHBG, LH, FSH) Moeder Fertiliteit: - vruchtbaarheidsbehandeling, tijd tot zwangerschap, miskraam (vragenlijst) Immunologie: - astma en allergie (vragenlijst) Urine: - zware metalen (Cd, As, TRA) - PAK s (1-hydroxypyreen) - benzeen (t,t-muconzuur) - weekmakers (ftalaten) - pesticiden (derivaten van organofosfaatpesticiden, 2,5-DCP) - tabakrook (cotinine) - parabenen (HBA) Bloed: - perfluorderivaten (PFOS, PFOA) Cardiovasculair: - bloedplaatjesaggregatie Fertiliteit: - vruchtbaarheidsbehandeling, tijd tot zwangerschap, miskraam (vragenlijst) - inhibine B enkel mannen Immunologie: - astma en allergie (vragenlijst) 6
HOOFDSTUK 2 Materiaal & methoden 2.3. BLOOTSTELLING-EFFECT RELATIES Een blootstelling-effect relatie geeft de samenhang tussen een effectmerker (het effect) en een blootstellingsmerker weer. Voor het onderzoeken van de relatie van biomerkers van blootstelling met effectmerkers wordt gecorrigeerd voor confounders en mogelijke invloedsfactoren (covariaten) die bekomen werden via de vragenlijsten. Een confounder is een factor die gerelateerd is aan de te onderzoeken blootstelling en ook aan de uitkomst (het effect). Een covariaat is een factor die mogelijk verklarend is voor de bestudeerde uitkomst (het effect). Een covariaat kan van direct belang zijn of het kan ook een confounding of interacting variabele zijn. 2.3.1. PASGEBORENE MOEDER KOPPELS In Tabel 4 wordt een overzicht gegeven van de effectmerkers en de bijhorende confounders bij de pasgeborenen en hun moeders. De selectie van de confounders gebeurde op basis van literatuuronderzoek en discussies tijdens het veldwerkcomité. Het effect miskraam wordt weggelaten uit de analyses van de blootstelling-effect relaties, aangezien de leeftijd op het moment van de miskraam een belangrijke confounder is. Vermits we geen leeftijd van miskraam kunnen invullen voor de moeders die nooit een miskraam gehad hebben, vallen deze moeders weg en blijven er dus niet voldoende moeders over voor de analyse van blootstelling-effect relaties. Tabel 4: Geselecteerde confounders voor de effectmerkers van de pasgeborene-moeder koppels EFFECTMERKER EFFECTMERKERS PASGEBORENEN Groei en ontwikkeling Prematuur (exclusie meerlingen) SGA (exclusie meerlingen) Geboortegewicht (exclusie meerlingen) CONFOUNDERS Leeftijd moeder Roken tijdens zwangerschap Leeftijd moeder Lengte moeder BMI moeder Roken tijdens zwangerschap Pariteit Geslacht kind Zwangerschapsduur Leeftijd moeder Lengte moeder BMI moeder Roken tijdens zwangerschap Pariteit Geslacht kind 7
HOOFDSTUK 2 Materiaal & methoden Geboortelengte (exclusie meerlingen) Hoofdomtrek (exclusie meerlingen) Zwangerschapsduur (exclusie meerlingen) Biomerkers van effect Schildklierhormonen (TSH, FT3, FT4) Geslachtshormonen (SHBG, LH, FSH, testosteron, oestradiol) Metabole hormonen (leptine en insuline) EFFECTMERKERS MOEDERS Immunologie Astma (huidig ooit dokter) Hooikoorts (ooit dokter) Eczeem Allergie (algemeen huid dieren) Fertiliteit Zwangerschapsstimulatie (algemeen hormonaal) Time-to-pregnancy (huidige langste) Zwangerschapsduur Leeftijd moeder Lengte moeder Lengte vader Roken tijdens zwangerschap Pariteit Geslacht kind Zwangerschapsduur Leeftijd moeder Roken tijdens zwangerschap Pariteit Geslacht kind Leeftijd moeder Roken tijdens zwangerschap Zwangerschapsduur Aard bevalling SGA Zwangerschapsduur Geslacht kind Zwangerschapsduur Geslacht kind BMI moeder Ooit gerookt Familiaal voorkomen Ooit gerookt Familiaal voorkomen Ooit gerookt Familiaal voorkomen Ooit gerookt Familiaal voorkomen Leeftijd moeder Ooit gerookt Leeftijd moeder (huidige langste) Ooit gerookt Tabel 5 geeft een overzicht van de verbanden tussen de blootstellingsmerkers en de effectmerkers (bij de moeders en de pasgeborenen) die zullen onderzocht worden. 8
HOOFDSTUK 2 Materiaal & methoden Tabel 5: Onderzochte blootstelling-effect relaties bij de pasgeborene-moeder koppels B L O O T S T E L L I N G NAVELSTRENGBLOED BLOED MOEDER HAAR MOEDER Zware metalen (Pb, Cd, Mn, Cu, Tl, As) Persistente gechloreerde polluenten (PCB s, p,p -DDE, HCB, Calux) Persistente gebromeerde polluenten (PBDE s, HBCD, TBBPA) Perfluorderivaten (PFOS, PFOA) Zware metalen (Pb, Cd, Mn, Cu, Tl, As) Zware metalen (Hg, MeHg) Groei en ontwikkeling X PASGEBORENEN Schildklierhormonen Geslachtshormonen EFFECT Metabole hormonen MOEDERS Astma en Fertiliteit allergie X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X 9
HOOFDSTUK 2 Materiaal & methoden 2.3.2. JONG VOLWASSEN MANNEN EN VROUWEN In Tabel 6 wordt een overzicht gegeven van de effectmerkers bij de jong volwassen mannen en vrouwen en de overeenkomstige confounders, geselecteerd op basis van literatuuronderzoek en discussies tijdens het veldwerkcomité. Het effect miskraam wordt weggelaten uit de analyses van de blootstelling-effect relaties, aangezien de leeftijd op het moment van de miskraam een belangrijke confounder is. Vermits we geen leeftijd van miskraam kunnen invullen voor de vrouwen die nooit een miskraam gehad hebben, vallen deze vrouwen weg. Tabel 6: Geselecteerde confounders voor de effectmerkers van de volwassenen EFFECT Immunologie Astma (huidig ooit dokter) Hooikoorts (ooit dokter) Eczeem Allergie (algemeen huid dieren) Fertiliteit Zwangerschapsstimulatie (algemeen hormonaal) (vrouwen) Vruchtbaarheid mannen (algemeen IVF/ICSI spermakwaliteit) (mannen) Time-to-pregnancy (laatste langste) (vrouwen) Inhibine B (mannen) Cardiovasculair Plaatjesfunctie (PFA) CONFOUNDERS Rokenstatus Familiaal voorkomen Rokenstatus Familiaal voorkomen Rokenstatus Familiaal voorkomen Rokenstatus Familiaal voorkomen Leeftijd Rokenstatus Leeftijd Rokenstatus Leeftijd (huidige langste) Rokenstatus Leeftijd BMI Rokenstatus Leeftijd Rokenstatus Geslacht BMI Tabel 7 geeft een overzicht van de verbanden tussen de blootstellingsmerkers en de effectmerkers die zullen onderzocht worden bij de volwassenen. 10
HOOFDSTUK 2 Materiaal & methoden Tabel 7: Onderzochte blootstelling-effect relaties bij de volwassenen B L O O T S T E L L I N G URINE BLOED Zware metalen (Cd, As, TRA) PAK s (1-hydroxypyreen) Benzeen (t,t -muconzuur) Weekmakers (ftalaten) Pesticiden (organofosfaatpesticiden, 2,5- dichlorobenzeen) Tabaksrook (cotinine) Parabenen (HBA) Perfluorderivaten (PFOS, PFOA) EFFECT Immunologie Fertiliteit Cardiovasculair X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X 11
HOOFDSTUK 2 Materiaal & methoden 2.4. STATISTISCHE ANALYSE 2.4.1. VOORBEREIDEN VAN HET DATABESTAND De waarde van de effectmerkers en blootstellingsmerkers die aan een exclusiecriterium voldoen worden op een ontbrekende waarde gezet en dus niet meegenomen in de statistische analyses. Zo worden bijvoorbeeld de meerlingen zwangerschappen niet meegenomen in de verwerkingen van de zwangerschapsduur (zie Tabel 4). De blootstellingsmerkers bepaald in te sterk verdunde of te geconcentreerde urine (creatinine-concentratie <30 mg/dl en >300 mg/dl) worden niet gebruikt. Waarden voor de blootstellingsmerkers die ver buiten het gebied van waargenomen waarden vallen, worden niet meegenomen in de verwerkingen. Op basis van een paar observaties is het niet mogelijk om betrouwbare uitspraken te doen over de relatie tussen blootstellingsmerker en effectmerker in dit gebied van blootstelling. 2.4.2. SCHAAL VAN VERWERKING De continue effectmerkers worden conform de literatuur verwerkt. Dit betekent dat de biomerkers van effect (bv. hormoonverstoring) op de natuurlijk getransformeerde schaal (ln) verwerkt worden. De gezondheidseffecten (lengte, ) worden niet getransformeerd. De blootstellingsmerkers worden op twee manieren verwerkt. De blootstelling-effect relaties worden onderzocht met de blootstellingsmerker op de (1) oorspronkelijke schaal en (2) na ln-transformatie. De ln-transformatie is een niet lineaire transformatie. Dit betekent dat extreme waarden - door de transformatie - dichter bij de puntenwolk gebracht worden. Niet lineaire blootstelling-effect relaties op de oorspronkelijke schaal, zijn mogelijk lineair voor de ln-getransformeerde blootstelling. De blootstellingsmerkers bepaald in urine worden uitgedrukt per volume-eenheid en per gram creatinine. Blootstellingsmerkers gemeten in serum die vetgerelateerd zijn, worden verwerkt per volume-eenheid en per gram bloedvet. 2.4.3. WAARDEN BOVEN OF ONDER DE DETECTIE- OF KWANTIFICATIELIMIET Indien het percentage deelnemers, met een waarde voor de blootstellingsmerker onder de LOD/LOQ 4, te hoog is (ongeveer 50% of meer) worden niet de eigenlijke waarden gebruikt in de statistische verwerkingen maar enkel of de waarde <LOD/LOQ of >LOD/LOQ is. De blootstellingsmerker wordt met andere woorden binair verwerkt, met name gedetecteerd versus niet-gedetecteerd. Indien (bijna) alle deelnemers een waarde onder de LOD/LOQ hebben (98-100%), wordt de blootstellingsmerker niet meegenomen in de verwerkingen. 2.4.4. STATISTISCHE REGRESSIEMODELLEN Regressietechnieken worden gebruikt om de relatie tussen de effectmerker en de biomerker van blootstelling te onderzoeken. Meervoudige regressietechnieken laten toe deze relatie te onderzoeken na correctie voor meerdere verklarende parameters/confounders. Voor de continue 4 Sommige laboratoria gebruiken de LOD als de kleinste gerapporteerde waarde, andere de LOQ. 12
HOOFDSTUK 2 Materiaal & methoden effectmerkers (biomerkers en gezondheidseffecten) wordt gebruik gemaakt van regressiemodellen. Voor de binaire merkers worden logistische regressiemodellen gebruikt. lineaire Enkelvoudige regressie In een eerste fase van de verwerkingen worden regressiemodellen met slechts één parameter als verklarende parameter gefit (enkelvoudige regressies). Lineaire regressie voor de continue effectmerkers Regressieanalyse is een techniek die gebruikt wordt om het verband te bestuderen tussen een respons stochastische veranderlijke Y en een regressor veranderlijke (onafhankelijke veranderlijke of verklarende parameter of covariaat) x. In de blootstelling-effect relaties is Y het effect (biomerker van effect of gezondheidseffect) en x is de biomerker van blootstelling. Het verband dat bestudeerd wordt, is een functioneel verband. Dit wil zeggen dat het verband vastgelegd wordt door een wiskundige functie f(x). Deze functie beschrijft hoe de gemiddelde response varieert met x: E(Y x ) = f(x) De meest eenvoudig situatie is deze waarbij f een lineaire functie is: f(x)= α + βx. Dus E(Y x ) = α + βx De waarden van α en β worden geschat door middel van het criterium der kleinste kwadraten. Deze methode berust er op dat men hiermee de meest nauwkeurige te verwachte verandering van de responsvariabele Y kan schatten, bij een zekere constante waarde van de onafhankelijke x-variabele. Indien we veronderstellen dat de ε i ~N(0,σ 2 ), met andere woorden dat de storingstermen normaal verdeeld zijn met gemiddelde 0 en met dezelfde variantie, dan kunnen betrouwbaarheidsintervallen voor β opgesteld worden; en kunnen hypothesen getoetst worden. - Is β = 0 dan is sprake van een monotone horizontale lijn, evenwijdig met de X-as. Er is dus geen verband tussen X en Y. - Is β < 0 dan is sprake van een omgekeerd evenredig (dalend) X,Y verband. - Is β > 0 dan is sprake van een evenredig (stijgend) X,Y verband. Logistische regressie voor de binaire effectmerkers Indien de response binair is werkt men met kansverhoudingen, die meestal met het Engelse woord odds wordt aangeduid. De odds is de verhouding tussen de fracties bij twee mogelijke uitkomsten. Als p de kans op de eerste uitkomst (bv. astma hebben) is, dan is 1 p de kans op de tweede uitkomst (geen astma hebben) en is de ODDS = p/(1 p). Bij logistische regressie zijn we geïnteresseerd in het modelleren van de kans p in termen van de verklarende variabele x. We zouden dit kunnen proberen met de relatie p = α + βx. Helaas is dit geen goed model. Zolang β 0 geven zeer hoge of lage waarden van x voor α + βx een waarde die niet in overeenstemming is met het gegeven dat 0 p 1. De bij logistische regressie gekozen oplossing voor dit probleem is het transformeren van de kansverhouding p/(1 p) met behulp van de 13
HOOFDSTUK 2 Materiaal & methoden natuurlijke logaritme. We gebruiken voor deze transformatie de term logaritmische kansverhouding of log odds. Deze modelleren we als een lineaire functie van de verklarende variabele: Log[p/(1 p)] = α + βx De helling in dit logistische regressiemodel is het verschil tussen de log(odds) voor een eenheid toename in x (dus bijvoorbeeld het verschil tussen de log(odds) van x en x+1). De interpretatie van de resultaten in termen van de helling van de regressielijn is moeilijk. Gewoonlijk wordt een transformatie toegepast die de situatie verduidelijkt. Met enige algebra kan worden aangetoond dat OR = ODDS x+1 / ODDS x = e β. De transformatie e β maakt de logaritme ongedaan en transformeert de helling van de regressielijn tot een odds ratio. Dit betekent dat de kansverhouding voor x+1 kan worden berekend door de kansverhouding voor x met de odds ratio te vermenigvuldigen. Meervoudige regressie De interpretatie van deze eenvoudige regressie modellen moet uiterst voorzichtig gebeuren. Verscheidene onafhankelijke variabelen kunnen immers gelijktijdig een invloed uitoefenen op de effectmerker. Statistisch significante relaties tussen een blootstellingsmerker en een effectmerker kunnen mogelijk verklaard worden door een derde parameter die met beide merkers samenhangt. Meervoudige regressietechnieken zullen aangewend worden om dit te onderzoeken. Bij meervoudige (multipele) regressie komt er meer dan één onafhankelijke variabele in het model voor. Met meervoudige regressie heeft men dus de mogelijkheid om het effect van één onafhankelijke variabele (blootstellingsmerker) op een afhankelijke variabele Y (effectmerker) te bestuderen, terwijl men de overige variabelen (zoals rookgedrag, geslacht, ) gefixeerd (constant) houdt. De algemene vergelijking voor de meervoudige regressie luidt: E(Y x ) = α + β 1 x 1 + β 2 x 2 + β 3 x 3 voor lineaire regressie log(p/(1 p) = α + β 1 x 1 + β 2 x 2 + β 3 x 3 voor logistische regressie β 1 geeft het effect van X 1 op Y (op p indien logistische regressie), na correctie voor X 2 en X 3. Selectie van een goed model Verklarende parameters Zoals reeds aangehaald kunnen tal van factoren waaronder leeftijd, geslacht, levensstijlfactoren, beroep, sociaaleconomische status,... een invloed hebben op de gezondheidseffecten en op de gemeten interne blootstellingsmerkers. Uiteraard is het niet mogelijk om de relatie tussen de merkers en alle opgemeten/bevraagde parameters te bestuderen. Voorafgaand aan de verwerkingen werd voor elke merker gespecificeerd welke onafhankelijke variabelen nog in het model opgenomen diende te worden. Deze keuze is gebaseerd op literatuuronderzoek en discussies tijdens de veldwerkcomitévergaderingen. Risicofactoren zoals roken, geslacht, leeftijd,. kunnen de blootstelling-effect relatie vertekenen, en worden daarom verstorende of confounding variabelen genoemd. Bij de studie van de blootstelling-effect relaties moet rekening gehouden worden met deze confounding factoren. Een confounder heeft de volgende kenmerken: - een confounder is een bekende en belangrijke risicofactor voor de effectmerker; - een confounder is geassocieerd met de blootstelling; 14
HOOFDSTUK 2 Materiaal & methoden - een confounder wordt niet beïnvloed door de blootstelling of door de effectmerker (geen intermediaire stap in het oorzakelijk pad). Men kan niet testen of een verklarende parameter een confounder is, enerzijds omwille van statistisch vermogen en anderzijds omdat confounding een systematische (niet random) fout is. De verklarende parameters spelen niet allemaal dezelfde rol in de verwerkingen. De belangrijkste risicofactoren (confounders) opgelijst in Tabel 4 en Tabel 6 werden consequent in de statistische modellen verrekend, onafhankelijk van hun significantieniveau. Voor elke effectmerker wordt de volgende procedure gevolgd: STAP 1: enkelvoudige regressies - Voor elke verklarende parameter wordt een enkelvoudig regressiemodel gefit. Alle verklarende parameters significant op het 20 procent significantieniveau gaan verder naar stap 2. - Voor elke blootstellingsmerker wordt de relatie met de effectmerker onderzocht zonder te corrigeren voor confounders en/of verklarende parameters. Enkel indien de blootstellingsmerker significant is op het 20 procent significantieniveau wordt de blootstellingsmerker meegenomen in stap 2. Op die manier wordt het aantal te onderzoeken blootstelling-effect relaties in de meervoudige regressie te beperkt. De kans dat een blootstelling een significant effect heeft (p<0,05) in een meervoudig regressiemodel is klein als de blootstelling-effect relatie in het enkelvoudig model niet sterk is (bv. p>0,20). STAP 2: meervoudige regressies - Voor elke effectmerker wordt vervolgens een model gebouwd waar het effect van de blootstellingsmerker onderzocht wordt na correctie voor de confounders. - Voor elke effectmerker wordt verder een zo zuinig mogelijk model gebouwd op basis van de verklarende parameters (uit STAP 1) door middel van een stapsgewijze selectieprocedure (zie selectie van een goed model). De confounders blijven echter steeds in het model. Enkel de significant verklarende parameters (p<0,05) blijven in het model. Vervolgens wordt aan het vereenvoudigde model de blootstellingsmerker toegevoegd. De significantie van de blootstellingsmerker wordt bestudeerd in dit model. Selectie van een goed model Uit de verzameling van kandidaat verklarende parameters (covariaten) willen we een deelverzameling kiezen die het beste de variabiliteit in de uitkomstparameter verklaart. Helaas is er geen eenduidig antwoord op de vraag wat de beste deelverzameling is. Er zijn verschillende criteria en die leiden niet noodzakelijk tot dezelfde conclusie. We opteren voor gebruik van automatische selectieprocedures. De stapsgewijze procedure zal toegepast worden. De methode waarbij alle mogelijke regressiemodellen vergeleken worden (bijv. de R-square of Cp,...) is omwille van het groot aantal verklarende parameters en het groot aantal te onderzoeken blootstelling-effect relaties niet aangewezen. 15