Dunnelaagchromatografie Inleiding Chromatografie is de scheiding van een mengsel van twee of meerdere stoffen door verdeling tussen twee fasen, waarbij één fase bewegend is (mobiel) en de andere stationair. Deze twee fasen kunnen hetzij vast en vloeibaar, vloeibaar - vloeibaar of gas en vloeibaar zijn. Er bestaan vele varianten van chromatografie, maar de principen zijn steeds dezelfde. In dit practicum zullen we kolomchromatografie en dunnelaagchromatografie aanleren. definitie van chromatografie Bij dunnelaagchromatografie (of TLC, Thin Layer Chromatography) zijn de mobiele fase en stationaire fase respectievelijk vloeibaar en vast. De stationaire fase is meestal een polaire stof en de mobiele fase kan bestaan uit zowel een enkelvoudig solvent als een mengsel van solventen. TLC is een vlugge, goedkope en relatief gevoelige methode voor: de bepaling van het aantal componenten in een mengsel de controle van de identiteit van een stof het volgen van reacties het zoeken naar omstandigheid voor kolomchromatgrafie de analyse van fracties bekomen met kolomchromatografie De stationaire fase bij TLC bestaat meestal uit een polaire en adsorberende stof zoals aluminium- of siliciumoxide die zeer fijn gemalen wordt en gehecht wordt op een dragerplaatje (glas, kunststof of aluminium). De mobiele fase kan bestaan om uit het even welk organisch solvent of mengsel van solventen. Principe Om het principe van dunnelaagchromatografie grondig te begrijpen, moeten we een kijkje gaan nemen op moleculair niveau. Alle vormen van chromatografie zijn gebaseerd op de uitwisseling en het evenwicht tussen twee fasen. Als men silicagel gebruikt als stationaire fase wordt deze uitwisseling beïnvloed door adsorptiefenomenen. Zo kan iedere verbinding voorkomen in een vrije en in een geadsorbeerde vorm (zie Figuur 1). TLC is gebaseerd op adsorptie vrij: moleculen die volledig opgelost zijn in de mobiele fase geadsorbeerd: moleculen gebonden op het oppervlak van de vaste stationaire fase tlc 1
mobiele fase X vrij X Y gebonden gebonden Y vrij stationaire fase Figuur 1: Scheiding met behulp van dunnelaagchromatografie is gebaseerd op adsorptie op een stationaire fase Moleculen zijn steeds in een dynamisch evenwicht tussen de vrije en de geadsorbeerde vorm. Iedere seconde zullen miljoenen moleculen geadsorbeerd zijn terwijl andere gedesorbeerd worden en vrij in oplossing voorkomen. Het evenwicht tussen de vrije en geadsorbeerde vorm hangt vooral van volgende factoren af: de polariteit van het molecule de polariteit van de stationaire fase de polariteit van het solvent Door één of meerdere van deze factoren te veranderen kan men de scheiding in chromatografie beïnvloeden. A A A A A A B B B A A AB B B BBB solvent Figuur 2: Verloop van een scheiding van 2 stoffen op een TLC plaat Figuur 2 toont de scheiding van 2 bestanddelen (A en B) op silicagel (siliciumoxide). In het gegeven voorbeeld is A een verbinding die weinig polair is en dus weinig geadsorbeerd wordt door de vaste fase. Hierdoor zal deze verbinding veel sneller (of verder) migreren in de stroom van de mobiele fase. Verbinding B is meer polair en wordt dus sterker geadsorbeerd op de vaste fase. Daarom zal stof B veel minder migreren tijdens het chromatografieproces. tlc 2
In dunnelaagchromatografie bestaat de stationaire fase uit alumina (Al 2 O 3.xH 2 O) n of silicagel (SiO 2.xH 2 O) n. Het netwerk van atomen in deze verbindingen zorgt ervoor dat een zeer polaire stof gevormd wordt die gemakkelijk verbindingen met polaire groepen adsorbeert. Deze adsorptie berust op dipool-dipool interacties of op het vormen van waterstofbruggen (Figuur 3). Hoe polairder een verbinding, hoe sterker die geadsorbeerd zal worden aan de stationaire fase en hoe minder die verbinding zal migreren met de mobiele fase. invloed van de stationaire fase Figuur 3: Mogelijke wijzen van interactie met silicagel. Uit het vorige blijkt dat de scheiding van verbindingen met behulp van dunnelaagchromatografie gebeurt op basis van de polariteit van deze verbindingen. De polariteit van organische verbindingen wordt bepaald door de aanwezigheid en het aantal functionele groepen. Figuur 4 toont hoe de polariteit van verbindingen een functie is van de functionele groepen. Zo is bijvoorbeeld benzoëzuur polairder dan benzaldehyde en zal het sterker weerhouden worden op de stationaire fase. minst polair invloed van de polariteit van de verbindingen alkanen alkylhalogeniden alkenen dienen aromatische koolwaterstoffen aromatische halogeniden ethers esters ketonen aldehyden aminen alcoholen fenolen carbonzuren sulfonzuren meest polair Figuur 4: Rangschikking van polariteit van enkele functionele groepen. tlc 3
Zoals reeds vernoemd, speelt ook de polariteit van de mobiele fase een rol in het scheidingsproces. Hoe polairder dit solvent, hoe sterker het een verbinding zal kunnen meesleuren tijdens de elutie en hoe verder deze verbinding zal migreren. invloed van de mobiele fase Aan ieder solvent kan een solventsterkte worden toegekend. Dit is een arbitrair getal dat een indicatie is voor het vermogen om een verbinding op te trekken op een TLC plaat. Ook voor mengsels van solventen kan men de solventsterkte berekenen. Hiervoor neemt men het gewogen gemiddelde (rekening houdend met het volumeprocent van ieder solvent in het mengsel). Als voorbeeld rekenen we hier de solventsterkte voor een mengsel van (1:9) methanol (sterkte 0.95) en dichloormethaan (sterkte 0.42) uit. Aandeel methanol: 0.95 x 0.1 Aandeel dichloormethaan: 0.42 x 0.9 Totaal: (0.95 x 0.1) + (0.42 x 0.9) = 0.47 minst polair kleinste solventsterkte hexaan tetrachloorkoolstof tolueen chloroform dichloormethaan dienen diethylether aceton ethylacetaat propanol ethanol methanol water azijnzuur meest polair grootste solventsterkte Figuur 5: Rangschikking van polariteit van enkele solventen. Figuur 5 bevat een lijst van veel gebruikte solventen in de dunnelaagchromatografie gerangschikt volgens solventsterkte. Voor een meer volledige lijst wordt verwezen naar de Appendix van deze handleiding. Werkwijze Het opnemen en evalueren van een dunnelaagchromatogram gebeurt in drie stappen: hoe neem je een chromatogram? het opbrengen van het staal het laten optrekken van de mobiele fase het zichtbaar maken van de vlekken tlc 4
Opbrengen van het staal Dunnelaagchromatografie is een gevoelige analysemethode en slechts enkele migrogrammen product zijn voldoende om tot een goed resultaat te komen. Het staal wordt opgelost in een vluchtig oplosmiddel. De keuze van het oplosmiddel moeten zo zijn dat het staal er volledig in oplost en dat het oplosmiddel gemakkelijk verdampt. Wanner het staal is opgelost, moet het overgebracht worden op de stationaire fase. TLC plaatjes die in het practicum gebruikt worden zijn meestal 10 cm hoog en 4 cm breed en hebben een silicagel laag als stationaire fase gehecht op een aluminium achtergrond. De aluminium achtergrond is zilverkleurig, de silicagel is wit gekleurd. Men draagt er zorg voor om de silicagel laag niet met de vingers aan te raken aangezien er gemakkelijk vingerafdrukken ontstaan die de interpretatie van een chromatogram kunnen bemoeilijken. De silicagel laag is redelijk hard en men kan er zachtjes met een potlood op schrijven. Gebruik geen inkt of balpen want de inhoudtsstoffen van inkt zullen het experiment doen mislukken. Begin met het trekken van een startlijn op ongeveer 1.5 cm van de onderkant, evenwijdig met de onderkant (zie Figuur 6) en merk bovenaan het plaatje de stalen die aangebracht zullen worden. Vervolgens vult men een capillair met het te scheiden mengsel door het capillair even in de oplossing te steken en daarna laat men het leeg lopen op de startlijn. Men kan een drietal van deze spots naast elkaar plaatsen zodat men verschillende mengsels tegelijkertijd kan scheiden. Blijf echter minstens 5 mm van de zijkant. Figuur 6: Spotten van een TLC plaatje. Maak de vlekken niet te groot (liefst kleiner dan 3 mm; hoe kleiner de spots, hoe beter het resultaat te zien zal zijn) door niet te veel vloeistof in het capillair op te nemen. Men kan eventueel meerdere keren een kleine hoeveelheid mengsel op dezelfde plaats aanbrengen. Wees ook voorzichtig met het capillair om de silicagel laag niet te beschadigen. Gebruik een vers capillair voor elke oplossing of spoel het eerst grondig tlc 5
omdat resten van de ene oplossing ook vlekken zullen tonen in uw chromatogram. Optrekken van de mobiele fase Het optrekken van de mobiele fase wordt ook het ontwikkelen van een chromatogram genoemd. Tijdens dit proces gebeurt de eigenlijke scheiding van de bestanddelen van de opgebrachte mengsels. Wanneer het TLC plaatje in een recipiënt met solvent geplaatst wordt, zal door capillariteit het solvent optrekken in de stationaire fase en zullen de producten ofwel meegesleurd worden door de mobiele fase of eerder geadsorbeerd worden door de stationaire fase. Vul de ontwikkelkamer met het juiste solvent. Voor de ontwikkelkamers die in het practicum gebruikt worden, volstaan 20 ml solvent. Sluit de kamer en laat gedurende enekel minuten tot evenwicht komen. Om repoduceerbaar te kunnen werken moet de tank immers verzadigd zijn met solvent. Open de kamer en zet vervolgens het chromatografieplaatje verticaal in de ontwikkelkamer. Laat met de achterkant rusten tegen de zijwand van de kamer. Zet het deksel terug op de kamer en laat het solvent optrekken tot een tweetal centimeter van de bovenrand van het TLC plaatje. Vergewis u ervan dat de startlijn zich niet beneden het vloeistofniveau bevindt. In dit geval zal al uw product oplossen in de mobiele fase en zal het experiment op niets uitdraaien. Figuur 7: Ontwikkelen van een TLC plaatje. Wanneer het solventfront tot ongeveer 1 cm van de bovenrand gekomen is, neemt men het plaatje uit de tank en duidt men met een potloodlijn de plaats aan tot waar het solvent gemigreerd heeft. Deze merklijn is van belang voor verdere berekeningen. Laat het solvent nooit tot helemaal boven optrekken. Figuur 7 toont de opstelling voor het nemen van een dunnelaagchromatogram. tlc 6
Visualiseren van de vlekken Afhankelijk van de eigenschappen van de te analyseren verbindingen kan men bgebruik maken van één of meerderen van volgende technieken om vlekken op een TLC plaatje zichtbaar te maken: gekleurde producten zijn zichtbaar door hun kleur zichtbaar maken onder UV licht reactie met I 2 in een I 2 kamer besproeien van het plaatje met specifieke kleurreagentia Wanneer de opgebrachte producten gekleurd zijn, kan men zonder meer hun positie op het TLC plaatje bepalen. Verbindingen met aromatische groepen (zoals een benzeenring) kunnen UV licht absorberen. TLC plaatjes worden vaak voorzien van een UV fluorescentie indicator. Dit is een verbinding die als eigenschap heeft UV licht om te zetten in zichtbaar licht (geelachtige kleur). Wanneer er zich op het TLC plaatje een vlek bevindt die UV licht kan absorberen, zal de fluorescentie indicator op die plaats niet oplichten en zal er dus een donkere vlek achterblijven (zie Figuur 8). UV licht zichtbaar licht donkere vlek TLC plaat (zijaanzicht) TLC plaat met UV absorberende stof Figuur 8: Visualiseren van vlekken op TLC met behulp van een fluorescentie indicator Niet alle stoffen absorberen UV licht. Sommige van die stoffen kan men zichtbaar maken door adsorptie met I 2. Jodium komt voor als donkere kristallijne schilfers waaruit langzaam I 2 dampen vrijkomen. Deze dampen kunnen adsorberen aan bepaalde functionele groepen. De verbindingen waaraan I 2 is geadsorbeerd kleuren dan geel tot bruin. Jodium dampen zijn echter niet zeer gezond bij indademing, vandaar dat in het laboratorium de I 2 kristallen geadsorbeerd werden op silicagel. Om nu een TLC plaatje te laten reageren met I 2 dampen steekt men het in een potje gevuld met silicagel en jodium. Laat enkele minuten reageren en haal het TLC plaatje er terug uit. Bekijk het in daglicht en duid de gele of bruine vlekken aan. Tenslotte kan men verbindingen op een TLC plaatje zichtbaar maken door besproeien met een reagens dat een specifieke kleur geeft met de producten. Een voorbeeld hiervan is ninhydrine dat vaak gebruikt wordt voor identificatie van proteïnen en peptiden. O OH OH O ninhydrine tlc 7
Om de zuiverheid van een opgebracht staal te controleren zal men kijken of er in een bepaalde baan al dan niet slechts1 vlek aanwezig is. Is dit niet het geval, betekent het dat men te maken had met een mengsel. Om te oordelen over de aard van een verbinding die zich in een vlek bevindt, moet men kijken naar de afstand die deze verbinding heeft afgelegd op het TLC plaatje. R f waarden De positie van een vlek op een chromatogram is onder andere afhankelijk van de aard van de verbinding die zich in die vlek bevindt. Men kan de positie van iedere vlek uitdrukken als de fractie die deze verbinding heeft gemigreerd in verhouding tot de afstand afgelegd door het solventfront. Men geeft aan deze waarde de naam R f ofwel ratio-tofront. Rf = afstand afgelegd door het product afstand afgelegd door het solventfront Deze waarde kan voor iedere vlek op het chromatogram berekend worden. Wanneer twee vlekken zich op dezelfde hoogte op een TLC plaatje bevinden (of dus dezelfde R f waarde hebben), kan men besluiten dat het om dezelfde verbinding gaat. 1 2 3 d X X X a b c R f voor product 1 = a/d R f voor product 2 = b/d R f voor product 3 = c/d Figuur 9: Berekening van R f waarden Om R f waarden uit verschillende experimenten te vergelijken, moet men de chromatogrammen die in exact dezelfde omstandigheden werden uitgevoerd. Dit betekent: dezelfde stationaire fase, mobiele fase, temperatuur. Net zoals het feit dat meerdere organische verbindingen dezelfde kleur of smeltpunt kunnen bezitten, kan het natuurlijk ook zijn dat meerdere verbindingen dezelfde R f waarde kunnen hebben. Daarom is het vaak nodig om nog bijkomende testen uit te voeren om een product tlc 8
eenduidig te karakteriseren. Figuur 9 toont een voorbeeld van een TLC plaatje en hoe de R f waarden berekend kunnen worden. Wat kan er (nu nog) verkeerd gaan? Spots mogen niet te groot zijn anders kan men de vlekken na optrekken niet meer uit elkaar onderscheiden. Wanneer de oplossingen te verdund zijn zal men niets zien. Een goede tip is om na het spotten het TLC plaatje eens onder UV licht te bekijken of er inderdaad spots te zien zijn op de startlijn. Indien nodig, meerdere malen spotten of de oplossingen meer geconcentreerd maken. Indien het niveau van het solvent in de ontwikkelkamer hoger ligt dan de startlijn, zullen de producten oplossen in de loopvloeistof en uit het TLC plaatje migreren. Zorg er dus steeds voor dat het niveau in de ontwikkelkamer lager ligt dan de startlijn. Voor de ontwikkelkamers gebruikt in het practicum volstaan 20 ml solvent. Indien de vlekken niet optrekken of helemaal bovenaan het plaatje liggen betekent dit dat de polariteit van het solvent niet goed gekozen is. In dit geval moet de polariteit aangepast worden hetzij door een ander solvent of door een andere solventsamenstelling te kiezen. Het kan echter ook gebeuren dat het solvent gecontamineerd was (door bijvoorbeeld slecht uitspoelen van de chromatografietank). Hierbij geldt (voor TLC op silicagel platen) dat contaminatie door een meer polair solvent meer effect heeft dan contaminatie door een solvent met lagere polariteit. Indien men zelf naar een solvent moet zoeken, is het raadzaam te beginnen met een apolair solvent om dan over te gaan naar een meer polair solvent tot de gewenste scheiding en R f waarden bereikt worden. tlc 9