APPENDICES Nederlandse samenvatting Curriculum Vitae "In the depths of winter I finally learned there was in me an invincible summer." - Albert Camus, 1913-1960 255
Nederlandse samenvatting Samenvatting In dit proefschrift wordt de klinische toepassing beschreven van ex-vivo geëxpandeerde, humane mesenchymale stromale cellen (MSCs) afkomstig uit beenmerg, in de context van allogene beenmergtransplantatie bij kinderen. Daarnaast worden ook de bevindingen van laboratorium onderzoek besproken. Ontwikkelingen op het gebied van de moderne transplantatie technologie hebben het gebruik van alternatieve stamcelbronnen mogelijk gemaakt, zoals perifere-bloed stamcellen (PBSCs) afkomstig van haploidentieke donoren en stamcellen uit navelstrengbloed (UCB). De resultaten van allogene haematopoietische stamceltransplantaties (HSCT) waarbij van deze nieuwe stamcelbronnen gebruik wordt gemaakt zijn echter nog niet optimaal. Naast een traag herstel van de afweer wordt de uitkomst mede beperkt door onvoldoende werkend beenmerg (graft failure), transplantaat afstoting en door Graft versus host ziekte, vooral wanneer de standaardtherapie met corticosteroiden faalt. MSCs vormen een matrix in het beenmerg, een stromaal netwerk, dat essentieel is voor de ondersteuning van de normale groei en ontwikkeling van haematopoietische stamcellen. Klinisch gebruik van MSCs is mogelijk geworden dank zij het ter beschikking komen van methoden om MSCs te expanderen in het laboratorium. Van ex-vivo geëxpandeerde MSCs is recent aangetoond dat ze mogelijk hypo-immuun zijn, omdat ze geen MHC klasse II antigenen of de co-stimulatoire moleculen tot expressie brengen en omdat ze geen T-cel activatie induceren in een gemengde lymfocytenreactie (MLR). Met behulp van in vitro experimenten is een breed scala aan interacties tussen MSCs en diverse andere celpopulaties, die betrokken zijn in de (regulatie van) de immuun respons, aangetoond. In de meeste gevallen resulteren deze interacties in een (in-vitro) ontstekingsremmend effect. De 256
achterliggende mechanismen, zeker wanneer het gaat over in-vivo effecten, zijn nog grotendeels onbekend, maar het is waarschijnlijk dat soluble factors een belangrijke rol spelen. Het vermogen van MSCs om het aanslaan van het transplantaat (engraftment) onder bepaalde omstandigheden te bevorderen in combinatie met hun anti-inflammatoire werking maakt ze een interessante celpopulatie voor verder onderzoek in de setting van haploidentieke- en navelstrenbloed HSCT. In dit proefschrift wordt, op basis van de kennis van eigenschappen van MSCs, onderzocht op welke wijze MSC s kunnen bijdragen aan een innovatieve oplossing voor de eerder genoemde problemen. Hoofdstuk 2 beschrijft de uitkomst van transplantatie met CD34+ verrijkte haploidentieke perifere-bloed stamcellen bij kinderen. Er was weinig gepubliceerde informatie beschikbaar over de uitkomst van haploidentieke transplantatie m.b.t. transplantatie gerelateerde mortaliteit (TRM), inclusief die tengevolge van transplantaat falen, de frequentie van graft verus host ziekte en ziektevrije overleving. In een retrospectieve analyse in ons eigen centrum toonden wij aan, dat haploidentieke stamceltransplantatie een haalbare optie is voor die kinderen die een HSCT nodig hebben, maar waarbij geen HLA compatibele verwante of onverwante donor beschikbaar is. Vertraagd herstel van de afweer, afstoting van het transplantaat en infectie vormen belangrijke complicaties, die zich echter niet beperken tot deze vorm van transplantatie. In ons onderzoek werd het risico op transplantaat afstoting niet verminderd door het transplanteren van hoge doses CD34+ geselecteerde cellen. Van MSCs is beschreven dat zij het haematologisch herstel bij volwassenen die een allogene beenmergtransplantatie ondergingen kunnen versnellen; hun mogelijke betekenis bij het voorkomen of corrigeren van transplantaatfalen bij de haploidentieke transplantatie was echter 257
onbekend. Op grond van deze observatie werd besloten de mogelijke rol van MSCs bij het corrigeren van afstoting van het transplantaat bij haploidentieke transplantatie te onderzoeken. Hiertoe werd een Fase I/II klinisch onderzoek opgezet onder auspiciën van de Developmental Committee van de European Group for Blood and Marrow Transplantation (EBMT). Hierin werd het effect van co-transplantatie van haploidentieke, uit het beenmerg verkregen, ex-vivo geëxpandeerde MSCs met haploidentieke, en G-CSF gemobiliseerde perifeer bloed stamcellen onderzocht. Hoofdstuk 3 beschrijft de resultaten van een onderzoek naar de haalbaarheid en de veiligheid van infusie van MSCs als onderdeel van de haplo-identieke, perifere bloed stamcel transplantatie. Dertien kinderen afkomstig uit de transplantatiecentra van Pavia en Leiden werden in de studie betrokken en vergeleken met 52 historische controles uit deze centra. Falen van het transplantaat trad op bij 11/52 (20%) patiënten in de controle groep en bij 0/13 (0%) van de kinderen in de onderzoeksgroep die MSCs ontving (p=0,06). Het herstel van lymfocyten was versneld in de onderzoeksgroep vergeleken met de controles (p=0,005), door een toegenomen aantal NK cellen, aantoonbaar vanaf de eerste maand na transplantatie. Acute GvHD kwam minder vaak voor in de onderzoeksgroep maar dit verschil was niet statistisch significant. Wij concludeerden dat co-transplantatie van haplo-identieke MSCs veilig en uitvoerbaar was binnen deze toepassing en niet gepaard ging met een verhoogd risico op infectie of recidief van de oorspronkelijke ziekte. In Hoofdstuk 4 beschrijven we de uitkomsten van een Fase I/II onderzoek uitgevoerd bij kinderen die een transplantatie ondergingen met stamcellen verkregen uit onverwant navelstrengbloed (UCBT). Het is bekend dat UCBT gepaard gaat met een vertraagd haematopoietisch en immunologisch herstel, mogelijk als gevolg van het beperkte aantal CD34+ cellen dat aanwezig is een navelstrengbloed transplantaat i.v.m. een 258
beenmergtransplantaat. Dier experimenteel onderzoek laat zien dat MSCs verkregen uit foetaal longweefsel het haematopoietisch herstel na UCBT kunnen versnellen. Wij overwogen dat onze ervaring met haploidentieke PBSC en MSC co-transplantatie een verder onderzoek rechtvaardigde naar toepassing van MSC bij kinderen die UCBT ondergingen. Kinderen die een UCBT voor een maligne aandoening ondergingen (n=13) waren afkomstig uit 3 behandelingscentra (Pavia, Leiden en Stockholm). Deze werden behandeld met haploidentieke MSCs afkomstig uit het beenmerg van een van de ouders. Dit studiecohort werd vergeleken met 39 gematchde, historische controles. Hoewel er geen verschillen in haematologisch herstel werden waargenomen tussen de groepen, was de behoefte aan additionele behandeling met Granulocyte Colony-Stimulating Factor (G-CSF) in de studiegroep minder dan in de controlegroep (23% vergeleken met 69%; p<=0,05). Er was geen verschil tussen de beide groepen in de overall incidentie van acute GvHD, maar de incidentie van ernstige (graad III-IV) acute HVGD was significant lager in de studiegroep (0% versus 26%). Hoewel de overleving over de gehele behandelde groep niet significant verbeterd werd door de toevoeging van MSCs aan het transplantaat, was de vroege, transplantatie gerelateerde sterfte, mogelijk door het voorkomen van ernstige fatale GvHD, wel verlaagd. In een muis transplantatie model is gevonden dat cotransplantatie van MSC s en HSC s die van dezelfde allogene donor afkomstig zijn, kan leiden tot transplantaatafstoting door het induceren van een allogene anti-donor immunrespons. In Hoofdstuk 5 wordt de uitkomst beschreven van 2 kinderen die UCBT ondergingen in combinatie met cotransplantatie van haploidetieke MSC s afkomstig van de vader. In beide gevallen trad transplantaatafstoting op waarna een succesvolle retransplantatie werd gedaan met haploidentieke MSCs en PBSCs van hun vader. Ondanks de blootstelling aan, van de vader 259
verkregen MSCs bij de eerste transplantatie, maakten zij geen specifieke immuunrespons tegen vaderlijke antigenen, wat suggereert dat cotransplantatie van allogene MSC s bij immuungecompromitteerde transplantatie patiënten niet noodzakelijk leidt tot afstoting. In Hoofdstuk 6 wordt een evaluatie en samenvatting gepresenteerd van de huidige kennis op het gebied van de pathofysiologie van de acute Graft versus Host Ziekte (GvHD). Dit hoofdstuk beschrijft gedetailleerd de complexe interacties tussen donor en recipiënt die tot het klinische syndroom van de acute GvHD leiden. Dit begrip van de pathofysiologie ondersteunt het opzetten van een Fase I/II, multicentre onderzoek naar het effect van MSC behandeling bij patienten met GVHD die refractoir zijn voor de conventionele behandelingen met steroïden. In Hoofdstuk 7 wordt de uitkomst beschreven van een Fase II onderzoek naar het gebruik van MSCs bij patiënten (zowel kinderen als volwassenen) met ernstige, graad II-IV, steroïd- refractaire acute GvHD. De 55 patiënten waren afkomstig uit 5 centra (Stockholm, Leiden, Pavia, Genua en Adelaide) en omvatte 30 volwassenen en 25 kinderen. Voor behandeling met MSCs, hadden de meeste patiënten (60%) reeds een 2e lijn behandeling ontvangen, 25% al een 3 e lijn behandeling en bij 10% van de patiënten waren al meer als 3 verschillende behandelingsmodaliteiten toegepast. Bij zeventig (Lynne, je moet consistent zijn in het noemen van getallen, zeventig of 70) procent van de geincludeerde patienten trad een partiele (PR) of complete respons (CR) op na MSC behandeling. Bij kinderen was dit 80%, tegen 60% bij volwassen patienten. Dit verschil tussen kinderen en volwassenen was echter niet statistisch significant. De geschatte twee jaars overlevingskans was 35% voor de gehele studiegroep, 26% voor volwassenen en 45% voor kinderen (p=0,06). De geschatte twee jaars overlevingskans voor patienten die een complete respons vertoonden op MSC behandeling was significant beter dan voor 260
patienten die geen complete response hadden (52% tegen 16%, p=0.018). Wij concludeerden dat behandeling met MSCs verkregen vanuit beenmerg zowel veilig als effectief kan zijn voor patiënten met ernstige, acute GvHD die niet reageren op corticosteroïden en andere vormen van immuunsuppresieve therapie. De samenwerkende centra gebruikten bij het onderzoek eenzelfde protocol voor de expansie van de MSCs. Omdat er hierbij geen verschillen optraden in de uitkomsten van behandeling tussen de centra, concludeerden we tevens dat het gebruik van een gezamenlijk protocol tot reproduceerbare bevindingen had geleid. De resultaten van dit onderzoek hebben nu geleid tot een gerandomiseerd, multicenter onderzoek naar de effectiviteit van infusie van MSCs bij de behandeling van steroid refractaire GvHD. Hoofdstuk 8 beschrijft de uitkomst van één van de kinderen uit de voorgaande studie en belicht daarbij de noodzaak voor een lange termijn follow-up bij patiënten uit dit cohort. Hoewel de mogelijkheden van weefselreparatie door MSC behandeling door sommige auteurs wel wordt gesuggereerd, beschrijven wij hier een kind dat succesvol behandeld werd met MSC infusie wegens steroïd refractaire GvHD, waarbij de mucosa beschadigingen als gevolg van gastrointestinale GvHD, irreversibel leken. Dit heeft geleid tot de initiatie van een klinisch en fysiologisch onderzoek bij kinderen die ernstige GvHD hebben overleefd. MSCs hebben brede immuunsuppressieve effecten in vitro. Het is echter niet bekend of er wel of niet een verschil bestaat tussen de effecten van MSCs op allo-reactieve T-cellen en op de T-cellen betrokken bij een virus-specifieke T- cel respons. Hoofdstuk 9 beschrijft de resultaten van samenwerking tussen Leiden en het Great Ormond Street Hospital in Londen betreffende in-vitro onderzoek naar de interacties van MSCs met T-cellen die specifiek gericht zijn tegen verschillende virussen, namelijk Cytomegalovirus (CMV) en Epstein-Barr Viris 261
(EBV). Allo-reactieve T-cellen bleken hierbij in-vitro gevoelig voor onderdukking door MSCs, in tegenstelling tot virus-specifieke T-cellen. Kinderen met ernstige acute GvHD die behandeld worden met hoge dosis steroïden kunnen daarbij (en bij hun GvHD) alsnog virus re-activatie ontwikkelen. Deze patiënten zouden daarom tegelijkertijd kunnen worden behandeld met MSCs vanwege ernstige GvHD en met virus-specifieke T- cellen vanwege virus-reactivatie, zonder dat het antivirale effect van de Tcellen wordt onderdrukt door MSC s. Als laatste bevat Hoofdstuk 10 de algehele samenvatting en discussie van de bevindingen uit dit proefschrift en in Hoofdstuk 11 worden de toekomstige mogelijkheden tot onderzoek van het gebruik van MSCs bij ziekten op de kinderleeftijd besproken. 262
263