Celtesten voor de risicobeoordeling van giftige stoffen in water Sander van der Linden Biodetection Systems
Waarom biologische testen? Huidige monitoring strategie bijna volledig gebaseerd of chemische analyse Chemische analyse heeft bepaalde beperkingen Te veel stoffen om allemaal te meten Te weinig informatie beschikbaar of effecten van individuele stoffen Houdt geen rekening met mengseleffecten Houdt bijna tot geen rekening met afbraakproducten Behoefte aan aanvullende informatie omtrent aanwezigheid van schadelijke stoffen
Chemisch versus biologisch?
Toxiciteits testen Detectie van effecten in plaats van individuele stoffen of structuren Niet-gereguleerde stoffen Afbraakproducten Mengsels Testen kunnen generiek zijn of specifiek Generieke testen geven totaal toxiciteit, maar reden van toxiciteit (mechanisme) is slecht gedefinieerd (vaak in vivo) Specifieke testen richten zich op enkele effecten, maar mechanisme is goed gedefinieerd (vaak in vitro) Genomic tools voor screenen activiteit meerdere genen
Adverse outcome pathway Initiërende effecten op moleculair niveau kunnen leiden tot ongewenste effecten op organisme- en populatieniveau Ankley et al (2008) Environ Toxicol Chem 29(3): 730-741
Effecten mengsels Individuele stoffen Gemeten activiteit in bioassay Voorspelde activiteit op basis van Concentratie Additie
Holistische versus mechanistische analyse Monitoren activiteit diverse toxicologisch relevante mechanismen Wat wil je beschermen (humaan, ecologie)? Hoeveel assays heb je daarvoor nodig? Single organism toxicity testing Population decline External exposure Ecosystem integrity Toxicokintetics Toxicodynamics Organ response Organism response Population response Escher and Leusch (2012) Bioanalytical tools in water quality assessment
CALUX bioassay panel Eindpunt Mechanisme Actieve stoffen Assay Hormonaal Estrogene receptor (alpha) (xeno)hormonen, medicijnen, pesticiden, weekmakers ER (alpha) CALUX Androgene receptor (xeno)hormonen, medicijnen, pesticiden,? AR CALUX Progesteron receptor (xeno)hormonen,? PR CALUX Glucocorticoid receptor (xeno)hormonen, medicijnen,? GR CALUX Thyroid receptor (beta) (xeno)hormonen, medicijnen,? TRbeta CALUX RAR receptor (alpha) Retinoiden, medicijnen,? RAR CALUX Transcriptiefactoren Peroxisome proliferator receptor alpha Peroxisome proliferator receptor gamma Medicijnen,? Medicijnen, TBT,? PPARalpha CALUX PPARgamma CALUX Dioxine receptor PCBs, dioxines DR CALUX Dioxine receptor PAKs PAH CALUX Genotoxiciteit p53 pathway Nitro-PAKs, medicijnen, zware metalen,? P53 CALUX Oxidatieve stress Nrf2 pathway Zware metalen,? Nrf2 CALUX Algemene response Controle specificiteit response overige assays Control CALUX
CALUX panel watermonsters
High throughput aanpak Meer en kleinere wells (384), meer gegevens van zelfde extract Efficient gebruik extract Snellere analyse (>200 extracten per week op 4 assays)
Alternatieve aanpak Huidige in vitro assays Gevoelig, specifiek, snel (?) Maar ook één voor één (weliswaar parallel) -> hoeveel mechanismen is genoeg? elke assay heeft extract nodig -> wanneer limiterend? Is het mogelijk om meerdere effecten tegelijkertijd meten met microarrays? Totale toxiciteit als in holistische aanpak Mechanistische informatie van assay aanpak Op basis van één extract
Dus van... Eén assay per plaat...... >20.000 assays per plaat
Voorwaarden screenen met microarrays Op basis van in vitro celkweek Onbeperkt beschikbaar Ethisch verantwoord Reproduceerbaar Controleerbaar Retrospectief onderzoek mogelijk Additionele experimenten mogelijk Additionele testen los te interpreteren Weinig tot geen storende effecten Cel nodig die reageert op veel verschillende (groepen) stoffen
Experimentele set-up Seeding of T47D cells (in hormone stripped culture medium) Control (DMSO) Pure compounds Water extracts 24 hours.. Exposure 16 hours. Exposed T47D cells.. Total RNA isolation.. Quantification of gene expression (relative to DMSO)
Microarray resultaten watermonsters Vaak goede voorspelling Slechts kwalitatieve uitspraak mogelijk Storende interactie tussen effecten
Gebruik bioassays Mechanistische assays goed bruikbaar voor bepaalde aspecten waterkwaliteit specifiek kwantitatief nieuwe effecten gevonden in de toekomst assay gebaseerde kwaliteitscriteria? rol naast chemische analyse! Microarray analyse kwalitatief geschikt voor mechanisme bepalen pure stoffen gevoelig voor storende interacties patroon afhankelijk van verdunningsfactor (nog) niet geschikt als standaard screeningstool