Laboratoriumdiagnostiek van parasieten in faecesop basis van microscopie en antigentesten THOMAS MAENHOUT
LABORATORIUMDIAGNOSTIEK INLEIDING Microscopie Direct of na concentratietechniek Specifieke kleuringen Immuno-gebaseerde testen ELISA Rapid antigen test PCR-gebaseerde technieken Real-time qpcr Multiplex voor heel veel darmpathogenen
OVERZICHT LABORATORIUMTECHNISCH Microscopie Antigen testen in faeces ORGANISATIE VAN HET LABORATORIUM Workflow GERICHT AANVRAGEN Optimalisatie aanvraagprofiel
Gastro-intestinale parasieten Protozoa Amoeben Flagellaten Coccidiën Microsporidia Blastocystis hominis Wormen Cestoda Trematoda Nematoda
Darmprotozoa: Pathogenen Amoeben Entamoeba histolytica/dispar Blastocystis hominis Entamoeba histolytica 50 milmensen per jaar geïnfecteerd In België/Nederland: 10-tallen per jaar Endemisch in tropen en subtropen (Afrika & Azië) Amoebendysenterie tot invasieve amoebiasis! Flagellaten Giardia lamblia Dientamoeba fragilis Microsporidia Coccidiën Cryptosporidium spp. Cyclospora spp. Isospora belli Bron: http://www.parasitologie.nl
LABORATORIUMTECHNISCH Entamoeba histolytica Macroscopisch Bloederig/slijmerig Microscopie Onderzoek naar trofozoïeten: Op zeer verse of vers (SAF-)gefixeerde faeces(sterven snel af) Aanwezigheid van veel erythrocyten (+ hematofage amoebe ZELDZAAM) Karakteristieke beweging met pseudopodiën in vers staal Permanente kleuringen: Chlorazol Black, Iron Haematoxylin Kinyoun 20-40 µm
LABORATORIUMTECHNISCH Entamoeba histolytica Microscopie Onderzoek naar cysten (chronische stadia): Ongekleurd of na Dobell O Connor Iodine kleuring Belangrijk onderscheid te maken met apathogene species: Entamoeba hartmanii, coli, polecki en dispar(+ Endolimax nana, etc ) Meest betrouwbaar om verschillende species te onderscheiden Onderscheid op basis van grootte en aantal kernen
LABORATORIUMTECHNISCH Entamoeba histolytica Antigentesten TECHLAB ENTAMOEBA II ELISA Remel PROSPECT RIDASCREEN ENTAMOEBA
LABORATORIUMTECHNISCH Entamoeba histolytica Busset al2008: RIDASCREEN ENTAMOEBA ELISA TECHLAB ENTAMOEBA II ELISA N = 110 50/53 E. histolytica 34/53 E. histolytica Discrepanties: 28 positief met beide testen 57 negatief met beide testen 6 Ridascreen+/Techlab-: 3x E. histolytica, 2x E. dispar& 1x negatief op PCR 22 Techlab+/Ridascreen-: 22x E. histolytica bevestigd met PCR
LABORATORIUMTECHNISCH Entamoeba histolytica TECHLAB = Entamoeba histolytica specifieke test!! Capture ELISA Target: galactoseor N-acetyl-D-galactosamine-binding lectin adhesin Polyklonaleantilichamen tegen het adhesinezitten gecoat op de well (adhesinis gelijkaardig tussen E. dispar/histolytica TECHLAB ENTAMOEBA II ELISA Het conjugaatbevat monoklonale antilichamen specifiek gericht tegen adhesin E. histolytica Bron: Techlab package insert
LABORATORIUMTECHNISCH Entamoeba histolytica Sensitiviteit NIET beter dan microscopie! TECHLAB ENTAMOEBA II ELISA Sensitiviteit = 79% Specificiteit voor E. histolytica = 96% Goninet al. 2003 Roy et al. 2005
LABORATORIUMTECHNISCH Entamoeba histolytica TECHLAB ENTAMOEBA QUIK CHECK Gebruikt zelfde monoklonalecaptureal als Techlab Entamoeba II ELISA
LABORATORIUMTECHNISCH Samenvatting performantie immunoassays/sneltesten Sensitiviteit Specificiteit Techlab Entamoeba II Quik Check Entamoeba ProspecT ELISA Enige E. histolytica specifieke Ag-test Vaak positief bij E. disparmist geen E. histolytica R-Biopharm Ridascreen
Darmprotozoa: Pathogenen Amoeben Entamoeba histolytica/dispar Blastocystis hominis Giardia lamblia Cosmopolitischeverspreiding + (sub)tropen Meest voorkomende ziekmakende parasiet Endemisch vooral bij jonge kinderen (kinderdagverblijf!) Seizoensgebonden Chronische verloop Flagellaten Giardia lamblia Dientamoeba fragilis Microsporidia Coccidiën Cryptosporidium spp. Cyclospora spp. Isospora belli Bron: http://www.parasitologie.nl
LABORATORIUMTECHNISCH Giardia lamblia Macroscopisch Bleke en vettige stoelgang bij malabsorptie Microscopie Onderzoek naar trofozoïeten: Vooral in dunne ontlasting, duodenaal vocht Op zeer verse of onmiddellijk (SAF-)gefixeerde faeces Typisch morfologie (peervorm, zuignap, flagellen, 2 kernen) Onderzoek naar cysten: Vaak in grote getale, echter onregelmatige uitscheiding! Concentratie (formol-ether) zeer efficiënt
Darmprotozoa: Pathogenen Amoeben Entamoeba histolytica/dispar Blastocystis hominis Cryptosporidium spp. Belangrijk importpathogeen In Nederland en België ook endemisch voorkomend Belangrijke pathogeen bij immuundeficiëntie (AIDS) Seizoensgebonden Waterige diarree (niet zelflimiterend bij immuundef.) Flagellaten Giardia lamblia Dientamoeba fragilis Microsporidia Coccidiën Cryptosporidium spp. Cyclospora spp. Isospora belli Bron: http://www.parasitologie.nl
LABORATORIUMTECHNISCH Cryptosporidium parvum/hominis Macroscopisch Waterdunne diarree Microscopie Onderzoek naar oöcysten: Concentratie zeer efficiënt Zéér klein (3-5 µm gemiddeld) Zonder additionele kleuring moeilijk te onderscheiden Zuurvaste of safranine-kleuring noodzakelijk voor sensitief en specifiek onderzoek
LABORATORIUMTECHNISCH Giardia lamblia & Cryptosporidium spp. Antigentesten
LABORATORIUMTECHNISCH Giardia lamblia & Cryptosporidium spp. Evaluatie AZ Delta Roeselare Kleine validatiestudie Prospectief op 27 routine stalen CRYPTO GIARDIA Microscopie Microscopie Pos Neg Pos Neg Coris Pos 2 1 2 3 Neg 3 21 1 21 Techlab Pos 5 0 3 1 Neg 0 22 0 23 Rida Quick Pos 5 0 1 1 Neg 0 2 0 5 Retrospectief op 12 ingevroren stalen Microscopie Microscopie Pos Neg Pos Neg Coris Pos 1 0 4 0 Neg 3 8 4 4 Techlab Pos 4 0 8 0 Neg 0 8 0 4 Rida Quick Pos 3 0 8 0 Neg 1 8 0 4
LABORATORIUMTECHNISCH Giardia lamblia Test Compared to n Spec Sens Reference Microscopy(IFA) 791 1,00 0,99 Cacciola et al (poster ASTMH) Microscopy 100 0,99 1,00 Van Meensel et al (poster techlab) 200 0,99 0,93 Alexander et al. (Parasitology international 2013) TECHLABQuik 30 1,00 1,00 Van den Bossche et al. (Poster) Check Commercial ELISA 849 0,99 0,99 Producer 307 1,00 1,00 Haque et al. (poster Techlab) ELISA and PCR 117 1,00 0,94 Minak et al. (J Clin Microbiol 2012) PCR 18 1,00 0,78 Minak et al. (J Clin Microbiol 2012) Microscopy/PCR 31 1,00 0,93 Van den Bossche et al. (Poster) MERIDIAN Immunocard STAT THERMO-SCIENTFIC Xpect R-BIOPHARM Rida Quick CORIS Microscopy(IFA) 246 0,99 0,81 Johnston et al. (J Clin Microbiol 2003) Microscopy 45 1,00 0,89 van Dommelen et al (poster) Microscopy 30 1,00 0,83 Van den Bossche et al. (Poster) ELISA and PCR 117 0,94 0,94 Minak et al. (J Clin Microbiol 2012) Composite reference 148 1,00 0,93 Elsafi et al. (Parasitol Res 2013) PCR 18 0,44 0,78 Minak et al. (J Clin Microbiol 2012) Microscopy/PCR 31 1,00 0,74 Van den Bossche et al. (Poster) Microscopy 45 0,96 0,89 van Dommelen et al (poster) ELISA and PCR 117 0,98 0,88 Minak et al. (J Clin Microbiol 2012) PCR 18 0,78 0,56 Minak et al. (J Clin Microbiol 2012) Microscopy 160 0,95 0,73 Goni et al. (Eur J Microbiol Infect,.2012) Microscopy 30 1,00 0,83 Van den Bossche et al. (Poster) Microscopy/PCR 31 1,00 0,78 Van den Bossche et al. (Poster) PCR 160 0,94 0,70 Goni et al. (Eur J Microbiol Infect, 2012) Microscopy 45 1,00 0,72 van Dommelen et al (poster) Microscopy 30 1,00 0,58 Van den Bossche et al. (Poster) Microscopy/PCR 31 1,00 0,61 Van den Bossche et al. (Poster)
LABORATORIUMTECHNISCH Cryptosporidium spp. Test Compared to n Spec Sens Reference TECHLABQuik Check MERIDIAN Immunocard STAT THERMO-SCIENTFIC Xpect R-BIOPHARM Rida Quick CORIS Microscopy(acid-fast stain) 791 0,99 1,00 Cacciola et al(poster ASTMH) 100 0,98 1,00 Van Meensel et al (poster techlab) 200 0,99 0,87 Alexander et al. (Parasitology international 2013) 30 1,00 1,00 Van den Bossche et al. (Poster) Commercial ELISA 307 1,00 1,00 Haque et al. (poster Techlab) ELISA and PCR 117 1,00 1,00 Minak et al. (J Clin Microbiol 2012) PCR 18 1,00 1,00 Minak et al. (J Clin Microbiol 2012) Microscopy(acid-fast stain)/pcr 31 1,00 1,00 Van den Bossche et al. (Poster) Microscopy(acid-fast stain) 246 0,99 0,68 Johnston et al. (J Clin Microbiol 2003) 45 1,00 0,25 van Dommelen et al. (poster) 30 1,00 1,00 Van den Bossche et al. (Poster) ELISA and PCR 117 0,97 1,00 Minak et al. (J Clin Microbiol 2012) Composite reference standard 148 0,99 0,95 Elsafi et al. (Parasitol Res 2013) PCR 18 0,50 1,00 Minak et al. (J Clin Microbiol 2012) Microscopy (acid-fast stain)/pcr 31 0,95 1,00 Van den Bossche et al. (Poster) Microscopy(acid-fast stain) 45 1,00 0,50 van Dommelen et al.(poster) ELISA and PCR 117 1,00 0,82 Minak et al. (J Clin Microbiol 2012) PCR 18 1,00 0,58 Minak et al. (J Clin Microbiol 2012) Microscopy(acid-fast stain) 160 0,99 0,97 Goni et al. (Eur J Microbiol Infect, 2012) 30 1,00 1,00 Van den Bossche et al. (Poster) Microscopy(acid-fast stain)/pcr 31 0,98 1,00 Van den Bossche et al. (Poster) PCR 160 0,99 0,91 Goni et al. (Eur J Microbiol Infect, 2012) Microscopy(acid-fast stain) 45 1,00 0,75 van Dommelen et al.(poster) 30 1,00 0,92 Van den Bossche et al. (Poster) Microscopy(acid-fast stain)/pcr 31 0,95 0,67 Van den Bossche et al. (Poster) PCR 505 0,98 0,78 Vastert et al. (Poster)
LABORATORIUMTECHNISCH Samenvatting performantie sneltesten Sensitiviteit Specificiteit Sensitiviteit Specificiteit Techlab Meridian Thermo-Scientific R-Biopharm Coris
Darmprotozoa: Pathogenen Amoeben Entamoeba histolytica/dispar Blastocystis hominis Dientamoeba fragilis Verspreiding heel variabel ( detectiemethode) Pathogeniciteit discutabel Grotere genetische variatie Voornamelijk kinderen Meestal asymptomatisch tot buikpijn & diarree Flagellaten Giardia lamblia Dientamoeba fragilis Microsporidia Coccidiën Cryptosporidium spp. Cyclospora spp. Isospora belli Bron: http://www.parasitologie.nl
LABORATORIUMTECHNISCH Dientamoeba fragilis Microscopie Onderzoek naar trofozoïeten(geen cysten!!): Op zeer verse of vers (SAF-)gefixeerde faeces(sterven af binnen 60 min) Trofozoïeten vaak twee-kernig Permanente kleuringen: Chlorazol Black, Iron Haematoxylin Kinyoun PCR? 3 18 µm
Darmprotozoa: Pathogenen Amoeben Entamoeba histolytica/dispar Blastocystis hominis Cyclosporacayetanensis& Isospora belli Importpathogenenuit (sub)tropen (Amerika+Azië) Epidemie Cyclosporadoor geïmporteerd besmet fruit Chronische diarree vaak zelf-limiterend Isosporainfectie ernstiger bij immuundeficiëntie Flagellaten Giardia lamblia Dientamoeba fragilis Microsporidia Coccidiën Cryptosporidium spp. Cyclospora spp. Isospora belli Bron: http://www.parasitologie.nl
LABORATORIUMTECHNISCH Cyclospora cayetanensis& Isospora belli Microscopie Onderzoek naar oöcysten: Zonder additionele kleuring moeilijker te onderscheiden Zuurvaste (ZN of auramine) kleuring noodzakelijk voor sensitief en specifiek onderzoek Auto-fluoresecentie Cyclospora cayetanensis Isospora belli
Darmprotozoa: Pathogenen Amoeben Entamoeba histolytica/dispar Blastocystis hominis Microsporodia Minstens 15 verschillende pathogene species Vaak opportunistische pathogenen(aids-ptn!) Komen wereldwijd voor Kliniek variabel, maar diarree meest voorkomend Flagellaten Giardia lamblia Dientamoeba fragilis Microsporidia Coccidiën Cryptosporidium spp. Cyclospora spp. Isospora belli Bron: http://www.parasitologie.nl
LABORATORIUMTECHNISCH Microsporidia(Enterocytozoon bieneusi) Microscopie Onderzoek naar oöcysten: Concentratie zeer nuttig Zéér klein (1-2 µm gemiddeld) contrast met bacteriën klein Screenen met fungifluor of optische witstof(uvitex 2B) Confirmatie met trichroom/giemsa kleuring of PCR
Darmprotozoa: Pathogenen Amoeben Entamoeba histolytica/dispar Blastocystis hominis Blastocystis hominis Cosmopolitische verspreiding Meest gevonden parasiet in stoelgang commensaal Pathogeniciteit discutabel Aanwezigheid in grote getale wijst op ontregelde darmflora Flagellaten Giardia lamblia Dientamoeba fragilis Microsporidia Coccidiën Cryptosporidium spp. Cyclospora spp. Isospora belli Bron: http://www.parasitologie.nl
LABORATORIUMTECHNISCH Blastocystis hominis Microscopie Onderzoek naar blastocysten: Op zeer verse of vers (SAF-)gefixeerde faeces soms zonder kleuring te zien Karakteristieke dubbelwandige begrenzing van het organisme Concentratiemethoden niet nuttig Permanente kleuringen: Chlorazol Black, Iron Haematoxylin Kinyoun 5 30 µm
OVERZICHT LABORATORIUMTECHNISCH Microscopie Antigen testen in faeces ORGANISATIE VAN HET LABORATORIUM Workflow GERICHT AANVRAGEN Optimalisatie aanvraagprofiel
ORGANISATIE LABORATORIUM Welke testen gebruiken? Sensitiviteit Screening Inheemse parasiet Kosten Specificiteit Confirmatie Reizigersdiarree Baten
ORGANISATIE LABORATORIUM Welke testen gebruiken? * Berekend uit data verzameld in 2013 in patiënten met chronische diarree Privélaboratorium Ziekenhuislaboratorium Referentielaboratorium Algemene populatie Screeningsfunctie Prevalentie-afhankelijk Algemene populatie Vaker immuundeficiëntie Prevalentie-afhankelijk Confirmatie Epidemiologie Esoterische testen Parasiet Aantal Prevalentie* Giardia lamblia 17 1,50% Cryptosporidium spp 20 1,72% Entamoeba coli 8 0,34% Entamoeba histolytica/dispar 0/8 0,34% Blastocystis hominis 6 0,52% Ascaris lumbricoïdes 2 0,09% Negatief 1125 96,52% TOTAAL 1165 Parasiet Aantal Prevalentie* Giardia lamblia 14 1,14% Cryptosporidium spp 12 1,06% Entamoeba coli 8 0,65% Entamoeba histolytica/dispar 0 0,00% Enterobius vermicularis 4 0,33% Taenia saginata 1 0,08% Negatief 1203 98,36% TOTAAL 1223
ORGANISATIE LABORATORIUM Welke testen gebruiken? Bayesiaanse statistiek Specificiteit en sensitiviteit: Sterk studie-afhankelijk Houden GEEN rekening met prevalentie van de aandoening Negatief en positief predictieve waarde Prevalentie-afhankelijk Nuttig voor aanvragende arts Kunnen berekend worden uit prevalentie, specificiteit en sensitiviteit
ORGANISATIE LABORATORIUM 1 Predictive values in Belgium Quik Check Giardia/Crypto/Entamoeba Ag test 0,9 0,8 0,7 Predictive value 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 PPV Quik Check Giardia NPV Quik Check Giardia PPV Quik Check Crypto NPV Quik Check Crypto PPV Entamoeba histolytica/dispar NPV Entamoeba histolytica/dispar 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1 Prevalence
ORGANISATIE LABORATORIUM 1 Predictive values in Belgium Quik Check Giardia/Crypto/Entamoeba Ag test NPV > 99.9% 0,9 0,8 Predictive value 0,7 0,6 0,5 0,4 PPV Crypto= 48.8% PPV Giardia = 64.2% 0,3 0,2 0,1 PPV Entamoeba= 23.6% PPV Quik Check Giardia NPV Quik Check Giardia PPV Quik Check Crypto NPV Quik Check Crypto PPV Entamoeba histolytica/dispar NPV Entamoeba histolytica/dispar 0 0 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06 0,07 0,08 0,09 0,1 Prevalence
ORGANISATIE LABORATORIUM NPV > 99.9% Hoge NPV in combinatie met hoge sensitiviteit Negatief resultaat kan je vertrouwen voor Giardia& Cryptosporidium Entamoeba PPV Giardia < 90 % PPV Crypto< 80 % Ag-test met hoge specificiteit, echter in laag prevalente populatie best confirmatie (microscopie blijft aangewezen*) *additionele microscopie belangrijk voor MLT competentie PPV Entamoeba < 30% PPV relatief laag (lage prevalentie) +onderscheid Entamoeba histolytica dispar niet mogelijk Pre-test probability(dus ook PPV) verhogen door relevante klinische info (bv. tropenreis)?
ORGANISATIE LABORATORIUM Wat met andere, zeldzamere parasieten? Bron: Ten Hove et al. 2009)
ORGANISATIE LABORATORIUM Welke testen gebruiken? Belang van KLINISCHE INFORMATIE Met antigen (of PCR) test sporen we minder prevalente parasieten NIET op Importpathogenen uit (sub-)tropen Worminfecties Opportunistische pathogenen Op basis van klinische informatie kan specifiek naar andere parasieten gezocht worden Nog steeds nood aan goed getrainde laboranten voor microscopie Informeren van de aanvragende arts omtrent gastro-intestinale parasieten als veroorzakers van chronische diarree Aansporen van de aanvragende arts tot verschaffen klinische informatie zodat gericht naar parasieten kan gespoord worden
ORGANISATIE LABORATORIUM Welke testen gebruiken? TRIPLE FAECES TEST Sensitiviteit verhogen?
ORGANISATIE LABORATORIUM Welke testen gebruiken? TRIPLE FAECES TEST PCR? Niet- pathogenen+++ Werklast+++
OVERZICHT LABORATORIUMTECHNISCH Microscopie Antigen testen in faeces ORGANISATIE VAN HET LABORATORIUM Workflow GERICHT AANVRAGEN Optimalisatie aanvraagprofiel
GERICHT AANVRAGEN Optimalisatie aanvraagprofiel
GERICHT AANVRAGEN Optimalisatie aanvraagprofiel
TAKE HOME MESSAGES Nieuwe antigentesten hebben hoge specificiteit Crypto/Giardia Vaak geen onderscheid mogelijk tussen E. histolytica/dispar Sensitiviteit is afhankelijk producent (Techlabsuperieur)! Kennis van microscopie mag niet verloren gaan voor die gevallen waar minder courante parasitaire infecties worden vermoed Afhankelijk van de bestudeerde populatie dient de antigentest vooralsnog geconfirmeerd te worden Met aangepast aanvraagprofiel kan men klinische informatie verkrijgen van de aanvragende arts om gericht te zoeken